Ermittlung des Potenzials von mesenchymalen Stammzellen Blatt auf die Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms In Vivo

Hallo, ich bin Dr. Alaa Alshareeda vom King Abdullah International Medical Research Center in der Abteilung für Stammzellen und regenerative Medizin. Heute werden wir die Wirkung von mesenchymalen Stammzellen auf die Entwicklung des hepatozellulären Karzinoms am Rattenmodell mit Hilfe der Zellblatttechnologie demonstrieren. Hallo, ich bin Abdullah Almubarak.

Ich arbeite in der experimentellen Chirurgie und im Tierlabor der King Saud University. Wir verwenden die Nacktratte, um Abstoßungsreaktionen nach der Transplantation der Zellschicht zu vermeiden. Dieses Diagramm zeigt das Verfahren zur Zellblatttransplantation an Nacktratten.

In dieser Studie werden acht bis 12 Wochen alte Nacktratten verwendet. Zuerst werden die Ratten niedergeschnitten und mit einem Skalpell ein sieben bis zehn Zentimeter langer Schnitt zwischen der Haut und den darunter liegenden Muskeln gemacht, um die Leber freizulegen. Um das Zellblatt zu übertragen, verwenden Sie eine sterile Membran.

Legen Sie die Membran über die Zellfolie, um sie zu sammeln. Legen Sie dann das Zellblatt mit der Membran über einen Leberlappen. Bau von Zellblechen.

Vor der Aussaat der Zellen 3,5 Zentimeter große, temperaturempfindliche UpCell-Kulturschalen mit unverdünntem FBS beschichten. Das Beschichten von Schalen mit FBS unterstützt das Wachstum der Zellen in der Membranschicht und verhindert den Abbau von Zellen. Achten Sie darauf, dass die gesamte Oberfläche des Geschirrs bedeckt ist.

Inkubieren Sie die Gerichte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft enthält. Am nächsten Tag das überschüssige FBS entfernen und das Geschirr mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur trocknen lassen. Säen Sie mindestens eine Million HepG2-Krebszellen allein oder co-kultiviert mit mesenchymalen Stammzellen in DMEM-Kulturmedium aus.

Das Medium wurde mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt. Das in dieser Studie verwendete Verhältnis von Krebszellen zu mesenchymalen Stammzellen beträgt 4:1. Nach dem Hinzufügen der Zellen das Geschirr vorsichtig schütteln.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft enthält. Ablösung der Zellschicht. Bei 100%Zellkonfluenz nehmen Sie die Schalen aus dem 37 Grad Celsius Inkubator.

Inkubieren Sie nun das HepG2-Krebszellblatt eine Stunde lang bei Raumtemperatur, während Sie das mit mesenchymalen Stammzellen cokultivierte HepG2 30 bis 40 Minuten lang bei 20 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft inkubieren. Während der Inkubationszeit für die Zellblattablösung beginnen Sie mit dem Tierverfahren. Alle Studien an Tieren wurden von der Ethikkommission der König-Saud-Universität genehmigt.

Durchführung des chirurgischen Eingriffs. Überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie den Pedalrückzugsreflex testen. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Jod.

Tragen Sie nun ein zweites Peeling mit Jod auf. Decken Sie das Tier mit einem sterilisierten Tuch ab, um eine Kontamination des Schnitts zu vermeiden. Machen Sie mit einem sterilisierten Skalpell einen etwa sieben bis zehn Zentimeter großen Schnitt zwischen der Haut und den darunter liegenden Muskeln, um die Leber freizulegen.

Trennen Sie den Bauchmuskel mit der flachen hinteren Kante des Skalpells von der Haut. Mit einem Skalpell vorsichtig in die Linea alba stechen und den Schnitt mit einer scharfen Schere verlängern. Transplantation von Zellblättern an der Leber einer Ratte.

Klopfen Sie die Kulturschale vorsichtig über die Bank, um das Blatt von seiner Oberfläche zu lösen. Trennen Sie das Zellenblatt von der Oberfläche der Schale, indem Sie die Blattkanten in einem Halbkreis abkratzen. Entfernen Sie nun vorsichtig das gesamte Nährmedium aus der Schale.

Stellen Sie sicher, dass das Blech unversehrt und unbeschädigt ist, da es sonst nicht verwendet werden kann. Bereiten Sie eine sterile Membran vor, um das Zellblatt zu entnehmen und zu übertragen. Tränken Sie also zuerst die Membran mit normaler Kochsalzlösung, dann entfernen Sie die überschüssige Kochsalzlösung mit einem sterilen Wattestäbchen.

Legen Sie die nasse Membran über das Zellblatt und vermeiden Sie dabei Luftblasen zwischen der Membran und dem Zellblatt. Geben Sie einige Tropfen normale Kochsalzlösung über die Membran und das Zellblatt, um das Material aufzufangen. Lassen Sie die Membran einige Sekunden lang stehen, um sicherzustellen, dass das Zellblatt richtig auf der Membran befestigt ist, und sammeln Sie es dann.

Bereiten Sie nun die Leber für die Transplantation vor. Stellen Sie sicher, dass die Leberoberfläche trocken ist. Legen Sie die Membran mit der Zellfolie über einen einzelnen Lappen der Leber der Ratte.

Fügen Sie einige Tropfen sterilisierte Kochsalzlösung hinzu, um das Zellblatt von der Membran zu lösen. Warten Sie fünf Minuten, bevor Sie die Membran vorsichtig entfernen. Das Zellblatt ist in diesem Video an der Leber zu sehen.

Zum Schluss verschließen Sie die darunter liegenden Muskeln und Hautschnitte mit fünf Nylonnähten. Nach dem Schließen des Schnittes den Operationsbereich mit Betadin desinfizieren. Die Zeit vom Ausschalten der Narkose bis zum Head-up ist variabel, liegt aber in der Regel zwischen fünf und 20 Minuten.

Diese Abbildung zeigt den entwickelten Tumor in der Rattenleber nach einem Monat HepG2-Zellblatttransplantation. Hier wurde der Tumor nach der Transplantation von Zellblatt-hergestellten HepG2-Krebszellen und mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks entwickelt. Während diese den kleinsten entwickelten Tumor in der Rattenleber nach der Transplantation eines Zellblatts aus HepG2-Krebszellen und mesenchymalen Stammzellen der Nabelschnur zeigt, zeigt diese Abbildung die H- und E-Färbung der Rattenleber nach einem Monat Zellblatttransplantation.

Wobei A normale Rattenleberzellen und B Krebs-Rattenleberzellen zeigt. Schlussfolgerung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ein hepatozelluläres Karzinommodell an Nacktratten zu entwickeln, indem Sie die Zellblatttechnologie verwenden. Danke für das Aufpassen.