Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg
12. Januar 2020
Ziel dieses Protokolls ist es, Mikrogefäße aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems von lissenzephalischen und gyrencephalen Wirbeltieren zu isolieren.
Dieses Protokoll ist wichtig, weil es den Vergleich der Mikrovaskulatur zwischen verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems sowie zwischen verschiedenen Individuen ermöglicht. Diese Mikrogefäßisolationstechnik kann innerhalb eines einzigen Tages abgeschlossen werden und macht ultrazentrifugation und enzymatische Dissoziation überflüssig. Das Entfernen der Meninges und des Aderhautplexus kann schwierig sein.
Achten Sie darauf, langsam und sorgfältig zu arbeiten, um die vollständige Entfernung jedes Gewebes zu gewährleisten. Für die ZNS-Gewebesektion aus einer kleinen lissenzephalen Wirbeltierprobe, legen Sie das geerntete Gehirn in eine 15 Milliliter konische Röhre mit MV-1-Lösung auf Eis, und verwenden Sie Zangen, um die Hypophyse aus der Sellaturcica des Schädels zu holen. Legen Sie die Hypophyse in einem 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr der MV-1-Lösung auf Eis, und entfernen Sie die Haut und den Muskel, um die Wirbelsäule freizulegen.
Nach dem Entfernen der Gliedmaßen, des Brustkorbs und der inneren Organe verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Meter-Nadel ausgestattet ist, um die Wirbelsäule mit frischer MV-1-Lösung in kaudaler bis rostraler Richtung im gesamten Lendenwirbelforamen zu spülen. Dann legen Sie das Rückenmark in eine 5 Milliliter Tube mit frischer MV-1-Lösung. Als nächstes legen Sie das Gehirn in eine Petrischale unter dem Sezieren Mikroskop, und entfernen Sie die Meninges mit doppelzackigen Stachel.
Achten Sie darauf, das Rückenmark zu überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Stücke von Meningen übrig bleiben. Verwenden Sie die Zange, um den Hypothalamus, Kleinhirn, Hirnstamm und Kortex zu trennen. Verwenden Sie bei Bedarf Zangen und Iris und Federscheren, um die Olfaktor-Lampen und Thalamus zu verbrauchen, und verwenden Sie den doppelzackigen Stachel, um den gesamten Aderhautplexus aus allen Hirnkammern zu entfernen.
Für Die ZNS-Gewebesektion aus einer großen gyrencephalen Wirbeltierprobe verwenden Sie ein Sezieren des Mikroskops und einen doppelzackigen Stich, Zangen und Iris- und Federscheren, um die Hirnhäute aus jedem ZNS-Gewebe zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, alle Stücke des Aderhautplexus aus den Hirnkammern zu entfernen. Zur Homogenisierung des geernteten ZNS-Gewebes wird jede ZNS-Region in einzelnen Petrischalen in ein bis zwei Millimeter zerkleinert. Um ZNS-Gewebe aus kleinen Wirbeltierproben zu homogenisieren, verwenden Sie eine Transferpipette, um einen Milliliter MV-1-Lösung hinzuzufügen, um das gehackte Gewebe zu suspendieren.
Verwenden Sie dann die gleiche Transferpipette, um den Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Sehlappen und Rückenmarksstücke in einzelne 10 Milliliter Glasgewebeschleifer zu verteilen, und verwenden Sie einen PTFE-Stößel und fünf Milliliter MV-1-Lösung, um jeden Satz Gewebe für etwa 10 Striche zu mahlen. Übertragen Sie jede Gewebeschlämme in einzelne 15 Milliliter konische Röhren auf Eis, und verwenden Sie Zangen, um den Hypothalamus und die Hypophyse in 100 Mikroliter MV-1-Lösung, in einzelnen 1,7 Milliliter-Röhren zu platzieren. Dann, sorgfältig homogenisieren jedes Gewebe mit einem Glas Mikropestle.
Um eine große Wirbeltierprobe zu homogenisieren, verwenden Sie eine abgeschrägte Geschnittentransferpipette, um das gehackte Gewebe auf einen 55-Milliliter-Glasgewebeschleifer zu übertragen, und befestigen Sie den Schleifer an einem Oberrührer. Fügen Sie die Hälfte des empfohlenen Volumens der MV-1-Lösung entsprechend dem in der Tabelle angegebenen zwiesigen ZNS-Teil hinzu, und schalten Sie den Overheadrührer auf ca. 150 Umdrehungen pro Minute ein. Bewegen Sie das Glasrohr vorsichtig für ca. 30 Sekunden nach oben und unten, bevor Sie den Oberrührer ausschalten, um weitere MV-1-Lösung für eine zusätzliche Homogenisierung hinzuzufügen, bis eine homogene Gülle erhalten ist.
Dann das homogenisierte Gewebe auf ein 50 Milliliter konisches Rohr auf Eis übertragen. Zur Mikrogefäßreinigung wird das ZNS-Gewebe durch Zentrifugation homogenisiert und die Überstande entsorgt. Für eine kleine Wirbeltier-Mikrogefäßisolierung, Pipette die Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Optiklappen und Rückenmarkspellets, in fünf Milliliter frische, eiskalte MV-2-Lösung pro Probe, etwa 10 Mal, bevor fünf weitere Milliliter eiskalte MV-2-Lösung zu jeder Röhre hinzugefügt.
Drehen Sie die Rohre vorsichtig um, um sie zu mischen, und hängen Sie den Hypothalamus und die Hypophysenpellets in einem Milliliter MV-2-Lösung wieder auf. Für die Isolierung von großen Wirbeltieren fügen Sie 20 Milliliter eiskalte MV-2-Lösung in die Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksmikrovessel-Pellets ein und hängen Sie die Pellets in einem Röhrenrevolver mit 40 Umdrehungen pro Minute für etwa 5 Minuten wieder auf. Am Ende der Wiedersuspension, trennen Sie die ZNS-Gewebelykate durch Zentrifugation, und drehen Sie langsam jedes Rohr, damit der Überstand entlang der Wand passieren kann, um die dicke und dichte Myelinschicht an der flüssigen Schnittstelle vorsichtig von den Rohrwänden zu lösen.
Entsorgen Sie die Myelin- und Flüssigkeitsschnittstellen, und bauchen Sie die Innenwand jedes Rohres mit einem Spachtel, der mit einem papierarmen Papiertuch umwickelt ist. Verwenden Sie dann ein verdrehtes Low-Lint-Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren, und verwenden Sie niedrigbindende Spitzen, um jedes Pellet in einem Milliliter MV-3-Lösung wieder aufzuhängen. Für die Mikrogefäßelution und Filtration, mischen Sie ein paar Milliliter frische MV-3-Lösung zu jeder CNS-Gewebe-Mikrogefäß-Schlämme, und während des Mischens, um Aggregate zu vermeiden, jede Suspension durch ein Pruitt-Sieb in einzelne 50 Milliliter konische Röhren zu dehnen.
Legen Sie einen 20 Mikrometer Nylonnetzfilter auf einen modifizierten Filterhalter pro ZNS-Region. Übertragen Sie den Filterhalter auf ein 50 Milliliter Konikonrohr und befeuchten Sie den Filter mit fünf Millilitern eiskalter MV-3-Lösung, um sicherzustellen, dass der Puffer den Filterhalter heruntergießt, in das konische Rohr. Übertragen Sie die eluierten Mikrogefäße auf jeden 20 Mikrometer Nylonnetzfilter und spülen Sie die Mikrogefäße mit fünf bis zehn Millilitern eiskalter MV-3-Lösung.
Verwenden Sie Zangen, um jeden Filter in einzelne Becher zu übertragen, die die eiskalte MV-3-Lösung enthalten, und schütteln Sie jeden Filter vorsichtig für etwa 30 Sekunden, um die Mikrogefäße zu lösen. Nach der Übertragung auf ein 15 Milliliter konisches Rohr, sammeln Sie die Mikrogefäße durch Zentrifugation, und verwenden Sie eine niedrig bindende Pipette, um jedes Pellet in einem Milliliter eiskalten MV-3-Lösung wieder aufzuhängen. Dann transferieren Sie Mikrogefäßsuspensionen von kleinen Wirbeltierproben in ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zur Zentrifugation für fünf Minuten bei 20.000 mal G, bei vier Grad Celsius.
Bei großen Wirbeltierproben die Suspension in einzelne Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhren übertragen und vier Milliliter MV-3-Lösung für die Zentrifugation für fünf Minuten bei 2 000 mal G bei vier Grad Celsius hinzufügen. Die intrinsischen Komponenten der neurovaskulären Einheit können in Mikrogefäßen, wie gezeigt, durch Immunkennzeichnung für CD31, PDGFR-beta und Aquaporin vier, einschließlich der kortikalen, Kleinhirn, Hypophyse, Hypothalamus, Hirnstamm und Spinalmikrogefäße nachgewiesen werden. Ebenso kann die Expression von Adhäsions-Junction-Protein VE-Cadherin, engen Knotenproteinen CLDN5 und Zonula Occludens-1, trizellulärem Junction-Protein Angulin-1 und Basalmarken Chemokinligand CXCL-Motiv 12 und Gamma-Glutamyltransferase-1 visualisiert werden.
Darüber hinaus ist die Mehrheit der Mikrogefäße frei von der Expression von Alpha-Glattmuskel-Actin, was darauf hindeutet, dass dieses Isolationsprotokoll selektiv auf kleinkalibrige Mikrogefäße abzielt. Mikrogefäße, die von anderen kleinen lissenzephalen Wirbeltieren wie Vogel, Liard, Frosch und Fisch gewonnen werden, teilen einige morphologische Merkmale, was darauf hindeutet, dass diese Methode für die weitere Charakterisierung von Unterschieden in neurovaskulären Einheiten zwischen Denspezies nützlich ist. Die Quantifizierung der Veränderungen der Proteinexpression zeigt eine Zunahme des Vaskulärenadhäsionsmoleküls eins und des junctionalen Adhäsionsmoleküls B entlang der Mikrogefäße des Rückenmarks während des Höhepunkts der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis.
Jedoch, Vaskuläre Zelladhäsion Molekül einist auch deutlich in Hypophysen Mikrogefäße erhöht, und in der Hypothalamus und Gehirnstamm Mikrogefäße verringert. Darüber hinaus werden Veränderungen im Vaskulärenzelladhäsionsmolekül eine Expression bei chronischer experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis in allen ZNS-Geweben und bei der junctionalen Adhäsionsmolekül-B-Expression in den Hypothalamus- und Hypophysenmikrogefäßen beobachtet. Quantitative Analysen wie Western Blot, PCR und Immunhistochemie können nach diesem Verfahren durchgeführt werden, um Einblicke in Gen- und Proteinexpressionsmuster innerhalb der Blut-Hirn-Schranke zu gewinnen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Mikrogefäßen aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems (CNS) sowohl bei lissenzephalen als auch bei gyrenzephalen Wirbeltieren. Durch die Möglichkeit, die Mikrogefäße in unterschiedlichen CNS-Regionen und Individuen zu vergleichen, ermöglicht diese Technik tiefere Einblicke in die vaskulären Strukturen. Das Protokoll kann innerhalb eines Tages abgeschlossen werden, ohne dass eine Ultrazentrifugation oder enzymatische Dissoziation erforderlich ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Untersuchungen zur Mikrovaskulatur
- Forschung zum Zentralnervensystem
Hintergrund
- Die Isolierung von Mikrogefäßen des ZNS ist entscheidend für das Verständnis regionaler Unterschiede in der Gefäßversorgung.
- Mikrogefäßstudien können Einblicke in neurologische Erkrankungen und die vaskuläre Gesundheit liefern.
- Die Studie befasst sich mit den Herausforderungen beim Entfernen komplexer Gewebe, um gleichzeitig eine saubere Probe für die Analyse sicherzustellen.
- Vergleichende Analysen über verschiedene Arten hinweg können unser Verständnis der Struktur des Wirbeltier-ZNS verbessern.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Mikrogefäßen aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems etablieren.
- Die Mikrogefäße bei lissenzephalen und gyrenzephalen Wirbeltieren vergleichen.
- Den Isolationsprozess vereinfachen, indem auf traditionelle Techniken wie die Ultrazentrifugation verzichtet wird.
Verwendete Methoden
- Die Methode umfasst die Dissektion und Homogenisierung von ZNS-Gewebe, gefolgt von einer Zentrifugation zur Reinigung der Mikrogefäße.
- Sowohl kleine als auch große Wirbeltierpräparate werden verwendet, jeweils mit spezifischen Protokollen für die jeweilige Größe.
- Manuelle Techniken wie sorgfältige Gewebeentfernung und Homogenisierung stehen im Vordergrund, um eine Beschädigung der Mikrogefäße zu vermeiden.
- Frische MV-1- und MV-2-Lösungen sind entscheidend, um die Gewebeviabilität während des gesamten Verfahrens aufrechtzuerhalten.
- Die Filtration durch Nylon-Netzfilter trägt zur Reinigung der isolierten Mikrogefäße bei.
Hauptergebnisse
- Das beschriebene Verfahren ermöglicht die effektive Isolierung von Mikrogefäßen und bietet eine robuste Grundlage für zukünftige vergleichende Studien.
- Herausforderungen bei der Entfernung von Gewebe, insbesondere der Hirnhäute und des Plexus choroideus, werden durch gezielte Empfehlungen bewältigt.
- Diese Methode ist vielseitig einsetzbar und erlaubt die Isolierung sowohl bei kleinen als auch bei großen Wirbeltierarten.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine effiziente Technik zur Isolierung von Mikrogefäßen, die die Forschung an vaskulären Netzwerken des zentralen Nervensystems verbessern kann.
- Die Möglichkeit, die Mikrogefäße verschiedener Wirbeltiere zu vergleichen, eröffnet neue Ansätze zum Verständnis vaskulärer Anpassungen.
- Insgesamt trägt das Protokoll zum Verständnis der Morphologie und Funktion des ZNS bei, insbesondere im Hinblick auf die Gesundheit des Mikrogefässsystems.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht einen direkten Vergleich von neurovaskulären Einheiten zwischen verschiedenen ZNS-Regionen und Individuen und behebt damit eine wesentliche Einschränkung in der Blut-Hirn-Schranke-Forschung. Durch die Unterstützung der Analyse über Arten- und Gewebetypgrenzen hinweg verbessert es die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in Modellen neuroinflammatorischer Erkrankungen. Die Kompatibilität der Methode mit nachgeschalteten Anwendungen wie qPCR, RNA-seq und Western Blot stellt sie als skalierbares Werkzeug für die präklinische Biomarkerbewertung und die Untersuchung von Signalwegen dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch den Vergleich der Zusammensetzung der neurovaskulären Einheit (NVU) in Kortex, Kleinhirn, Hypothalamus, Hirnstamm, Rückenmark und Hypophyse.
- Operativer Wert: Unterstützt individuelle Vergleiche, reduziert die Variabilität durch gepoolte Proben und verbessert die statistische Aussagekraft in Studien zur Zielstrukturenbindung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt gereinigte Mikrogefäße, die für die quantitative Analyse der Proteinausprägung mittels Immunfärbung von CD31, PDGFR-beta, Aquaporin-4, VE-Cadherin, CLDN5, ZO-1 und Angulin-1 geeignet sind.
- Operativer Wert: Macht Ultrazentrifugation und enzymatische Dissoziation überflüssig, vereinfacht den Arbeitsablauf und erhält native Protein-Komplexe für zuverlässige Assay-Ergebnisse.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Nachgewiesene Eignung im EAE-Modell mit quantifizierbaren Veränderungen der VCAM-1- und JAM-B-Expression in Mikrogefäßen des Rückenmarks, der Hypophyse, des Hypothalamus und des Hirnstamms.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Überwachung vaskulärer Biomarker während des Krankheitsverlaufs und unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung in neuroinflammatorischen Programmen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung ein, insbesondere für neurovaskuläre und neuroinflammatorische Targets, bei denen die Integrität der Blut-Hirn-Schranke ein entscheidender Faktor für die Wirksamkeit und Sicherheit von Arzneimitteln ist.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zur regionspezifischen Zusammensetzung der NVU sowie zu behandlungsbedingten Veränderungen in Adhäsions- und Junctionalproteinen.
- Screening: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Mikrogefäßerzeugnisse, die für bildbasierte Hochdurchsatzanalysen und multiplexe Proteinprofilerstellung geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Western Blot-, qPCR- und RNA-seq-Auswertungen, um Protein- und Genexpressionsmuster zwischen Individuen, Regionen und Behandlungsgruppen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem direkte Vergleiche von NVU-Veränderungen in Krankheitsmodellen wie EAE ermöglicht werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll ist über Wirbeltierarten und ZNS-Regionen hinweg anwendbar, fördert die Standardisierung über Projekte hinweg und verringert redundante Methodenentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mikrovaskuläre Veränderungen über quantifizierbare Biomarker wie VCAM-1 und JAM-B mit neuroinflammatorischen Mechanismen verknüpft werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Schritte der Dissektion, Homogenisierung und Filtration, die die Variabilität zwischen Bedienern minimieren.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, für den Menschen relevante Daten zu vaskulären Reaktionen in präklinischen Modellen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von auf das ZNS abzielenden Wirkstoffen basierend auf deren Potenzial zur BBB-Modulation und neurovaskulären Sicherheitssignalen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Neuroanatomie und mikrochirurgischer Dissektion, um eine vollständige Entfernung der Meningen und des Plexus choroideus sicherzustellen.
- Hängt vom Zugang zu Gewebemühlen, Zentrifugen mit einer Leistung von 2.000–20.000 × G und Low-Binding-Röhrchen ab, um einen Verlust von Mikrogefäßen zu vermeiden.
- Erfordert eine Standardisierung der Zubereitung der Puffer MV-1, MV-2 und MV-3 zwischen verschiedenen Laboren, um eine konsistente Ausbeute und Reinheit der Mikrogefäße zu gewährleisten.
- Die Anpassung auf verschiedene Arten erfordert eine Anpassung von Homogenisierungsvolumen und -dauer basierend auf Gewebedichte und -größe, wie im Protokoll beschrieben.
- Der Schritt zur Myelin-Entfernung erhöht die technische Komplexität; eine unvollständige Entfernung kann die Präparation verunreinigen und nachfolgende Proteinanalysen stören.
