Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Das übergeordnete Ziel dieser zweidimensionalen, halbdenaturierenden Agarose-Gelelektrophorese ist es, die Größenheterogenität von Amyloid oder Amyloid-ähnlichen Fasern zu bestätigen, die während der traditionellen SDD-AGE beobachtet wurde. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Amyloid- oder Proteinaggregation zu beantworten, z. B. ob die Größenheterogenität, die während der traditionellen SDD-AGE beobachtet wird, der native Zustand der Fasern in vivo oder das Ergebnis des Proteinabbaus oder der Dissoziation während der Gelelektrophorese ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ohne spezielle Ausrüstung problemlos im Labor durchgeführt werden kann.

Es ist keine zusätzliche Ausrüstung erforderlich, die über die in herkömmlichem SDD-AGE verwendete Ausrüstung hinausgeht. Zuerst säen Sie die Amyloid-produzierenden HT-29-Darmkrebszellen in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, verwenden Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, um die Zellen zu waschen. Geben Sie dann drei Milliliter Trypsin in die Zellen und inkubieren Sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem sich die Zellen von der Kulturschale gelöst haben, geben Sie 10 Milliliter Kulturmedium auf die Platte.

Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1.000 mal g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird das Medium aspiriert und das Zellpellet in fünf Millilitern Kulturmedium resuspendiert.

Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler. Lassen Sie dann zwei Kulturplatten über Nacht bei 37 Grad Celsius stehen. Geben Sie anschließend TSZ-Reagenzien zur Behandlung in eine der Kulturschalen.

Nach etwa sechs Stunden ernten Sie die Zellen mit einem Kunststoffschaber. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 1.000 g bei vier Grad Celsius. Waschen Sie dann das Zellpellet zweimal mit 10 Millilitern eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung und wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang.

Aspirieren Sie anschließend die PBS-Lösung und geben Sie das Zellpellet in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 0,3 Milliliter Lysepuffer zum Zellpellet und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Auch hier gilt: Zentrifugieren Sie bei 20.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Der erhaltene Überstand ist das Ganzzelllysat. Dem Überstand wird 4X SDD-AGE-Puffer zugesetzt, um 20 Mikroliter à drei Mikrogramm pro Mikroliter Probe herzustellen. Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Um das Gel herzustellen, geben Sie zwei Gramm Agarosepulver zu 200 Millilitern TAE-Puffer in ein Becherglas. Dann den Becher in der Mikrowelle erhitzen, um die Agarose zu schmelzen. Fügen Sie anschließend einen Milliliter 20 % SDS zu einer Endkonzentration von 0,1 % hinzu Schwenken Sie das Becherglas vorsichtig.

Gießen Sie anschließend die flüssige Agarose auf eine 15 x 14 Zentimeter große Gelplatte. Um Luftblasen zu entfernen, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette. Legen Sie dann einen 20-Well-Kamm auf das Gel.

Fügen Sie als Nächstes etwa 60 Mikrogramm Ganzzelllysat in die äußerste rechte Spur des Gels hinzu. Lassen Sie das Gel etwa vier Stunden lang bei 60 Volt laufen, wobei der TAE-Puffer mit 0,1 % SDS als Laufpuffer verwendet wird. Um das Gel in der zweiten Dimension laufen zu lassen, drehen Sie das Gel vorsichtig um 90 Grad gegen den Uhrzeigersinn.

Lassen Sie das Gel dann etwa vier Stunden lang bei 60 Volt laufen. In einen 20 x 20 Zentimeter großen Behälter 500 Milliliter Transferpuffer geben. Bereiten Sie direkt neben dem Behälter einen fünf Zentimeter hohen Stapel Papierhandtücher vor.

Tränken Sie dann zwei Filterpapiere mit den Maßen 14 x 15 Zentimeter in Transferpuffer und legen Sie sie auf den Papierhandtuchstapel. Aktivieren Sie eine 14 x 15 Zentimeter große PVDF-Membran 30 Sekunden lang in Methanol. Legen Sie die Membran nach der Aktivierung auf die Filterpapiere und entfernen Sie mit einer Walze alle Blasen.

Der wichtigste Teil des Transfers besteht darin, sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran bilden. Spülen Sie das Gel mit Transferpuffer ab und schichten Sie es auf die Membran. Eventuell gebildete Blasen ausrollen.

Verwenden Sie als Nächstes eine Plastikfolie, um den Rand der Papiertücher abzudecken, der dem Transferpufferbehälter am nächsten ist. Tränken Sie dann ein Stück Filterpapier mit den Maßen 15 x 35 Zentimeter im Transferpuffer. Legen Sie das Filterpapier so, dass ein Ende die Oberseite des Gels bedeckt und das andere Ende im Transferpufferbehälter liegt.

Decken Sie den Behälter mit Frischhaltefolie ab und lassen Sie ihn über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Spülen Sie die Membran am nächsten Tag mit 50 Millilitern PBST in einem 20 x 20 Zentimeter großen Behälter aus. Geben Sie anschließend 20 Milliliter 5%ige Milch in PBST auf die Membran.

Lassen Sie die Membran dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Wippe verblocken. Pipettieren Sie 10 Mikroliter Kaninchen-Anti-MLKL-Antikörper in 20 Milliliter 5%ige Milch in PBST. Geben Sie dann die Antikörpermischung auf die Membran.

Inkubieren Sie die Membran über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Wippe. Waschen Sie dann die Membran fünf Minuten lang mit 20 Millilitern PBST. Diese Wäsche wird fünfmal wiederholt.

Als nächstes pipettieren Sie vier Mikroliter Anti-Kaninchen-HRP-Antikörper auf 20 Milliliter 5%ige Milch in PBST. Geben Sie den Antikörper auf die Membran. Lassen Sie den Behälter mit der Membran auf der Wippe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur stehen.

Waschen Sie die Membran nach zwei Stunden fünfmal in 20 Millilitern PBST für jeweils fünf Minuten. Fügen Sie schließlich ein verbessertes Chemilumineszenzsubstrat auf die Membran hinzu. Setzen Sie dann die Membran gemäß den Anweisungen des Herstellers einem Röntgenfilm aus.

Diese Studie wird durchgeführt, um das Vorhandensein von SDS-resistenten Amyloid-ähnlichen Fasern in Ganzzelllysaten zu demonstrieren, die aus Tumornekrosefaktor-alpha-behandelten Zellen gewonnen wurden. Hier zeigt sich, dass RIPK1 und RIPK3 ähnliche identische Amyloid-ähnliche Muster aufweisen. Interessanterweise scheinen die MLKL-Fasern heterogen zu sein und ein anderes Migrationsmuster als die anderen zu haben.

Dieses Bild zeigt das mögliche Migrationsmuster von Amyloid oder Amyloid-ähnlichen Fasern. In der ersten Dimension SDD-AGE weisen Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern einen charakteristischen Abstrich auf. In diesem Bild wandern die Fasern im zweiten Durchlauf identisch und zeigen ein diagonales Migrationsmuster auf der Membran in einem Winkel von 45 Grad.

Dies zeigt, dass die Fasern während des Gleitprozesses nicht abgebaut oder dissoziiert werden. Im Gegenteil, wenn die Fasern dissoziieren, kommt es zu vertikalen Streifen unterhalb der diagonalen Linie, was auf eine schnellere Wanderung der kleineren Fasern während der zweiten Elektrophorese hinweist. Sowohl diese SDD-AGE-Fasern der ersten als auch der zweiten Dimension zeigen, dass die MLKL-Fasern während des SDD-AGE-Prozesses nicht dissoziieren und sich tatsächlich von den RIPK1- und RIPK3-Fasern unterscheiden.

In diesem Bild zeigen die MLKL-Fasern einen charakteristischen Abstrich während der ersten Dimension. Dieselben Fasern zeigen jedoch eine scharfe diagonale Linie ohne vertikale Schlieren in der zweiten Dimension SDD-AGE. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass alle Bedingungen, wie z. B. Spannung und Länge des Laufs, zwischen der ersten und zweiten Dimension gleich bleiben, um eine scharfe Linie in einem Winkel von 45 Grad zu gewährleisten.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie z. B. das Abstreifen der Membran und das erneute Sondieren mit anderen Antikörpern, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Faser andere Proteine enthält. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie bestätigen können, dass während der traditionellen SDD-AGE kein Abbau oder keine Dissoziation von Amyloid oder Amyloid-ähnlichen Fasern stattfindet.