Name: Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie die zweidimensionale semi-denaturierende Agarosegelelektrophorese zur Bestätigung der Größenheterogenität von Amyloidfasern. Diese Methode unterscheidet native Zustände von experimentellen Artefakten.

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Diese Arbeit wird unterstützt durch ein Stipendium für s.h.-A. von NIH/NCATS (TL1TR001104) ein Welch Foundation grant (I-1827) und einem R01 Stipendium NIGMS (RGM120502A), Z.W. Z.W. ist der Virginia Murchison Linthicum Gelehrte in medizinische Forschung und Prävention von Krebs und Research Institute of Texas Scholar (R1222).

1. Proben vorbereiten
<ol><li>Kultur 2 x 106 Amyloid Herstellung von HT-29 Darmkrebszellen in einer Gewebekultur 10 cm Schale in 10 mL von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum und Penicillin-Streptomycin. Zellkulturen über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2.<ol>
<li>Nachdem die Zellen zu 80 % Konfluenz wachsen, Waschen der Zellen mit 10 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). 3 mL Trypsin-Lösung hinzugeben und bei 37 ° C für 3 min inkubieren.</li>
		<li>Nachdem die Zellen aus der Schale vollständig dissoziiert sind, fügen Sie 10 mL Kulturmedium und übertragen Sie die Zellen mit einer 10 mL-Pipette auf eine 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Medium, Aufschwemmen der Zellen in 5 mL Kulturmedium und zählen Sie die Zellen, die Zelle Zähler. Platte 2 x 106 Zellen in jedem der zwei 10-cm-Gerichte.</li>
		<li>Lassen Sie die Zellen haften und über Nacht in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2zu erholen. Wenden Sie Behandlung auf ein Gericht induzieren die Bildung von amyloiden mit 20 ng/mL Tumor-Nekrose-Faktor-Alpha (TNF-α), 100 nM Smac-mimetischen und 20 µM Pan-Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK11 an. Die Kombination wird als ASZ abgekürzt. Die andere Schale mit Fahrzeug als ein Steuerelement zu behandeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach der entsprechenden Länge der Zeit in der Regel 6 h Ernte der Zelle lysate.<ol>
<li>Kratzen Sie die Zellen aus der Platte mit einem Plastikschaber und verwenden Sie eine 10-mL-Pipette in ein 15 mL konische Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.000 x g für 3 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 2 mal von resuspending in 10 mL Eis kaltem PBS und Zentrifugieren bei 1.000 x g für 3 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die PBS-Lösung. Hinweis: Der Prozess kann hier durch Einfrieren der Zelle Pellet in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei ˗80 ° C für bis zu 1 Monat angehalten werden.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zelle Pellet zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und inkubieren Sie in 0,3 mL Lyse-Puffer für 30 min auf Eis. Zentrifuge bei 20.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Der Überstand ist die ganze Zelle lysate. Hinweis: Der Prozess kann hier durch die Speicherung der Probe bei-20 ° C bis zu mehreren Monaten angehalten werden.</li>
		<li>Messen Sie die Proteinkonzentration von Bradford-Test laut Protokoll des Herstellers. Fügen Sie 4 x SDD-Alter laden Puffer 20 µL 3 µg/µL Probe vorbereiten und in 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bereiten Sie vor und führen Sie Gele aus
<ol><li>Fügen Sie 2 g Agarose, 200 mL 1 X Tris-Acetat-Puffer (TAE) in ein Becherglas und Hitze in der Mikrowelle zu schmelzen die Agarose. Fügen Sie 1 mL 20 % SDS für eine Endkonzentration von 0,1 % SDS. Schwenken Sie vorsichtig mischen. Achten Sie darauf, keine um Luftblasen nach der SDS-Zugabe zu generieren.</li>
	<li>Gießen Sie die Agarose-Lösung in eine Gel-Platte 15 x 14 cm. Verwenden Sie eine 1-mL-Pipette, um eventuell Luftblasen zu beseitigen. Legen Sie eine 20-Well-Kamm an der Spitze.</li>
	<li>Erste dimension: Pipette 60 µg ganze Zelle lysate auf der rechten Spur. Führen Sie das Gel bei 60 V für ca. 4 h (bis Farbstoff vorne ca. ¾ durch das Gel ist) mit der TAE mit 0,1 % SDS als der laufenden Puffer.</li>
	<li>Zweite dimension: Drehen Sie vorsichtig das Gel 90° gegen den Uhrzeigersinn (Abb. 2A). Führen Sie das Gel bei 60 V für ca. 4 h. Hinweis: Die laufenden Allgemeinzustand ist 4 V/cm Gel Länge. Es ist wichtig, dass die Betriebsbedingungen für die erste und zweite Abmessungen identisch sind.</li>
</ol>(3) Übertragung
<ol><li>Verwenden Sie die Kapillare Übertragungsmethode, um die Proteine auf einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran (Abbildung 2B) zu übertragen.<ol>
<li>Geben Sie 500 mL Übertragung Puffers, ein ca. 20 cm x 20 cm Container. Machen Sie einen 5 cm hohen Stapel Papier Handtücher neben dem Container. Die Fläche von oben auf den Stapel muss größer als die Gel-Dimensionen sein.</li>
		<li>Transfer-Puffer ein 14 cm x 15 cm-Filterpapier einziehen und oben auf dem Stapel Papier Handtuch legen. Achten Sie darauf, um auf dem Papier keine Falten oder Bläschen zu platzieren. Wiederholen Sie mit einem anderen Stück Filterpapier.</li>
		<li>Aktivieren eine 14 x 15 cm-PVDF-Membran in Methanol für 30 s Schicht es dann auf dem Filterpapier kümmert sich um eine Walze zu verwenden, um alle Luftblasen zu entfernen. Spülen Sie das Gel mit Transfer-Puffer und Schicht es oben auf der Membran, die Bläschen wieder Ausrollen.</li>
		<li>Decken Sie den Rand des am nächsten an den Container des Transfer-Puffer mit Plastikfolie Papierhandtücher. Es ist wichtig, dass die papierene Brücke gebaut im nächsten Schritt nicht in direkten Kontakt mit dem Papier-Handtuch-Stack kommt.</li>
		<li>Genießen Sie ein Stück Filterpapier 15 x 35 cm in Transfer-Puffer und legen Sie sie so einseitig die Oberseite des Gels bedeckt und das andere Ende im Container des Transfer-Puffer ist. Wiederholen Sie dies mit einer weiteren Brücke.</li>
		<li>Decken Sie den Container mit Plastikfolie und lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western Blot-Erkennung
<ol><li>Spülen Sie die Membran mit 50 mL PBS mit 0,05 % Tween-20 (PBST) in einem Container 20 × 20 cm. 20 mL 5 % Milch in PBST hinzugeben. Felsen bei Raumtemperatur für 30 min zu blockieren.</li>
	<li>Pipette 10 µL Kaninchen-Anti-MLKL-Antikörper in 20 mL 5 % Milch in PBST und füllen in den Behälter. Wippe über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie die Membran für 5 min. Wiederholen Sie 5 Mal in 20 mL PBST.</li>
	<li>Pipette 4 µL anti-rabbit-HRP 20 ml 5 % Milch in PBST und füllen in den Behälter. Wippe in 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran für 5 min. Wiederholen Sie 5 Mal in 20 mL PBST.</li>
	<li>Verstärkte Chemilumineszenz Substrat (ECL) hinzufügen und Röntgenfilme laut Protokoll des Herstellers setzen.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Der wichtigste Aspekt des 2D SDD-Zeitalters ist, dass die Elektrophorese-Bedingungen für die erste und zweite Dimension gleich sind. Die Fähigkeit zu erkennen, eine scharfe diagonale Linie auf 45° (d. h., die keine Dissoziation oder Verschlechterung eingetreten ist) hängt von der Fasern, die Migration in identischer Weise sowohl bei electrophoreses. Mit unterschiedlichen Bedingungen, zum Beispiel indem die Spannung oder die Länge der Laufzeit, werden diese Ergebnisse verdecken. Auch, wie bei traditionellen 1D der Fall is...

Die Bildung von Amyloid Fasern durch Protein misfolding ist seit langem bekannt in pathologischen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Huntington-Krankheit1eine Rolle spielen. In jüngerer Zeit, die Bildung von Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nachweislich die Signalwege bei Menschen, auch während der Anti-virale angeborene Immune Antwort2 und Necroptosis3,4, und bei niederen Organismen gehören z. B. Hefe5,6. Daher ist die Fähigkeit, diese Fasern im Labor erkennen wichtig. Derzeit gibt es drei Arten Amyloid und Amyloid-wie Fasern zu erkennen: die Verwendung von Farbstoffen, EM und SDD-Alter.
Die Verwendung von Farbstoffen, z. B. Kongo-rot oder Thioflavin T, bietet den Vorteil, schnell und leicht nachweisbar mit Mikroskopie oder Spektroskopie7. Erkennung von Mikroskopie, im Falle von Kongo-rot, bietet jedoch keine Besonderheit, welche Proteine die Fasern oder die Größe der Fasern bestehen. Ebenso bietet die Verwendung der Spektroskopie, Kongo-rot oder Thioflavin T Bindung an Proteinkomplexe erkennen nur ein positives oder negatives Ergebnis.
EM bietet schlüssige Beweise für die Anwesenheit von Fasern und auch quantitative Informationen über die Faser Länge und Durchmesser8. Diese Methode erfordert jedoch sehr strenge Reinigung. Darüber hinaus ist EM eine spezielle Technik, die teure Ausrüstung verwendet.
SDD-AGE wurde zur SDS-resistente Mega Dalton Proteinkomplexe einschließlich amyloide oder Amyloid-wie Fasern zu erkennen. Es bietet viele Vorteile. Erstens, es erfordert nicht die Reinigung der Fasern und ist leicht zu Peform9. Zweitens bietet es qualitative Informationen über die Größe der Fasern, einschließlich der relativen Größe und Menge der Faser Heterogenicity. Schließlich, weil westliche Beflecken nach Elektrophorese durchgeführt werden kann, ist es einfach, das Vorhandensein von jedem, das Protein für die ist ein Antikörper erkennen, obwohl anzumerken ist, dass da SDD-Alter Semi-denaturierenden ist, einige Epitope verdeckt die verbleiben können Erkennung erschwert von Antikörpern.
Vor kurzem, Rezeptor Interaktion Proteinkinase 1 (RIPK1) und 3 (RIPK3) gemeldet wurden, Form Amyloid Fasern dienen als Signalisierung Plattformen während der Necroptosis, eine programmierte Form der Nekrose3. Während des Studiums diese Fasern, zeigte unserem Labor, dass ein anderes Necroptosis-assoziierten Protein, gemischte Abstammung Kinase-Domäne-wie (MLKL), auch Amyloid-wie Fasern4gebildet. Allerdings erschien bei Betrachtung mit dem SDD-Alter, die Größe der MLKL Fasern unterscheidet sich von der RIPK1 und RIPK3 Fasern, die identisch zueinander (Abbildung 1) erschienen. Das war unerwartet, da es bekannt ist, dass MLKL an RIPK1/RIPK3 bindet bilden die Necroptosis Signalisierung Komplex namens Necrosome10.
Es gibt mindestens zwei Erklärungen. Zunächst zwei völlig unterschiedliche Amyloid-wie Fasern können während der Necroptosis, ein mit RIPK1/RIPK3 und die andere mit MLKL bilden. Zweitens ist nur eine Art von Amyloid-wie Fasern, die mit RIPK1/RIPK3/MLKL bei Necroptosis, sondern die Vereinigung des MLKL mit anderen Proteinen entstehen kann schwach genug, die es während der SDD-Alter distanziert.
Um dieses Problem anzugehen, schlagen wir eine zweidimensionale (2D) SDD-Alter durchführen. SDD-Alter-Stable Amyloid oder Amyloid-wie Fasern haben das gleiche Migration Muster während der ersten und zweiten Dimension Elektrophorese. Dies wird nach der Proteine auf eine Membran übertragen und ein Western-Blot nachweisbar sein. Stabilere Fasern zeigen eine scharfe Muster mit diagonalen Streifen. Jede Abweichung von diesem würde vorschlagen, dass die Fasern durch die SDS-Elektrophorese verändern.

<table><tbody><tr><td>Gelelektrophoresegerät</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>Appratus für den Gellauf.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>Für Agarosegel.</td></tr><tr><td>Papierturm</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>zum Übertragen von</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>zum Übertragen von</td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>zum Übertragen von</td></tr><tr><td>blockierendem Milchpulver</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>zum Blockieren im Western Blot</td></tr><tr><td>MLKL-Antikörper</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>Kaninchen-Anti-MLKL-Antikörper</td></tr><tr><td>RIPK1 Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>Maus Anti-RIPK1 Antikörper</td></tr><tr><td>RIPK3 Antikörper</td><td>Geschenk von Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>Kaninchen Anti-RIPK3. Siehe Refenenz 11.</td></tr><tr><td>anti-Kaninchen-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>Western chemilumineszierendes HRP-Substrat</td></tr><tr><td>Röntgenfilm</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>für Western Blot Ergebnis</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>für Zellkultur</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>für Zellkultur</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin,</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>für die Zellkultur</td></tr>, <tr><td>Trypsinlösung</td>, <td>Sigma</td><td>T4049</td><td>für die Zellkultur</td></tr>, <tr><td>PBS für die Gewebekultur</td>, <td>Sigma</td><td>D8662</td><td>für die Zellkultur</td></tr>, <tr><td>rekombinantes TNF</td>, <td>hergestellt in unserem Labor</td><td></td><td>zur Induktion der Nekroptose. Siehe Referenz 11.</td></tr><tr><td>smac-mimetisches</td><td>Geschenk von Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>zur Induktion der Nekroptose. Siehe Referenz 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>zur Induktion von Nekroptose. Siehe Referenz 11.</td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Modell TC20; zum Zählen von Zellen</td></tr><tr><td>Pierce&trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>zur Messung der Proteinkonzentration in Zelllysaten</td></tr><tr><td>Cell</td><td>Lifter Fisher</td><td>07-200-364</td><td>zur Entnahme von Zellen aus der Schale</td></tr><tr><td>Lysepuffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL Glycerin 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (Protease- und Phosphatinhibitoren) wie gewünscht)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)48,4</td><td></td><td></td> <td>g Tris base 11,42 mL Eisessig 20 mL 0,5 M EDTA pH 8 ddH20 bis 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE Ladepuffer (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE 10 mL Glycerin 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% Bromphenolblau 31 mL ddH2O</td></tr><tr><td>TBS-Transferpuffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7,4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O</td></tr><tr><td>PBST-Waschpuffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4&middot; 2H2O 24 g KH2PO4 ddH2O bis 10 L hinzufügen</td></tr></tbody></table>

verwendung von zwei dimensionale semi-denaturierenden waschmittel agarose gelelektrophorese größe heterogenität von amyloid oder amyloid-wie fasern zu bestätigen

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern wurden mit vielen menschlichen Krankheiten und sind jetzt wichtig für viele Signalwege entdeckt. Die Fähigkeit, die Bildung dieser Fasern unter verschiedenen experimentellen Bedingungen leicht zu erkennen ist wichtig für das Verständnis ihrer potenzialfunktion. Viele Methoden wurden verwendet, um die Fasern zu erkennen, aber nicht ohne einige Nachteile. Elektronenmikroskopie (EM) oder Färbung mit Kongo-rot oder Thioflavin T oft erfordert z. B. Reinigung der Fasern. Auf der anderen Seite ermöglicht Waschmittel Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese (SDD-Alter) Erkennung der SDS-resistente Amyloid-ähnliche Fasern in zellextrakte ohne Reinigung. Darüber hinaus ermöglicht es den Vergleich der Größenunterschied der Fasern. Noch wichtiger ist, kann verwendet werden, um bestimmte Proteine innerhalb der Fasern durch westliche Beflecken zu identifizieren. Es ist weniger zeitaufwändig und leichter zugänglich, eine größere Zahl von Labs. SDD-Alter Ergebnisse zeigen oft Variablen Grad der Heterogenität. Es stellt sich die Frage ob die Dissoziation der Proteinkomplex während der Elektrophorese in Anwesenheit von SDS Bestandteil der Heterogenität entsteht. Aus diesem Grund haben wir eine zweite Dimension der SDD-alt sein, um festzustellen, ob die Größe Heterogenität in SDD-Alter gesehen wirklich ein Ergebnis der Faser Heterogenität in Vivo und kein Ergebnis einer Verschlechterung oder Dissoziation von einige der Proteine während beschäftigt Elektrophorese. Diese Methode ermöglicht schnelle und qualitative Bestätigung, das Amyloid oder Amyloid-ähnliche Fasern nicht teilweise während des Prozesses der SDD-Alter entkoppelt sind.

Nach Necroptosis Induktion zeigten RIPK1 und RIPK3 fast identische Amyloid-Mustern (Bahnen 2 und 4, Abbildung 1). Jedoch MLKL Fasern wurden heterogener und schien kleiner als RIPK1/RIPK3 Fasern (Bahn 6, Abbildung 1). Das veranlasste uns, die 2D SDD-Alter-Methode, um die Möglichkeit zu befassen, ob MLKL RIPK1/RIPK3-unabhängige Fasern bildet oder MLKL einfach distanziert sich von den großen RIPK1/RIPK3/MLKL-Fasern während SDD-Alter...

Hier verwenden wir zweidimensionale Semi-denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese bestätigen das Vorhandensein von Amyloid-wie Fasern von heterogenen Größe und die Möglichkeit, die die Größe Heterogenität durch Dissoziation der Amyloid Fasern während des Gels ist ausgeschlossen laufenden Prozess.

Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Das übergeordnete Ziel dieser zweidimensionalen, halbdenaturierenden Agarose-Gelelektrophorese ist es, die Größenheterogenität von Amyloid oder Amyloid-ähnlichen Fasern zu bestätigen, die während der traditionellen SDD-AGE beobachtet wurde. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Amyloid- oder Proteinaggregation zu beantworten, z. B. ob die Größenheterogenität, die während der traditionellen SDD-AGE beobachtet wird, der native Zustand der Fasern in vivo oder das Ergebnis des Proteinabbaus oder der Dissoziation während der Gelelektrophorese ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ohne spezielle Ausrüstung problemlos im Labor durchgeführt werden kann.Es ist keine zusätzliche Ausrüstung erforderlich, die über die in herkömmlichem SDD-AGE verwendete Ausrüstung hinausgeht. Zuerst säen Sie die Amyloid-produzierenden HT-29-Darmkrebszellen in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, verwenden Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, um die Zellen zu waschen. Geben Sie dann drei Milliliter Trypsin in die

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SDD-AGE ist eine nützliche Technik für die Erkennung und Charakterisierung von Amyloid-ähnlichen Polymeren in den Zellen. Hier zeigen wir eine Anpassung, dass diese Technik zugänglich großflächige Anwendungen macht.

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Dieses Video zeigt das Trennverfahren von Heparansulfaten, die aus Lungengewebe von Mäusen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert wurden.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Eine analytische Technik zum Nachweis von Heparansulfaten unterschiedlicher Kettenlängen, die aus Lungengewebe von Mäusen isoliert wurden

Dieses Video zeigt eine denaturierende Polyacrylamid-basierte Trenntechnik für Proteine. Diese Technik hilft bei der vorläufigen Identifizierung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts.

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für die Proteinanalyse: Eine Technik zur Trennung und Visualisierung von Proteinen auf der Grundlage des Molekulargewichts

Dieses Video demonstriert die auf zweidimensionalen halbdenaturierenden Agarosegelelektrophoresen basierende Trennung von Amyloidfasern. Die Technik trennt die polymorphen Amyloid-Aggregate anhand ihrer heterogenen Größe.

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In diesem Video demonstrieren wir eine zweidimensionale Gelelektrophorese-Methode, die einzelne Proteine aus einer komplexen Proteinmischung trennt, die aus Tumorgeweben des humanen nichtfunktionellen Hypophysenadenoms (NFPA) gewonnen wurde. Die Proteine werden in der ersten Dimension anhand ihrer elektrischen Ladung und in der zweiten Dimension anhand von Molekulargewichten weiter getrennt.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

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Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.

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Dieser Artikel beschreibt ein einfaches und schnelles Protokoll zur Bewertung des oligomeren Zustands des Dynamin-ähnlichen GTPase MxA-Proteins aus Lysaten menschlicher Zellen unter Verwendung einer Kombination aus nicht-denaturierender PAGE und Western-Blot-Analyse.

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Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

Lernen Sie die zweidimensionale semi-denaturierende Agarosegelelektrophorese zur Bestätigung der Größenheterogenität von Amyloidfasern. Diese Methode unterscheidet native Zustände von experimentellen Artefakten.

Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen (Video) | JoVE Journal

Verwendung von zwei dimensionale Semi-denaturierenden Waschmittel Agarose Gelelektrophorese Größe Heterogenität von Amyloid oder Amyloid-wie Fasern zu bestätigen

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