Antimikrobielle Charakterisierung der Hochleistungswerkstoffe für Bioengineering-Anwendungen

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Materialtechnik zu beantworten, wie z. B. antimikrobielle Eigenschaften, die für viele biotechnologische Anwendungen sehr wünschenswert sind. Diese Technik kann als einheitliches Protokoll in allen Laboren eingesetzt werden, um weniger erfahrenen Forschern zu helfen, die detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren benötigen, um genaue Ergebnisse zu erzielen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir anfingen, nach antimikrobiellen Protokollen zu suchen, und feststellten, dass es in der Literatur keine detaillierten Protokolle zu dieser Methode gab.

In dieser Studie werden vier fortschrittliche Materialien mit unterschiedlicher chemischer Natur und ein Kontrollmaterial auf ihre antimikrobielle Aktivität getestet. Bereiten Sie jedes Material vor, indem Sie es in Scheiben mit einem Durchmesser von 10 mm schneiden. Als nächstes sterilisieren Sie jede Probe durch Eintauchen in 70%iges Ethanol für 10 Minuten, gefolgt von ultravioletter Strahlung für eine Stunde pro Seite.

Drei verschiedene Mikroorganismen werden verwendet, um die antimikrobielle Aktivität der fortschrittlichen Materialien zu testen. Das grampositive Bakterium, Staphylococcus aureus, das gramnegative Bakterium, Escherichia coli, und die Hefe, Candida albicans. Mit einem sterilen Wattestäbchen resuspendieren Sie einige Kolonien jedes Mikroorganismus in 25 ml tryptischer Sojabrühe oder TSB, die in einem sterilen Zentrifugenröhrchen enthalten sind.

Eine Minute lang vortexen, um eine gleichmäßige Mischung zu erreichen. Messen Sie die Absorption bei 540 nm für jede Mikroorganismenkultur mit einem Spektralphotometer. Passen Sie die Konzentration jedes Mikroorganismus an eine geeignete Anzahl von koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Milliliter an.

Wirbeln Sie die mikrobielle Suspension fünf Sekunden lang vortexen, um die Ausbreitung der Mikroorganismen zu verbessern, und tauchen Sie ein steriles Wattestäbchen kurz in diese mikrobielle Suspension. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus dem Tupfer, indem Sie den Tupfer gegen die Röhrchenwand drücken, in der sich die Kultur befindet. Streichen Sie jede mikrobielle Brühesuspension mit dem sterilen Wattestäbchen gleichmäßig in drei Ebenen auf die Oberfläche eines tryptischen Soja-Agars oder einer TSA-Platte, um die gesamte Oberfläche mit dem Mikroorganismus zu bedecken.

Lassen Sie die Platten nach der Impfung fünf Minuten trocknen. Lassen Sie die mikrobiellen Brühesuspensionen auf der Tischplatte, um sie später zu verwenden, um die Konzentration und Reinheit der mikrobiellen Suspension zu überprüfen. Sterilisieren Sie eine Pinzette, indem Sie sie in ein Becherglas mit 96% Ethanol tauchen und dann mit einem Alkoholbrenner abflammen.

Platzieren Sie die zu testenden Probenscheiben mit der sterilen Pinzette in der Mitte der TSA-Platten. Inkubieren Sie die TSA-Platten in umgekehrter Position bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Um die Ergebnisse des Diffusionstests zu analysieren, messen Sie den Durchmesser der Inhibitionszone und den Durchmesser der Probenscheibe mit einem digitalen Messschieber oder durch Aufnahme eines Fotos und Verwendung einer geeigneten Bildverarbeitungssoftware.

Dieses Verfahren ist notwendig, um zu überprüfen, ob die zuvor ermittelten mikrobiellen Konzentrationen korrekt sind, und um sicherzustellen, dass keine mikrobielle Umweltkontamination vorliegt. Geben Sie steriles TSB unter Verwendung einer Mikropipette mit geeigneten autoklavierten Spitzen und aseptischen Bedingungen in sterile Mikrozentrifugenröhrchen ab. Fügen Sie eine Probe hinzu, die als Negativkontrolle verwendet wird.

Führen Sie sechs dezimale Reihenverdünnungen mit den mikrobiellen Brühesuspensionen durch, die zuvor zum Streifen der TSA-Platten verwendet wurden. Mit einem vorsterilisierten Drigalski-Spatel 100 l jeder ausgewählten Verdünnung auf eine TSA-Platte verteilen. 100 l TSB-Medium ohne Mikroorganismen als Negativkontrolle auf eine TSA-Platte verteilen.

Inkubieren Sie die TSA-Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien, um zu überprüfen, ob die KBE pro Milliliter der zuvor ermittelten entspricht. Überprüfen Sie die negative Kontrollplatte, um sicherzustellen, dass keine mikrobielle Umweltkontamination vorliegt.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die verschiedenen Mikroorganismen, die in TSB getestet werden sollen, über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius kultivieren. Messen Sie am folgenden Tag den OD540 jeder Übernachtkultur und verdünnen Sie dann jede Kultur in 20 ml TSB in einem vorsterilisierten 50-ml-Zentrifugenröhrchen auf eine Konzentration von etwa zehn bis sechs KBE pro Milliliter. Legen Sie vier Disks mit jedem Materialtyp und vier Kontrollplatten in separate Vertiefungen einer sterilen 48-Well-Platte ein.

Pipettieren Sie 150 l der mikrobiellen Suspension auf jede Scheibenoberfläche. Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang im 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Nachdem die 48-Well-Platte 24 Stunden lang inkubiert wurde, pipettieren Sie 850 l steriles PBS auf die Oberfläche jeder der vier Probenplatten und vier Kontrollplatten und mischen Sie es mit der mikrobiellen Suspension.

Entnehmen Sie jede mikrobielle PBS-Suspensionsmischung und jede Scheibe von der 48-Well-Platte und geben Sie sie in ein vorsterilisiertes 15-ml-Röhrchen. Wirbeln Sie die mikrobiellen Suspensionsmischungen und Scheiben von PBS eine Minute lang ein. Fünf Minuten lang bei 50 Hz beschallen und erneut eine Minute lang vortexen, um sicherzustellen, dass keine lebensfähigen Mikroorganismen an der Materialoberfläche haften bleiben.

Führen Sie dezimale serielle Verdünnungen der beschallten Kulturen und sterilen Mikrozentrifugenröhrchen durch, die TSB enthalten. Verteilen Sie 100 l jeder Verdünnung auf einer TSA-Platte und inkubieren Sie die Platten aerob bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Nach 24 Stunden wird die Anzahl der Kolonien gezählt und diese Zahl in KBE pro Milliliter ausgedrückt.

Die Ergebnisse der Kontaktmethode werden dann analysiert, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Ergebnisse der Agarscheiben-Diffusionstests zeigen eine nicht-antimikrobielle Aktivität für das erste Material und eine zunehmende antibakterielle Aktivität gegen S. aureus und E. coli für die anderen drei Materialien. Dieses Diagramm zeigt den normierten Halo für jede Materialscheibe im Vergleich zu S.aureus und E.coli nach 24 Stunden Inkubation.

Die Ergebnisse der Kontaktmethode deuten auch auf eine nicht-antimikrobielle Aktivität für das erste Material und eine zunehmende antibakterielle Aktivität gegen grampositive und gramnegative Bakterien für die anderen drei Materialien hin. C ist das lebensfähige Bakterium, das nach 24 Stunden Inkubation von der Kontrollscheibe zurückgewonnen wird. Diese Grafik zeigt den prozentualen Verlust der Lebensfähigkeit der vier Materialien gegenüber S.aureus und E.coli auf den Materialoberflächen.

Probe M1 zeigte keine antimikrobielle Aktivität. Obwohl hier nicht gezeigt, ist keines der vier Materialien in der Lage, das Wachstum der Hefe, Candida albicans, auf andere Weise zu hemmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die antimikrobielle Aktivität mit diesen beiden sich ergänzenden Methoden bestimmen können.