Name: Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Erfahren Sie eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Mikrogefäßen aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems bei Wirbeltieren. Diese Technik ermöglicht vergleichende Analysen ohne Ultrazentrifugation.

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Dr. Cruz-Orengo wurde von der University of California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds unterstützt.

Alle Verfahren der vorliegenden Studie entsprechen den Richtlinien der University of California (UC), davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Die Tierpflege an der UC Davis wird durch mehrere unabhängige Ressourcen reguliert und ist seit 1966 von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) voll akkreditiert. Porcine CNS Gewebe wurden von UCD Department of Animal Sciences, Meat Sciences Laboratory gewonnen. ZNS-Gewebe aus Rhesus-Makaken wurden vom California National Primate Research Center Pathology Department (NIH P51OD011107) gewonnen. Keine Anästhesie, Euthanasie oder Nekropsie wurde von Labormitarbeitern an Schweinen und Makaken durchgeführt. Daher gibt es keine besonderen Empfehlungen zu diesen Fragen.
HINWEIS: Diese Methode wurde für mehrere Arten validiert, aber das bereitgestellte Protokoll entspricht direkter Maus- und Schweinegewebe. Details zum Optischen Lappen gelten nicht bei der Verwendung von Säugetierproben. Alle biogefährlichen Stoffe müssen in einer geeigneten Biosicherheitseinrichtung (BSL) behandelt werden. Alle akut toxischen Materialien müssen unter einer Dunstabzugshaube behandelt werden. Alle biogefährlichen medizinischen Abfälle und akut giftigen Abfälle müssen ordnungsgemäß entsorgt werden.
1. Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie Lösungen(Tabelle 1) mindestens einen Tag im Voraus vor. HINWEIS: Es ist sehr schwierig, 70 kDa Molekulargewicht (MW) Dextran aufzulösen. Es ist effizienter, die Lösung über Nacht entweder mit Paraffinfolie oder Folie umrühren zu lassen. Das Protokoll erfordert die Verwendung von zwei verschiedenen MV-2-Lösungen, abhängig von der untersuchten Probe. Der 18% Dextran trennt das Myelin effizient vom Mikrogefäßpellet, wenn das Protokoll an kleinen lissenzephalen Proben ausgeführt wird. Es entwickelt jedoch einen Abstrich von Myelin innerhalb der Schnittstelle von ZNS-Geweben von großen gyrencephalen Proben, sowie dem Hypothalamus und der Hypophyse von kleinen Proben. Dieser Abstrich wird durch die Verwendung von 20% dextran verhindert.</li>
	<li>Bereiten Sie Well-Dias vor, indem Sie 50 l pro Bohrung von Poly-D-Lysin beladen und 2 h bei Raumtemperatur (RT), vorzugsweise in einem biologischen Sicherheitsschrank Klasse 2 (BSC-2), trocknen lassen. Nicht übertrocknen. Zweimal mit phosphatgepufferter Saline (PBS) abspülen und im Kühlschrank aufbewahren, bis er einsatzbereit ist.</li>
</ol>2. ZNS Gewebesektion aus kleinen Lissenzephalic Vertebrate Specimen
HINWEIS: Der Artikel zeigt die Anwendung des Protokolls auf einer C57BL6/J, 10 Wochen alt, 25 g, männliche Maus.
<ol><li>Bereiten Sie zwei 15 ml konische Rohre und ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr mit 5 ml bzw. 1 ml MV-1 Lösung pro Probe vor. Rohre auf Eis halten.</li>
	<li>Anästhesisierung<ol>
<li>Anästhesisieren Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion eines Ketamin-, Xylazin- und Acepromazin-Anästhetikum-Cocktails bei 100/10/3 mg pro kg Körpergewicht und sprühen Sie mit 70% Ethanol. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie das Fehlen von palpebralen und Pedalreflexen bewerten, indem Sie ein Auge berühren bzw. einen Fuß kneifen.</li>
		<li>Tauben durch Einatmen von 5% Isofluran mit einem Induktionsanästhesiekasten anästhesieren.</li>
		<li>Anästhetisieren Sie Fische und Frösche in 1% Tricaine entweder in einem Fisch, der Wassertank oder Amphibienringer-Lösung(Tabelle der Materialien) hält.</li>
		<li>Eidechsen durch Abkühlen bei 4 °C vor der Euthanasie anästhesieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enthaupten Sie das Tier mit einer chirurgischen Schere, schälen Sie die Haut mit Zangen, um den Schädel freizulegen, und schneiden Sie mit LaGrange Schere durch das Foramen magnum (Abbildung 1A).</li>
	<li>Sezieren Sie das Gehirn mit einem Spachtel und übertragen Sie auf ein 15 ml konisches Rohr mit MV-1-Lösung. Halten Sie Dieröhre auf Eis.</li>
	<li>Holen Sie die Hypophyse aus der Sella-Turcica des Schädels mit Zange und übertragen Sie auf ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr mit MV-1-Lösung. Halten Sie Dieröhre auf Eis.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haut und den Muskel, um die Wirbelsäule freizulegen. Gliedmaßen, Rippenkäfig und innere Organe ausschneiden (Abbildung 1B).</li>
	<li>Sezieren Sie das Rückenmark durch eine der beiden unten beschriebenen Methoden. Dann in ein 5 ml konisches Rohr mit MV-1 Lösung übertragen. Halten Sie Dieröhre auf Eis.<ol>
<li>Führen Sie die Laminektomie durch Schneiden in eine rostrale bis kaudale Richtung mit laGrange Schere, beginnend durch den Halswirbel Foramen, bis zum Erreichen der Lendenschnur.</li>
		<li>Spülung in kaudaler bis rostraler Richtung im Lendenwirbelforamen mit einer 18 G Nadel und einer 10 ml Spritze, die mit MV-1-Lösung beladen ist (Abbildung 1C,D). HINWEIS: Diese Methode funktioniert nur mit sehr kleinen Proben, meist Nagetieren (<100 g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schneiden Sie mit einem Sezieren den Dur-Sack mit einer Federschere aus dem Rückenmark und entfernen Sie die restlichen Meningen mit einem doppelzackigen Pick (Abbildung 2).</li>
	<li>Übertragen Sie das Gehirn auf eine Petrischale und entfernen Sie die Meningen mit einem doppelzackigen Pick (Abbildung 2A-C).</li>
	<li>Die Olfaktor-Glühbirnen und thalamus mit Zangen, Irisschere und Federschere verbrauchen. Entfernen Sie den Aderhautplexus mit dem doppelzackigen Pick aus allen Hirnventrikeln. Achten Sie darauf, alle Aderhaut plexus zu entfernen. HINWEIS: Der Aderhautplexus und die Olfaktor-Lampen sind eine massive Kontaminationsquelle. Im Gegensatz zum BBB sind diese Kapillaren stark verfälscht und die Ergebnisse der nachfolgenden Experimente werden kompromittiert, wenn sie nicht entfernt werden.</li>
	<li>Mit Zangen, trennen Sie die verschiedenen ZNS-Regionen: Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Sehlappen (nicht auf Säugetierproben) und Hypothalamus.</li>
</ol>3. ZNS Gewebesektion aus einem großen gyrencephalen Wirbeltier
HINWEIS: In diesem Protokoll werden zindertiertes Zinngewebe aus einem Schlachthof verwendet. Daher wird hier keine Anästhesie, Euthanasie oder Nekropsie beschrieben oder gezeigt.
<ol><li>Transport von ZNS-Geweben mit Schweinen in einem 0,946 L (32 oz) Histologiebehälter, der mit MV-1-Lösung beladen ist, in einer Eistruhe/Eimer.</li>
	<li>Entfernen Sie die Meningen mit einem doppelzackigen Pick, Zangen, Irisschere und Federschere aus jedem ZNS-Gewebe. Achten Sie darauf, alle Stücke von Aderhautplexus aus dem Gehirn Ventrikeln zu entfernen.</li>
</ol>4. ZNS Gewebehomogenisierung
HINWEIS: Es ist effizienter, wenn zwei Forscher in den Homogenisierungsprozess einsteigen: einer seziert die Meningen unter dem Stereoskop und der andere homogenisiert das Hackfleisch. Auf diese Weise werden die Gewebe schnell in den Eiskübel zurückgeführt und kalt gehalten.
<ol><li>Platzieren Sie jede CNS-Region auf einer Petrischale mit einer MV-1-Lösung von 1 ml. Mit einer einschneidigen Klinge das Gewebe zerkleinern, um 1–2 mm Stücke zu erhalten.<ol>
<li>Für eine kleine Wirbeltierprobe eine 100 mm x 20 mm Petrischale verwenden.</li>
		<li>Für eine große Wirbeltierprobe verwenden Sie eine 150 mm x 15 mm Petrischale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogenisierung eines kleinen Wirbeltiers (Tabelle 2 und Tabelle 3)<ol>
<li>Übertragen Sie den Kortex, das Kleinhirn, das Hirnstamm, den Sehlappen und das Rückenmark in eine individuelle 10 ml Potter-Elvehjem Glasgewebeschleifmaschine mit einem PTFE-Stößel mit einer Transferpipette von 1 ml MV-1-Lösung. Fügen Sie 5 ml MV-1-Lösung hinzu und homogenisieren Sie jedes Gewebe (ca. 10 Striche). Transfer in einzelne 15 ml konische Rohre. Rohre auf Eis halten. HINWEIS: Für ein kleines Wirbeltier, 5 oder 4, mit oder ohne Sehlappen, werden jeweils 10 ml Potter-Elvehjem-Schleifmaschinen und 15 ml konische Röhren benötigt.</li>
		<li>Hypothalamus und Hypophyse mit Zangen in ein individuelles 1,7 ml-Rohr mit Zangen in eine MV-1-Lösung mit 100 l übertragen und mit einem Glasmikropestle sorgfältig homogenisieren. Spülen Sie jede Mikropestle mit einer MV-1-Lösung von 1 ml. Halten Sie Dieröhre auf Eis. HINWEIS: Für ein kleines Wirbeltier werden 2 Glasmikroschädlinge und 1,7 ml Röhren benötigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogenisierung eines großen Wirbeltiers (Tabelle 4 und Tabelle 5)<ol>
<li>Mit einer Transferpipette das Hackfleisch auf einen 55 ml Potter-Elvehjem Glasgewebeschleifer mit einem PTFE-Stößel übertragen und an einem Oberrührer befestigen. Fügen Sie die Hälfte des empfohlenen Volumens der MV-1-Lösung je nach dem zu homogenisierenden ZNS-Teil hinzu (Tabelle 5).</li>
		<li>Schalten Sie den Oberrührer bei sehr niedriger Geschwindigkeit (ca. 150 U/min) ein und bewegen Sie das Glasrohr vorsichtig für ca. 30 s nach oben und unten.</li>
		<li>Schalten Sie den Overheadrührer aus, fügen Sie weitere MV-1-Lösung hinzu und wiederholen Sie Schritt 4.3.2, bis Sie eine homogene Gülle erhalten.</li>
		<li>Transfer in ein 50 ml konisches Rohr. Halten Sie Dieröhre auf Eis.</li>
		<li>Waschen Sie den Schleifer mit entionisiertem Wasser zwischen jeder ZNS-Gewebehomogenisierung. HINWEIS: Für ein großes Wirbeltier 5 oder 4, mit oder ohne weiße Materie, werden jeweils 50 ml konische Röhren benötigt. Ebenso werden zwei (2) 15 ml konische Röhren für den Hypothalamus und die Hypophyse benötigt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Mikrogefäßreinigung
<ol><li>Zentrifugengewebe homogenate aus Schritt 4.2.1, 4.2.2 oder 4.3.4 bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C. Auf der Oberseite der Pellets der rötlichen Mikrogefäße bildet sich eine große weiße Schnittstelle von Myelin. Entsorgen Sie die Überräube.<ol>
<li>Kleine Wirbeltierprobe (Tabelle 2 und Tabelle 3)<ol>
<li>Setzen Sie die Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm-, Sehlappen- und Rückenmarkspellets in 5 ml eiskalter MV-2-Lösung mit einer 5 ml serologischen Pipette (10 Spülungen) wieder auf. Fügen Sie 5 ml eiskalte MV-2-Lösung zu jeder Suspension hinzu und mischen Sie sorgfältig, indem Sie die Rohre umdrehen.</li>
			<li>Den Hypothalamus und die Hypophysenpellets mit 1 ml MV-2-Lösung aussetzen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Große Wirbeltierprobe (Tabelle 4 und Tabelle 5)<ol>
<li>Fügen Sie 20 ml eiskalte MV-2-Lösung in die Kortex-, Kleinhirn-, Hirnstamm- und Rückenmarksmikrovessel-Pellets. Setzen Sie die Pellets durch Mischen auf einem Röhrenrevolver-Shaker wieder auf, rühren Sie bei 40 U/min für 5 min. Gleichgewichten sie die Volumen der konischen Röhren von Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmarkssuspensionen, indem Sie weitere MV-2-Lösung hinzufügen.</li>
			<li>Den Hypothalamus und die Hypophysenmikrovesselpellets in 5 ml MV-2-Lösung mit einer 5 ml serologischen Pipette (10 Spülungen) wieder aufsetzen. Fügen Sie 5 ml eiskalte MV-2-Lösung zu den Suspensionen hinzu und mischen Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr umdrehen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifuge bei 4.400 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
	<li>Lösen Sie vorsichtig die dicke und dichte Myelinschicht an der Flüssigkeitsschnittstelle von den Wänden jedes Rohrs, indem Sie die Rohre langsam drehen und den Überstand an den Wänden entlang bewegen lassen.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Myelin- und Flüssigkeitsschnittstelle und bauchen Sie die Innenwand jedes Rohres mit einem Spachtel, der mit einem papierarmen Papiertuch umwickelt ist. Bei kleinen Wirbeltierproben entfernen Sie die Myelinschicht aus jedem Hypothalamus und Hypophysenrohr, indem Sie sorgfältig mit einer Transferpipette absaugen.</li>
	<li>Überschüssige Flüssigkeit mit einem verdrehten Low-Lint-Papierabwischen auswischen. Setzen Sie jedes Pellet mit 1 ml MV-3-Lösung mit niedrigbindenden Spitzen aus. Rohre auf Eis halten.</li>
</ol>6. Mikrogefäß-Elution und Filtration
<ol><li>Gießen Sie eiskalte MV-3-Lösung in einzelne Becher für jede ZNS-Region. Bei 4 °C aufbewahren.<ol>
<li>Für kleine Wirbeltierproben 10 ml MV-3 Lösung pro 50 ml Becher verwenden. Insgesamt 6–7 Becher sind notwendig, je nachdem, ob der optische Lappen enthalten ist oder nicht.</li>
		<li>Verwenden Sie für große Wirbeltierproben 30 ml MV-3 Lösung pro 100 ml Becher. Insgesamt 6–7 Becher sind notwendig, je nachdem, ob weiße Materie enthalten ist oder nicht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie ein Zellsieb auf ein 50 ml konisches Rohr. Verwenden Sie eine pro CNS-Region. Verwenden Sie ein 100-m-Sieb für den Kortex, den Hirnstamm, den Sehlappen, das Rückenmark und die Hypophyse. Verwenden Sie ein 70-m-Zellsieb für Kleinhirn und Hypothalamus.</li>
	<li>Befeuchten Sie jedes Sieb mit 1 ml eiskalte MV-3 Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie den in Schritt 5.5 vorbereiteten Suspensionen mit einer serologischen Pipette beim Mischen weitere MV-3-Lösungen hinzu, um Aggregate zu vermeiden. Laden Sie Mikrogefäße vorsichtig auf das Sieb. Mit eiskalter MV-3-Lösung abspülen.<ol>
<li>Für kleine Wirbeltierproben(Tabelle 2 und Tabelle 3)10–15 ml MV-3-Lösung mit einer serologischen Pipette hinzufügen und mit 5 ml MV-3-Lösung abspülen.</li>
		<li>Für große Wirbeltierproben 20 ml MV-3-Lösung mit einer serologischen Pipette hinzufügen und mit 10 ml MV-3-Lösung abspülen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montieren Sie die Filtereinheit, indem Sie einen 20-mm-Nylonnetzfilter auf einen modifizierten Filterhalter (Abbildung 2D), einen pro CNS-Bereich, legen.<ol>
<li>Für kleine Wirbeltierproben(Tabelle 2 und Tabelle 3)verwenden Sie 25 mm modifizierte Filterhalter für Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm, Sehlappen und Rückenmark. Verwenden Sie 13 mm modifizierte Filterhalter für den Hypothalamus und die Hypophyse.</li>
		<li>Für große Wirbeltierproben(Tabelle 4 und Tabelle 5)verwenden Sie modifizierte 47 mm Filterhalter für Kortex, Kleinhirn, Hirnstamm und Rückenmark. Verwenden Sie 25 mm für den Hypothalamus und die Hypophyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platzieren Sie den Filter auf ein 50 ml kegelförmiges Rohr und einen Nassfilter mit 5 ml eiskalter MV-3-Lösung, um sicherzustellen, dass der Puffer den Filterhalter auf das konische Rohr heruntergießt.</li>
	<li>Übertragen Sie die eluierten Mikrogefäße (ab Schritt 6.4) auf den 20-m-Nylonnetzfilter und spülen Sie die Mikrogefäße mit 5–10 ml eiskalter MV-3-Lösung.</li>
	<li>Den Filter mit sauberen Zangen wiederherstellen und in den Becher eintauchen, der die eiskalte MV-3-Lösung enthält, die in Schritt 6.1 vorbereitet wurde.</li>
	<li>Lösen Sie die Mikrogefäße aus dem Filter, indem Sie sie für ca. 30 s sanft schütteln. Für kleine Wirbeltierproben den Bechergehalt in ein 15 ml konisches Rohr gießen. Für große Wirbeltierproben den Bechergehalt in ein 50 ml konisches Rohr gießen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C und setzen Sie das Pellet in 1 ml eiskalter MV-3-Lösung mit einer bindungsarmen Pipettenspitze wieder auf.<ol>
<li>Bei kleinen Wirbeltierproben die Suspension (ab Schritt 6.10) in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 20.000 x g für 5 min bei 4 °C übertragen. HINWEIS: Dieser Spin wird auf einer Tischzentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (20.000 x g) durchgeführt, um eine robuste Ausbeute zu gewährleisten.</li>
		<li>Bei großen Wirbeltierproben die Suspension von Schritt 6,10 in ein 5,0 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen, 4 ml MV-3-Lösung und Zentrifuge bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Immunostaining
HINWEIS: Hematoxylin- und Eosinfärbung (H&E) wurde an Reptilien-, Amphibien- und Fischproben als Proof-of-Concept der Protokolldurchführbarkeit durchgeführt. Daher gibt es keine Empfehlung für die Immunkennzeichnung für diese Proben.
<ol><li>Entfernen Sie den Überstand aus den Mikrozentrifugenrohren.</li>
	<li>Das Pellet in 1x sterilem PBS mit einer bindungsarmen Pipettenspitze (Materialtabelle )wieder aufsetzen Halten Sie die Mikrogefäße vor der Bildung von Aggregaten durch mehrere Pipetten mehrere Male. Für kleine Wirbeltierproben (Tabelle 3)verwenden Sie je nach Pelletgröße 100 l–2.000 l. Für große Wirbeltierproben (Tabelle 5)verwenden Sie je nach Pelletgröße 1.000 l–4.000 l.</li>
	<li>Übertragen Sie die Mikrogefäße mit einer niedrigbindenden Pipettenspitze auf Brunnenschlitten, wobei Sie darauf achten, sie in die Mitte jedes Brunnens zu stellen und die Seitenwände zu vermeiden.</li>
	<li>Stellen Sie die Brunnenrutschen, unbedeckt, in einem BSC-2, und lassen Sie für 20 bis 30 min bei RT trocknen. HINWEIS: Ein relativ hohes Volumen von 1x PBS wird verwendet, um die Aggregatbildung zu vermeiden. Aus diesem Grund ist es notwendig, die Dias vor der Fixierung trocknen zu lassen, um sicherzustellen, dass die Mikrogefäße von der Poly-D-Lysin-Beschichtung gehalten werden.</li>
	<li>Reste 1x PBS entfernen, indem sie mit einer Transferpipette herauspipettieren, 200 L Mit4% Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen und 30 min bei RT brüten.</li>
	<li>Pipette aus der fixativen Lösung und waschen 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT. HINWEIS: An dieser Stelle wurde eine H&E-Färbung von Fisch-, Amphibien- und Reptilien-ZNS-Mikrogefäßen durchgeführt.</li>
	<li>Fügen Sie dem Bohrspeicher 200 L Blockierpuffer hinzu und brüten Sie 60 min bei 37 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Sperrpuffer mit einer Transferpipette und fügen Sie 200 L des primären Antikörpercocktails in das Antikörperverdünnungsmittel(Materialtabelle )ein. Bei 4 °C über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Den primären Antikörpercocktail auspfeifen und 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT waschen.</li>
	<li>Den sekundären Antikörpercocktail (Tabelle der Materialien) in 1x PBS verdünnt und 2 h bei RT inkubieren, vor Licht geschützt.</li>
	<li>Den Sekundärantikörper-Cocktail auspfeifen und 3x mit 200 l 1x PBS für 5 min bei RT waschen, lichtgeschützt. Nach der letzten Wäsche lösen Sie den Rahmen des Brunnenschlittens und blot-dry überschüssige 1x PBS mit einem niedrigen Fusselpapiertuch.</li>
	<li>Fügen Sie ein Coverslip, flüssiges Antifade-Mountant-Medium und 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für die kernnukleare Färbung hinzu. Über Nacht bei RT vor Licht geschützt trocknen lassen.</li>
	<li>Nach dem Trocknen bei 4 °C vor Licht geschützt halten, bis sie für die konfokale Mikroskopie und Datenerfassung bereit sind.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die BBB enthält die einzigartigen Eigenschaften der Gehirn Mikrovaskulatur Endothelzellen gekoppelt durch eine anspruchsvolle Architektur von engen-, Adheren-, "Peg-Socket"-Kreuzungen und Haftungs-Plaques kritisch für ZNS-Homöostase2,3,19. Endothelzellen Eigenschaften werden induziert und gepflegt durch Pericyten und die umgebenden Astroglia Endfußprozesse2,3,...

Unser Gehirn ist das wichtigste Organ in unserem Körper. Aus diesem Grund ist es eine Priorität, die Homöostase des Gehirns trotz externer Faktoren zu halten, die eine Abweichung von der Normalität auslösen können. Einigen Gelehrten zufolge entwickelten Wirbeltierevoretwa 400 bis 500 Millionen Jahren das, was wir heute als Blut-Hirn-Schranke (BBB)2,3bezeichnen. Dieser schützende "Zaun" übt den größten Einfluss auf die Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) aus und wirkt, indem er den Transport von Ionen, Molekülen und Zellen zwischen Blut und ZNS-Parenchym streng reguliert. Wenn die BBB gestört ist, wird das Gehirn anfällig für toxische Exposition, Infektion, und Entzündungen. Daher, BBB Dysfunktion ist verbunden mit vielen, wenn nicht alle, neurologische und neuroentwicklungsbedingten Störungen4,5,6.
Die ausgeklügelte Funktion des BBB wird der einzigartigen ZNS-Mikrovaskulatur zugeschrieben, die von der neurovaskulären Einheit (NVU)2,3angepasst wird. Hochspezialisierte Endothelzellen, Pericyten und astrozytäre Endfüße sind die zellulären Komponenten der NVU2,3. Die von diesen Zellen erzeugte extrazelluläre Matrix ist auch für die NVU- und BBB-Physiologie2,3von wesentlicher Bedeutung. Obwohl wesentliche zelluläre und molekulare Komponenten der NVU unter Wirbeltieren konserviert werden, wird Heterogenität zwischen Ordnungen und Arten7,8berichtet. Technische Einschränkungen behindern jedoch unsere Fähigkeit, diese Unterschiede in der Neurobiologie, Biomedizin oder translationalen Forschung vollständig zu berücksichtigen.
Aus diesem Grund haben wir eine CNS-regionsspezifische Mikrogefäß-Isolationsmethode erweitert, um sie auf zahlreiche Arten aus allen fünf Wirbeltiergruppen anzuwenden: Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere. Das Protokoll wird für die Anwendung an klein-lissenzephalischen und großkreiselzephalen Wirbeltieren beschrieben, einschließlich Arten mit translationaler Relevanz9. Darüber hinaus schließen wir andere Regionen des ZNS ein, die in diesem Zusammenhang noch nicht untersucht wurden, aber für die Neurophysiologie relevant sind und enorme klinische Auswirkungen haben: Hypothalamus, Hypophyse und weiße Materie. Schließlich haben wir die Fähigkeit dieser Isolationsmethode als zuverlässiges Werkzeug getestet, um Veränderungen der Proteinexpression entlang der NVU und/oder BBB9,10,11zu identifizieren. Als Proof-of-Concept haben wir gezeigt, wie Veränderungen der VCAM-1- und JAM-B-Expression während der EAE mithilfe der Isolationsmethode gefolgt von Immunfluoreszenz bestimmt werden können.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>Wird zum Blockieren und Antikörperverdünnungsmittel verwendet.</td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15713-S</td><td>Wird als Fixiermittel verwendet (4% PFA)</td></tr><tr><td>70.000 MW Dextran</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>Wird für MV-2-Lösung verwendet</td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11006-12</td><td>Wird zur Entfernung von Muskeln und Haut</td>verwendet</tr><tr><td>Adson-Pinzette, Studentenqualität</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td>Wie oben, aber billigeres</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Wird für MV-3-Lösung, Blockierung und Antikörperverdünnungsmittel</td></tr><tr><td>verwendet Corning 100 &mu; m Cell Sieb</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &mu; m Cell Sieb</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Deskwork Low-Binding Spitzen</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>Wie unten, aber günstiger.</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysin</td><td>F& Technik D</td><td>3439-100-01</td><td>Wird für die Objektträgerbeschichtung</td></tr> verwendet <tr><td>Esel Anti-Ziegen IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ratte IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Doppelzinkiger Gewebepickel</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>Wird zur Entfernung von Hirnhäuten und Aderhautplexus</td></tr><tr><td>verwendet Dumont #3c Pinzette</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>Wird für die Handhabung von empfindlicherem und/oder kleinerem ZNS-Gewebe (wie Hypophyse) verwendet.Dumont</td></tr> <tr><td>#7 Pinzette</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Wird für die Dissektion und Handhabung von ZNS-Geweben</td></tr><tr><td>verwendet Dumont #7 Pinzette, Student</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>Wie oben, aber billiger</td></tr><tr><td>ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Tips</td><td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>Bessere Qualität als die oben genannten Tips (teurer).</td></tr><tr><td>Extra feine Graefe Pinzette, gezahnt</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>Wird für die Knochenentfernung</td></tr><tr><td>verwendet Feine Schere, scharf</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Wird zur Entfernung von Schweine- und Makaken-Duralsack</td></tr> verwendet <tr><td>Glasstößel 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen Tissue Grinder Homogenisator, Packung mit 10</td> Stück <td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>Wird für kleine Tiere, Hypothalus und Hypophyse verwendet.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-CXCL12, biotinyliertes</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung: 1:20.</td></tr><tr><td>Ziege Anti-JAM-B</td><td>R& D</td><td>AF1074</td><td>Wird als primärer Antikörper zur Beurteilung der Neuroinflammation verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Anti-Maus-Ziege IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Ziege anti-PDGFR&beta;</td><td>Forschung & Forschung D</td><td>AF1042</td><td>Wird als Primärantikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Ratte IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>Wird als Sekundärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette, gebogene Spitze, 1X2 Zähne</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>Verwendung zum Halten und Schütteln von Nylonfilternetzen</td></tr><tr><td>HBSS, 1X Puffer mit Calcium und Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>Verwendet für MV-1 Lösung</td></tr><tr><td>HEPES, 1M Flüssigpuffer</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td>Verwendet für MV-1 Lösung</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-Biotin-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>Glykoprotein, isoliert aus der Hülsenfrucht Griffonia simplicifolia, das D-Galactosylreste der Glykokalysx der Endothelzellen bindet. Wird für ZNS-Mikrogefäße von Vögeln und Schweinen verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>LaGrange Schere, gezahnt</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Zur Schädeldissektion und Laminektomie (außer bei Schweinen und Makaken)</td></tr><tr><td>Millicell EZ Objektträger 8-Well-Gerät</td><td>Millipore Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Maus anti-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäße aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Maus anti-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-CD31</td><td>R& D</td><td>BBA7</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen von Primaten verwendet. Empfohlene Konzentration: 16,5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Maus Anti-NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Maus anti-&alpha;SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäße aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Nylon-Filternetz, Rolle</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>Lasergeschnittene Filternetzscheiben mit einem Durchmesser von 13 mm. Wird für kleine Tiere, Hypothalus und Hypophyse verwendet.</td></tr><tr><td>Nylon-Filternetze, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>Wird für die meisten kleinen Wirbeltiere im ZNS-Gewebe verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse. Wird für Makaken und Schweine, Hypothalamus und Hypophyse verwendet.</td></tr><tr><td>Nylon-Filternetze, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>Wird für ZNS-Gewebe von Makaken und Schweinen verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse.</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Reagenz mit DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>Wird zum Eindecken von Objektträgern verwendet.</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäße aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-LSR</td><td>Millipore Sigma SAB2107967</td><td></td><td>Wird als Primärantikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäße aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-OSP</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 1 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Kaninchen anti-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Ratten-Anti-CD31</td><td>Becton Dickinson BD</td><td>550274</td><td>Wird als primärer Antikörper für murine ZNS-Mikrogefäße verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Ratten-Anti-GFAP</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>Wird als primärer Antikörper auf ZNS-Mikrogefäßen aus allen Proben verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:200.</td></tr><tr><td>Ratten-Anti-VCAM-1</td><td>Becton Dickinson BD</td><td>553329</td><td>Wird als primärer Antikörper zur Beurteilung der Neuroinflammation verwendet. Empfohlene Konzentration: 5 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Sterile Ringer's Solution, Frog</td><td>Aldon Corporation</td><td>IS5066</td><td>Wird für die Amfibianästhesie</td></tr><tr><td>verwendet Streptavidin-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>Wird als Sekundärantikörper zur Markierung biotinylierter Primärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:500.</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>Wird als Sekundärantikörper zur Markierung biotinylierter Primärantikörper verwendet. Empfohlene Verdünnung von 1:500.</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere, scharf</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>Wird zur Entfernung von Muskeln und Haut</td></tr> verwendet <tr><td>Chirurgische Schere, scharf-stumpf</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Wird zur Enthauptung verwendet (außer Schweine und Makaken)</td></tr><tr><td>Swinnex Filterhalter, 13 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>Modifiziert durch Lasercut. Wird für kleine Tiere, Hypothalus und Hypophyse verwendet.</td></tr><tr><td>Swinnex Filterhalter, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>Modifiziert durch Lasercut. Wird bei den meisten kleinen Wirbeltieren im ZNS-Gewebe verwendet, mit Ausnahme von Hypothalamus und Hypophyse. Wird für Makaken und Schweine, Hypothalamus und Hypophyse verwendet.</td></tr><tr><td>Swinnex Filterhalter, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>Durch Laserschneiden modifiziert. Wird für ZNS-Gewebe von Makaken und Schweinen verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>Wird als Blockierungs- und Antikörperverdünnungsmittel verwendet.</td></tr><tr><td>Wheaton 120 Vac Überkopfrührer</td><td>VWR (Lieferant DWK Life Sciences)</td><td>62400-904 (DWK #903475)</td><td>Wird für ZNS-Gewebe von Makaken und Schweinen mit 55 mL Gewebeschleifer verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse.</td></tr><tr><td>Wheaton Potter-Elvehjem Gewebeschleifer mit PTFE-Stößel, 10 mL</td><td>VWR (Lieferant DWK Life Sciences)</td><td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>Wird für die meisten kleinen Wirbeltiere im ZNS-Gewebe verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse. Wird für Makaken und Schweine, Hypothalamus und Hypophyse verwendet.</td></tr><tr><td>Wheaton Potter-Elvehjem Gewebemühle mit PTFE-Stößel, 55 mL</td><td>VWR (Lieferant DWK Life Sciences)</td><td>14231-372 (DWK #357994)</td><td>Wird für ZNS-Gewebe von Makaken und Schweinen verwendet, außer Hypothalamus und Hypophyse.</td></tr></tbody></table>

zuverlässige isolierung von mikrogefäßen des zentralen nervensystems über fünf wirbeltiergruppen hinweg

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Die Isolierung von Mikrogefäßen aus dem Zentralnervensystem (ZNS) wird häufig durch die Kombination von kortikalem Gewebe von mehreren Tieren, meist Nagetieren, durchgeführt. Dieser Ansatz begrenzt die Abfrage von Eigenschaften der Blut- und Hirnschranke (BBB) auf den Kortex und lässt keinen individuellen Vergleich zu. Dieses Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung einer Isolationsmethode, die den Vergleich der neurovaskulären Einheit (NVU) aus mehreren ZNS-Regionen ermöglicht: Kortex, Kleinhirn, Optiklappen, Hypothalamus, Hypophyse, Hirnstamm und Rückenmark. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll, das ursprünglich für murine Proben entwickelt wurde, erfolgreich für den Einsatz an ZNS-Geweben kleiner und großer Wirbeltierarten angepasst, von denen wir auch Mikrogefäße aus weißer Materie der Gehirnhälfte isolieren können. Diese Methode, in Kombination mit Immunolabeling, ermöglicht die Quantifizierung der Proteinexpression und einen statistischen Vergleich zwischen Individuen, Gewebetyp oder Behandlung. Wir haben diese Anwendbarkeit bewiesen, indem wir Veränderungen der Proteinexpression während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), einem murinen Modell einer neuroinflammatorischen Erkrankung, Multipler Sklerose, bewertethaben. Zusätzlich könnten Mikrogefäße, die mit dieser Methode isoliert werden, unter anderem für nachgelagerte Anwendungen wie qPCR, RNA-seq und Western Blot eingesetzt werden. Auch wenn dies nicht der erste Versuch ist, ZNS-Mikrogefäße ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder enzymatischer Dissoziation zu isolieren, ist es in seiner Fähigkeit für den Vergleich einzelner Individuen und mehrerer ZNS-Regionen einzigartig. Daher ermöglicht es die Untersuchung einer Reihe von Unterschieden, die sonst unklar bleiben können: ZNS-Teile (Cortex, Kleinhirn, optischer Lappen, Hirnstamm, Hypothalamus, Hypophyse und Rückenmark), ZNS-Gewebetyp (graue oder weiße Materie), Personen, experimentellen Behandlungsgruppen und Arten.

Mikrogefäße, die aus muriner ZNS isoliert wurden, zeigten alle intrinsischen zellulären Komponenten der neurovaskulären Einheit2,3. Verwendung von Thrombozyten-Endothelzelladhäsionsmolekül-1 (PECAM, auch bekannt als CD31) oder Isolectin IB4 (ein Glykoprotein, das die Endothelzelle Glycocalyx bindet) für Endothelzellen, Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGFR) oder neuron-gliales Antigen 2 (NG2) für Pericyte und Aquaporin-...

Ziel dieses Protokolls ist es, Mikrogefäße aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems von lissenzephalischen und gyrencephalen Wirbeltieren zu isolieren.

Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es den Vergleich der Mikrovaskulatur zwischen verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems sowie zwischen verschiedenen Individuen ermöglicht. Diese Mikrogefäßisolationstechnik kann innerhalb eines einzigen Tages abgeschlossen werden und macht ultrazentrifugation und enzymatische Dissoziation überflüssig. Das Entfernen der Meninges und des Aderhautplexus kann schwierig sein.Achten Sie darauf, langsam und sorgfältig zu arbeiten, um die vollständige Entfernung jedes Gewebes zu gewährleisten. Für die ZNS-Gewebesektion aus einer kleinen lissenzephalen Wirbeltierprobe, legen Sie das geerntete Gehirn in eine 15 Milliliter konische Röhre mit MV-1-Lösung auf Eis, und verwenden Sie Zangen, um die Hypophyse aus der Sellaturcica des Schädels zu holen. Legen Sie die Hypophyse in einem 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr der MV-1-Lösung auf Eis, und entfernen Sie die Haut und den Muskel, um die Wirbelsäule freizulegen.Nach dem Entfernen der Gliedmaßen, des Brustkorbs und der inneren Organe verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Meter-Nadel ausgestattet ist, um die Wirbelsäule mit frischer MV-1-Lösung in kaudaler bis rostraler Richtung

reliable-isolation-central-nervous-system-microvessels-across-five

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt die Isolierung intakter Gefäße aus dem Gehirn einer Maus, die zusammen mit Neuronen und Gliazellen die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bilden. Die isolierten Gefäße können als In-vitro-Modell verwendet werden, um ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns zu untersuchen.

Isolierung von Hirngefäßen von Mäusen: Ein Protokoll zur Isolierung intakter Gefäße aus einer Gehirnprobe von Mäusen

Dieses Video zeigt den Prozess der Isolierung von Gehirn-Mikrogefäßen von euthanasierten Ratten. Es umfasst die Dissektion des Gehirns, die Reinigung des Gewebes und die mechanische Verdauung, gefolgt von einer wiederholten Zentrifugation, um die reine Fraktion der Mikrogefäße zu isolieren.

Eine Methode zur Isolierung neurovaskulärer Einheiten aus dem Gehirn von Ratten

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns sind durch spezifische Verbindungsproteine miteinander verbunden, die eine hochregulierte Barriere zwischen Blut und dem Zentralnervensystem (ZNS) bilden, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen des murinen Gehirns, wie in diesem Protokoll beschrieben, ermöglicht detaillierte in vitro-Studien der BHS.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

Dieses Protokoll beschreibt die wiederholte hypoxische Präkonditionierung oder kurze Exposition gegenüber systemischer Hypoxie, die das Infarktvolumen und die Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem vorübergehenden Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Mäusen reduziert. Es wird auch die duale Quantifizierung des Infarktvolumens und der Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem Schlaganfall beschrieben, um die Wirksamkeit des neurovaskulären Schutzes zu bewerten.

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Reinigung des Gefäßkompartiments des Mäusegehirns ermöglicht. Zu den isolierten Hirngefäßen gehören Endothelzellen, die durch Tight Junctions verbunden und von einer durchgehenden Basallamina umgeben sind, Perizyten, vaskuläre glatte Muskelzellen sowie perivaskuläre Astrogliamembranen.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

Dieses Manuskript beschreibt ein einfaches und reproduzierbares Protokoll für die Isolierung von intrazerebralen Arteriolen (eine Gruppe von Blutgefäßen, die parenchymale Arteriolen, penetrierende Arteriolen und präkapilläre Arteriolen umfasst) aus Mäusen, die in Druckmyographie, Immunfluoreszenz, Biochemie und molekularen Studien verwendet werden sollen.

Isolierung und Kanülierung von Cerebral Parenchymale Arteriolen

Isolierte Gehirn-Kapillaren aus menschlichen Hirngewebe dient als ein präklinischen Modell Barrierefunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein optimiertes Protokoll zur Gehirn-Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe zu isolieren.

Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

In dieser Arbeit werden zwei optimierte Protokolle für die Untersuchung von residenten und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des zentralen Nervensystems, einschließlich des Gehirns, des Rückenmarks und der Hirnhäute, vorgestellt. Jedes dieser Protokolle trägt dazu bei, die Funktion und Zusammensetzung der Zellen zu bestimmen, die diese Kompartimente unter stationären und entzündlichen Bedingungen besetzen.

Isolierung von Geweben des Zentralnervensystems und zugehörigen Hirnhäuten für die nachgeschaltete Analyse von Immunzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

Bis heute sind Protokolle für die gleichzeitige Isolierung aller wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus derselben Maus ein ungedeckter Bedarf. Das Protokoll zeigt ein Verfahren, das in naiven und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mäusen angewendet werden kann, um komplexe zelluläre Netzwerke während der Neuroinflammation zu untersuchen und gleichzeitig die erforderliche Anzahl von Mäusen zu reduzieren.

Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

Erfahren Sie eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Mikrogefäßen aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems bei Wirbeltieren. Diese Technik ermöglicht vergleichende Analysen ohne Ultrazentrifugation.

Zuverlässige Isolierung von Mikrogefäßen des zentralen Nervensystems über fünf Wirbeltiergruppen hinweg

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