Eine schnelle und Quantitative Methode für Post-translationale Modifikation und Variante aktiviert Mapping von Peptiden mit Genomen

Das übergeordnete Ziel dieses Softwareprotokolls ist es, die Verwendung von PoGo zu demonstrieren, um Peptide mit zugehörigen posttranslationalen Modifikationen und quantitativen Informationen aus Massenspektrometrie-Experimenten zu kartieren, um Genome zu referenzieren und die Integration und Visualisierung mit orthogonalen Genomikdaten zu ermöglichen. Dieses Tool kann dabei helfen, den Peptidlisten, die durch massenspektrometrische Proteomik-Suchen generiert werden, genomische Informationen hinzuzufügen, so dass die Integration mit RNA-Sequenzierungsdaten erleichtert werden kann. Der Hauptvorteil dieses Tools besteht darin, dass es einfach zu bedienen und schnell ist und zusätzliche Informationen wie posttranslationale Modifikationen, Quantifizierung und Aminosäurevarianz unterstützt.

Laden Sie zunächst die in diesem Video gezeigte Software herunter und installieren Sie sie, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Navigieren Sie nach der Installation zum Ordner für ausführbare PoGo-GUI-Dateien und starten Sie das Programm, indem Sie auf das PoGo-GUI-Symbol doppelklicken. Verwenden Sie die Schaltfläche "Auswählen" neben der ausführbaren PoGo-Datei.

Navigieren Sie dann im Ordner "Ausführbare" zum entsprechenden Unterordner des Betriebssystems und wählen Sie die ausführbare PoGo-Datei aus. Bestätigen Sie die Auswahl, indem Sie auf die Schaltfläche Öffnen klicken. Wählen Sie anschließend die Referenzeingabedatei für Proteinsequenzen aus, indem Sie auf Auswählen klicken.

Navigieren Sie zum Datenordner und wählen Sie die Übersetzungs-Fast-Day-Datei aus. Bestätigen Sie die Auswahl mit einem Klick auf Öffnen. Wählen Sie die Transkriptanmerkungsdatei mit der Schaltfläche "Auswählen" aus.

Navigieren Sie dann zum Datenordner, wählen Sie die Anmerkungs-GTF-Datei aus und klicken Sie auf Öffnen. Fügen Sie die Peptididentifikationsdatei über die Schaltfläche "Hinzufügen" neben den Peptiddateien hinzu. Wählen Sie hier die Datei im unterstützten Format MZ Tab, MZ Ident ML oder MZ ID oder im tabulatorgetrennten vierspaltigen Format aus.

Deaktivieren Sie außerdem die Kontrollkästchen neben BED NGTF in der Auswahl des Ausgabeformats. Lassen Sie PTM BED und GCT nur überprüft. Wählen Sie dann die passende Spezies für die Daten aus der Dropdown-Auswahl aus und starten Sie das Mapping, indem Sie auf Start klicken.

Laden Sie zunächst die PoGo-Ausgabedatei, die auf _ptm. bed endet, in den integrativen Genomik-Viewer. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um auch die Datei zu laden, die auf _noptm.bed endet.

Diese Datei enthält alle gefundenen Peptide ohne jegliche Modifikation. Ordnen Sie Tracks neu an, indem Sie sie per Drag & Drop an die gewünschte Position in der Liste ziehen. Jede Datei wird als separate Spur angezeigt, wobei der Name der Datei den Titel identifiziert.

Jede Spur wird zunächst eingeklappt angezeigt. Um sie zu erweitern, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Namen der Spur und wählen Sie Erweitert, um eine vollständige Ansicht der Peptide einschließlich der Sequenzen zu erhalten. Laden Sie nun die Datei mit der Endung gct.

Diese Datei enthält die Informationen zur Peptidquantifizierung. Im Gegensatz zu den zuvor geladenen Dateien wird jedes kommentierte Sample als separate Spur geladen. Ordnen Sie die Proben wie gewünscht per Drag & Drop an.

Navigieren Sie innerhalb des Genoms, indem Sie ein Chromosom im Dropdown-Menü auswählen, indem Sie auf einen Abschnitt eines Chromosoms klicken und ihn gedrückt halten, um ihn zu vergrößern, oder indem Sie die genomischen Koordinaten eingeben. Das PoGo-Mapping kann über die grafische Benutzeroberfläche oder über die Befehlszeilenschnittstelle durchgeführt werden. In diesem Teil des Protokolls wird die Befehlszeilenschnittstelle verwendet, um die Austauschbarkeit hervorzuheben.

Um die Variantenpeptide, die durch die vorherigen Schritte im Textprotokoll erhalten wurden, dem Referenzgenom zuzuordnen, öffnen Sie eine Eingabeaufforderung und navigieren Sie zum ausführbaren Ordner von PoGo. Geben Sie dann den hier gezeigten Befehl ein. Bestätigen Sie die Ausführung durch Drücken der Eingabetaste und warten Sie, bis die Ausführung abgeschlossen ist, bevor Sie fortfahren.

Visualisieren Sie die Peptide, die ohne Mismatch und mit Mismatch im integrativen Genomik-Viewer kartiert wurden. Fügen Sie in der PoGo-Software für die grafische Benutzeroberfläche die Peptididentifikationsdateien hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" neben den Peptiddateien klicken, einzelne oder mehrere Dateien auswählen und per Drag & Drop in das leere Feld unter den Peptiddateien ziehen. Deaktivieren Sie dann die Kontrollkästchen neben PTM BED, GTF und GCT im Abschnitt Ausgabeformat und lassen Sie nur BED aktiviert.

Wählen Sie außerdem die Option Mehrere Eingabedateien in einer einzigen Ausgabe zusammenführen. Dies führt zu einer einzigen Ausgabedatei, die alle Peptide der Eingabedateien kombiniert. Wenn diese Option nicht ausgewählt ist, wird das Programm für jede Eingabedatei separat sequenziell ausgeführt.

Wählen Sie als Nächstes die entsprechende Spezies für die Daten aus der Dropdown-Liste aus, die mit den NGTF-Dateien für schnelle Tage konsistent ist. Sobald Sie ausgewählt sind, starten Sie das Mapping, indem Sie auf die Schaltfläche Start klicken. Um einen Track-Hub aus zugeordneten Peptiden zu generieren, öffnen Sie ein Terminalfenster und geben Sie den folgenden Befehl in die Eingabeaufforderung ein.

Bestätigen Sie die Ausführung mit der Eingabetaste. Die Ausführung dauert nur kurze Zeit. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie den generierten Track-Hub mit all seinen Inhalten auf einen über das Internet zugänglichen FTP-Server oder GitHub.

Navigieren Sie in einem Webbrowser zum UCSC Genome-Browser, und wählen Sie My Data Track Hubs aus. Klicken Sie dann auf den Reiter Meine Hubs. Kopieren Sie die URL zum Track-Hub in das Textfeld, und laden Sie dann den Track-Hub, indem Sie auf Hub hinzufügen klicken.

Wählen Sie abschließend den Genombrowser aus, um die Browseransicht aufzurufen. Der Hub für benutzerdefinierte Strecken wird oben in der Liste angezeigt. Wenn mehrere BED-Dateien die Grundlage für den Gleis-Hub bilden, wird jede der Dateien als separates Gleis innerhalb des Hubs dargestellt.

PoGo und zwei weitere Proteogenomics-Mapping-Tools werden hier hinsichtlich ihrer gesamten Speichernutzung und analytischen Laufzeit verglichen. PoGo übertrifft die anderen Tools sowohl in Bezug auf die Geschwindigkeit als auch auf den Speicher deutlich und ist in der Lage, posttranslationale Modifikationen und quantitative Informationen, die mit Peptiden verbunden sind, auf das Genom abzubilden. PoGo nutzt die Färbeoption, um eine einfache visuelle Hilfe in Bezug auf die Einzigartigkeit der Peptidkartierung innerhalb des Genoms zu bieten.

Rot markierte Zuordnungen zeigen die Eindeutigkeit eines einzelnen Transkripts an, während der Block die Zuordnung zu einem einzelnen Gen hervorhebt. Graue Mappings zeigen Peptide, die von mehreren Genen gemeinsam genutzt werden. Die PTM BED-Option von PoGo definiert den Farbcode neu, um verschiedene Arten von posttranslationalen Modifikationen zu berücksichtigen, und zeigt die Position der Modifikation mit einem dicken Block am modifizierten Aminosäurerest an.

In den hier gezeigten Proteomdaten, die die von Darmkrebs repräsentieren, wurden nur zwei Peptide identifiziert, die jeweils eine einzige Phosphorylierung zeigten. Die Informationen in der Ausgabe-GCT-Datei enthalten quantitative Werte für genomische Regionen, die von Peptiden bedeckt sind. Peptide, die sich über Spleißverbindungen erstrecken, werden in ihre Teile zerlegt, ohne sich zu verbinden.

Für umfassendere Informationen zum Spleißen wird zusätzlich die GTF-Ausgabedatei benötigt. Sobald die Referenzproteinsequenzen und die Annotation heruntergeladen und eingerichtet sind, können Tausende von Peptiden in weniger als fünf Minuten auf genomische Koordinaten abgebildet werden, wenn keine Sequenzfehlanpassungen möglich sind. Bei dem Versuch, Peptide mit PoGo auf Referenzgenome abzubilden, ist es wichtig, daran zu denken, translatierte Sequenzen von proteinkodierenden Transkripten und die zugehörige Transkriptannotation zu verwenden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie PoGo und PoGo GUI verwenden, um Peptide aus Proteomik-Massenspektrometrie-Experimenten mit zugehörigen Informationen auf referenzierte Genome abzubilden und zu visualisieren.