Name: Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von CD133-positiven Leber-Stammzellen aus murinem Gewebe mittels Verdauung, magnetischer Zellseparation und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht kloniale Expansion und funktionelle Analyse einzelner Zellen.

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Dr. Rountree erkennt aktuelle Unterstützung der Kinder-Miracle Network, National Institute of Health, K08DK080928 und R03DK088013, und die American Cancer Society Research Scholar Award, MGO-11651. Dr. Rountree erkennt an, dass dieses Verfahren ursprünglich entwickelt und verfeinert, während die Kinder Scientist Development Program (NICHD Grant Award K12-HD00850) finanziert.

<ol><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li>
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<li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li>
<li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li>
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<li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology%3A+niche%2C+quiescence%2C+self-renewal%2C+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li>
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<li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li>
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<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li>
<li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2%2FBCRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li>
<li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li>
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<li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li>
<li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver%2C+exocrine+pancreas+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li>
<li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2B+hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li>
<li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li>
<li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li>
<li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li>
</ol>

Dr. Rountree erhält Forschungsförderung von Bayer Pharma. Drs. Ding und Crooks und Frau Dang und Frau VanKirk haben keine Angaben zu melden.

Anders als das blutbildende System, in dem hämatopoetischen Stammzellen sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung einer zellulären Differenzierung, das replacesnormal physiologischen turn-over von Leukozyten, rote Blutkörperchen und Blutplättchen, Leber Stammzellen oder erwachsenen Leber Vorläuferzellen, nicht in normalen Leber zu beteiligen Homöostase. 5,6 Nach einer akuten Schädigung der Leber oder teilweisen Hepatektomie, Hepatozyten, wie differenziert Leber Epithel, durchlaufen mehrere Runden der Proliferation, um die verlorenen Leber Masse zu ersetzen. 5,6 Nur bei chronischen Verletzungen sind Leber-Stammzellen beobachtet zu vermehren. 1,5 -11 Diese Erwachsenen, organspezifische Stammzellen werden vorgeschlagen, um sowohl in Hepatozyten und Cholangiozyten unterscheiden. 1,5-8 Interessanterweise ist die überwiegende Mehrheit von Leberkrebs auf dem Hintergrund der chronischen Verletzung entwickelt, und damit Leber-Stammzellen sind auch die Hypothese zu sein Vorläufer für eine Teilmenge von Leberkrebs. 2-4,12-17 Eine der wichtigsten Herausforderungen für die Zelle Arbeit in der Leber Stammzellen ist die Isolierung von seltenen Populationen von Zellen für die funktionelle Analyse. Zum Beispiel sind die überwiegende Mehrheit der Zellen in der Leber Hepatozyten, die deutlich größer als Cholangiozyten und andere kleinere nicht-Parenchymzellen sind. Durch das Brechen der ganzen Leber in Zellkompartimenten (große Hepatozyten - Parenchym-Fraktion und kleinere Zellen - nicht-parenchymatösen Fraktion) und weitere Auswahl für CD45 negativen Zellen (nicht-hämatopoetischen Zellen), können wir an den Start Population von Stammzellen durch bereichern über 600-fache. 1,18-21 Zu beachten ist, sind wir keineswegs darauf hinweist, dass die CD133 + Population ein 100% reines Stammzellen Bevölkerung ist, sondern ganz klar eine heterogene Population von Zellen mit unterschiedlichen Herkunft und Wiederbesiedlung Potenzial. Eine der wichtigsten Einschränkungen des Feldes Definitionen von Stammzellen und Vorläuferzellen. Wir verwenden den Begriff &quot;Stammzelle&quot; im weiteren Sinne in dieser Arbeit, aber in strengen Definition stellen CD133 + Nicht-Parenchymzellen ein bi-Linie Vorläufer-Population. Angesichts des Stands der aktuellen Stamm-und Vorläuferzellen Forschung in der Leber, gibt dieser Bericht einen Startplatz für die Ermittler, die in diesem Bereich interessiert sind. Als neuer Marker, entstehen wie EpCAM, 22,23 oder Transkriptionsfaktoren, wie Sox9, 24 sie eingebaut werden kann. Zum Beispiel haben wir eine ziemlich hohe Überlappung zwischen EpCAM + Zellen und CD133 + Zellen gefunden. In diesem Bericht detailliert ein Verfahren zur Stammzellen isoliert von normalen murinen Leber sowie chronische Leberschäden Modelle, die zeigen, erhöhte Leberwerte Stammzellproliferation. Diese Methode hat klare Vorteile gegenüber Standard-Immunhistochemie von gefrorenen oder Formalin fixiert Leber als funktionelle Studien mit lebenden Zellen nach der Isolierung durchgeführt werden kann. 1,3,4 Die spezifische Ziel dieses Prozesses ist es, eine relativ reine Population von Leber-Stammzellen, die isolieren können klonal in vitro erweitert werden. Die wichtigste Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Mehrzahl der Zellen isoliert werden nicht nach Durchflusszytometrie lebensfähig (siehe Abschnitt Fehlersuche). Dies ist das Ergebnis der Stunden benötigt, um die Zellen herzustellen, und die zahlreichen Verfahren erforderlich, um die Bevölkerung vor der Isolierung zu verfeinern. Wenn die Leber in einzelne Zell-Suspension für die sofortige FACS-Analyse verdaut ist, wird der Größenunterschied zwischen Hepatozyten und anderen Nicht-Parenchymzellen effektiv FACS Tor Schöpfung unmöglich. Wenn die Leber nicht Parenchymzellen verwendet werden, ohne Abspaltung von hämatopoetischen Zellen, besteht die Gefahr, dass eine erhebliche Anzahl von CD133 + Zellen hämatopoetischen Ursprungs sein kann der Anteil verunreinigen. Weiterhin wird durch die Bearbeitung der Zellen durch die Miltenyi Filter sind nur einzelne Zellen und sehr kleine Gruppen von Zellen gesammelt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Probe nicht verstopfen die FACS Einnahme Nadel. Alternativen für dieses Verfahren sind Änderungen für jede alternative Zelloberflächenmarker, wie CD49f, EpCAM, oder eine Kombination von Markern, wie CD133 + EpCAM + Ein zweiter Bericht veröffentlicht, nutzt einen Dichtegradienten zu Leber-Stammzellen, die aus einem Nicht-Parenchym-Fraktion zu isolieren. Dieses Verfahren erfordert eine Ultra-Zentrifuge (8000 xg), fügt viel Zeit, um das Verfahren, und in unserer Erfahrung, deutlich vor FACS zellulären Ertrag und post-FACS Lebensfähigkeit reduziert. 8 Zukünftige Experimente sind ein breiteres Spektrum von Genexpressionsanalyse, einschließlich fetale Leber Gene, wie HNF3, HNF4α und αfp.In Zusätzlich können Western-Blot-Analyse und Immunzytochemie von exprimierten Proteinen genutzt werden, um RT-PCR-Ergebnisse von Zellen in Kultur zu bestätigen. Ein Thema, zu beachten ist, neuere Arbeiten, die CD133-Expression auf Lebersternzellen identifiziert. 25 Wir haben jetzt routinemäßig Bildschirm unsere Proben für die Marker der Sternzellen (siehe Abschnitt Fehlersuche), und nicht identified signifikante Kontamination in unseren Fraktionen. Dies kann zu unterschiedlichen Techniken der Leber Verdauung und Zellisolation bezogen werden. 2,3,26 Basierend auf der Tatsache, dass die Mehrzahl der Zellen nicht sofort nach FACS isoliert lebensfähig, empfehlen wir, dass die Zellen ausplattiert werden, entweder als Bulk-CD133 + Zellen oder einzelne Zellen, vor Tieren zu verwenden. 5-7 Tage in vitro signifikant verbessert werden Ergebnisse der Tumor-Analyse. Darüber hinaus angesichts der Strapazen des Einzelzellisolierung, sollte diese nur durchgeführt, wenn Kolonien von Bulk-CD133 + isolierten Zellen erweitert werden kann. Eine genauere Diskussion der verschiedenen Kulturbedingungen und Gerüst Proteine, die zur Kultur Leber Stamm-und Vorläuferzellen verwendet werden kann, wurde auch von Lola Reid aus. Diese Arbeit bietet alternative Bedingungen und Modifikationen, die Ermittler in ihrem Forschungsprogramm integrieren kann einmal Basisisolierung Techniken beherrscht werden. 27,28 Dr. Reid Werk bietet auch eine detailliertere Analyse der Linie Biologie und Reifung von Leber-Stammzellen und Vorläuferzellen verpflichtet. In Bezug auf die in vivo Tumor-Analyse hatten wir Erfolg mit frisch isolierten Zellen und Zellen von klonal expandierten CD133 +-Zellen in vitro, in erster Linie mit 1x10 6 Zellen. / - - Und in der Leber bestimmte PTEN - / - Wir haben ontwo genetische Stämme von chronischen Leberschädigung, die MAT1A konzentriert Mäuse, und wir haben beide Nacktmäusen und Wildtyp-Mäusen als Gastgeber für das Tumorwachstum eingesetzt. Nach unserer Erfahrung wird CD133 + Leber-Stammzellen nur Tumoren bilden, wenn sie aus signifikante Schädigung der Leber Modelle, die prä-maligne sind isoliert. Beachten Sie, dass die Tumoren aus CD133 + Zellen gebildet haben sowohl hepatozellulären Karzinoms und Gallengangskarzinom Funktionen, was auf eine Stammzell-oder Progenitorzellen Entstehung der Tumoren. 2-4,29 Follow-up-Arbeit nach Tumoren dokumentiert umfasst Standard-pathologischen Analyse von Tumorgewebe (H &amp; E-Färbung) und immunhistochemische Färbung. Darüber hinaus können Tumoren zerkleinert und für die FACS-Analyse oder re-Kultur verdaut werden. 2-4,30 Zusammenfassend haben wir ein Verfahren zur Isolierung, Expansion und die grundlegende Charakterisierung von CD133 + Leber-Stammzellen und CD133 + Krebsstammzellen detailliert. Trouble Shooting: CD45 Kontamination: Für Schritt 3, wenn es Kontamination von CD45 +-Zellen, die durch Zugabe eines CD45-FITC Ab vor FACS-Analyse und isoliert betrachtet werden können, um sicherzustellen, dass der CD45 Mikrobead Antikörper nicht abgelaufen ist und dass das Filtrat nur während sammelten die Filter wurde in den Magnethalter. Jede Filtrat gesammelt, während der Filter nicht in der magnetischen Halterung wird CD45 +-Zellen enthalten. Niedrige Zellzahl: Für die unverletzten Leber, die Gesamtzahl der CD133 + Nicht-Parenchym isoliert werden können weniger als 10.000. Diese Zellen sind selten in den ruhenden Leber. Für eine chronische Verletzung Modell, wie die DDC 0,1% Ernährung, wird die Zahl deutlich erhöhen zu 100.000 Zellen. Wenn die gesamte Zellzahl liegt deutlich unter diesen Zahlen ist die eine Sache zu prüfen, FACS Ab Färbung. Stellen Sie sicher, dass die CD133 Ab nicht abgelaufen ist, wie arm Färbung in eine schlechte Ausbeute führt. Darüber hinaus empfehlen wir die Durchführung einer FACS-Analyse der Leber nicht Parenchymzellen, um die relative Bevölkerung vor dem Versuch FACS isoliert zu bestimmen. Low Lebensfähigkeit der Zellen nach FACS: Eine der Fragen der Lebensfähigkeit können, wie die Zellen verarbeitet werden und über welchen Zeitraum bezogen werden. Im Idealfall sollte die gesamte Zelle Isolierung, die Schritte 1-4, ohne Verzögerungen zwischen den einzelnen Schritten durchgeführt und abgeschlossen werden am selben Tag. Jede wesentliche Verzögerung zwischen den Schritten 1-4 wird erheblich reduziert die Lebensfähigkeit der Zellen. Ein zweites Problem im Zusammenhang mit Lebensfähigkeit der Zellen kann zum Mantel Druck für FACS Isolierung verwendet bezogen werden. Wir empfehlen die Verwendung einer geringeren Mantel Druck. Schließlich, nachdem die Zellen isoliert werden, sollten sie sofort vergoldet, als nennenswerte Lagerung auf Eis nach dem Sortieren reduzieren auch die Rentabilität. CD133 + Nicht-Parenchym-Heterogenität: Aktuelle Berichte zeigen, dass Lebersternzellen können auch CD133 Expression und haben einige Plastizität. 25 Darum, zusätzlich zur Überprüfung bi-Potenz Gene mit Albumin und Krt19, zusätzliche Überprüfung können Gene mit sternförmigen Zellen, wie saures Gliafaserprotein in assoziiert sind, zählen Ruhestrom Sternzellen und alpha-smooth muscle Aktin und Desmin in aktivierten Sternzellen. 3,4,26 Darüber hinaus stellt die CD133 + Population eine breitere Vorläufer-Population. Die Zugabe eines zweiten Marker, wie zB EpCAM, kann dazu beitragen, die Bevölkerung weiter zu verfeinern und zu begrenzen Heterogenität.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> Mit Phenolrot </td></tr><tr><td> CD45 Microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Hepatozyten-Wachstumsfaktor </td><td> Sigma </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor </td><td> Sigma </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td><td> 1 Gramm </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 Mikron Mesh Sieb </td><td> Fischer </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 Reaktionen </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi LD Spalte </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin beschichteten Platten </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96-Well- </td></tr><tr><td> Trypsin 0,05% EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> RNeasy Micro Kit </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 Spalten für 5x10 5 Zellen oder weniger </td></tr><tr><td> Pharm Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> Konzentration 10X </td></tr></tbody></table>

isolierung von cd133 + leber-stammzellen für die klonale expansion

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Leber-Stammzellen oder ovale Zellen, vermehren sich während der chronischen Leberschädigung, und vorgeschlagen, sowohl in Hepatozyten und Cholangiozyten unterscheiden. Darüber hinaus sind Leber-Stammzellen angenommen, dass sie die Vorläufer für eine Teilmenge von Leberkrebs, Leberzellkarzinom werden. Eines der wichtigsten Herausforderungen für die Zelle Arbeit in einem festen Organ wie die Leber Stammzellen ist die Isolierung von einer seltenen Population von Zellen, für eine detaillierte Analyse. Zum Beispiel sind die überwiegende Mehrheit der Zellen in der Leber Hepatozyten (Parenchym-Fraktion), die deutlich größer ist als Nicht-Parenchymzellen sind. Durch die Anreicherung der spezifischen zellulären Kompartimenten der Leber (zB Parenchym-und Nicht-Parenchym-Fraktionen), und die Auswahl für die CD45-negativen Zellen, können wir an den Start Population von Stammzellen durch bereichern über 600-fold.The proceduresdetailed in diesem Bericht ermöglichen eine relativ seltene Population von Zellen aus einem Organ-effizient sortiert werden. Dieser Prozess kann bis isolateliver Stammzellen aus normalen murinen Leber sowie chronische Leberschäden Modelle, die eine erhöhte Leber Stammzellproliferation demonstrieren genutzt werden. Diese Methode hat klare Vorteile gegenüber Standard-Immunhistochemie von gefrorenen oder Formalin fixiert Leber als funktionelle Studien mit lebenden Zellen nach der ersten Co-Lokalisation Experimente durchgeführt werden können. Um das zu erreichen das Verfahren in diesem Bericht dargelegt wurde, ist eine funktionierende Beziehung mit einem Forschungs-basierte Durchflusszytometrie Kern stark gefördert wie die Details der FACS isoliert in hohem Maße auf spezialisierte Mess-und ausgeprägte Kenntnisse der grundlegenden Durchflusszytometrie Verfahren. Das spezifische Ziel dieses Prozesses ist es, eine Bevölkerung von Leber-Stammzellen, die klonal in vitro erweitert werden kann isolieren.

Hier beschreiben wir die Isolierung von CD133 exprimierenden Leber-Stammzellen und Krebsstammzellen aus ganz murinen Leber, ein Prozess, der Gewebe Verdauung, Anreicherung von Zellen und Durchflusszytometrie Isolierung erfordert. Wir gehören Methoden für fortgeschrittene Einzelzellisolierung und klonalen Expansion.

Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Leberstammzellen oder Ovalzellen proliferieren während einer chronischen Leberschädigung und differenzieren sich voraussichtlich sowohl in Hepatozyten als auch in Cholangiozyten. In ...

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Isolierung von Leberstammzellen, um die klonale Expansion anhand der CD133-Oberflächenexpression nach chronischer Leberschädigung zu untersuchen. Zunächst wird die Leber von einer Maus mit chronischer Leberschädigung entnommen und enzymatisch aufgeschlossen, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Anschließend wird Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzugefügt, um diese zu entfernen, und die Lösung wird auf eine magnetische Säule mit CD45-Antikörpern aufgebracht, um CD45-positive Leukozyten auszuschließen.Die CD45-depletierten Zellen werden anschließend sortiert, um CD133-positive Leberstammzellen anzureichern. Die letztlich isolierten CD133-positiven Leberstammzellen werden kultiviert und expandiert. In-vitro-Analysen der Gen- und Proteinexpression zeigen, dass die isolierten CD133-positiven Stammzellen in der Lage sind, sich sowohl in Hepatozyten als auch in Osteozyten zu differenzieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Kolokalisation von Markern mittels immunhistochemischer Verfahren liegt darin, dass einzelne Zellen isoliert werden können, um sie klonal zu expandieren und funktionell zu analysieren. Um Stammzell- und Progenitorzell-Phänotypen zu bestätigen, wird die Demonstration der Technik von mir selbst und He Dang durchgeführt, einem Doktoranden in meinem Labor. Bereiten Sie alle Puffer 24 Stunden im Voraus in Medium zu und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius.Medien, Instrumente, Filter und Röhrchen sollten steril sein und mit steriler Technik gehandhabt werden. Um das Kontaminationsrisiko zu verringern, wird der Bauchbereich einer euthanasierten Maus mit 70 %igem Ethanol abgewischt. Mithilfe steriler Instrumente wird die Bauchhöhle geöffnet und die Leber blockweise freigelegt.Entfernen Sie die Gallenblase aus der explantierten Leber und überführen Sie anschließend die gesamte Leber in eine geschlossene sterile Schale in einer laminarer Luftstromwerkbank. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um die Leber durch eine Kombination aus mehreren horizontalen und vertikalen Schnitten zu zerkleinern. Teilen Sie die zerkleinerte Leber für eine Minute in vier Teile auf und geben Sie jeden Teil in ein eigenes 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Enzymverdauungslösung. Anschließend stellen Sie die Röhrchen für 45 Minuten in ein 37 °C warmes Wasserbad, das auf ein bis zwei Zyklen pro Sekunde geschaltet ist. Nach der Inkubation die Röhrchen mit 70 % Ethanol abwischen. Anschließend unter einer laminaren Luftströmung die digestierte Lebermasse mittels Pipette durch einen 70-Mikron-Filter geben und das Durchflussvolumen in einer sterilen Schale auffangen, um die parenchymale Fraktion, die die größeren Hepatozyten enthält, zu entfernen. Den Filter mit zwei Milliliter-Aliquoten steriler, supplementierter D-M-E-M-F-12-Medium nachspülen.Verwenden Sie das Gummienteil eines Spritzenstempels, um das verdaute Fruchtfleisch durch den Filter zu pressen. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal, um ein Gesamtvolumen von etwa 20 Milliliter zu erhalten. Teilen Sie das Filtrat auf zwei gleiche 15-Milliliter-Röhrchen auf und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 50 × g und vier Grad Celsius.Nach dem Zentrifugieren. Überführen Sie das SUP natin in ein Gefäß, das mit snat Nummer eins beschriftet ist, und entsorgen Sie das parenchymale Palt. Um als Nächstes die nichthomogene Fraktion, die die Stamm- und Vorläuferzellen enthält, zu gewinnen, zentrifugieren Sie SUP natin Nummer eins mit 50 × g für eine Minute.Überführen Sie das Überstand in ein als Überstand beschriftetes Gefäß. Nummer zwei, und verwerfen Sie erneut das Pellet. Zentrifugieren Sie anschließend Überstand Nummer zwei bei 50 ×g für eine Minute.Nach der Zentrifugation überführen Sie das Überstand in ein Gefäß, das mit Überstand Nummer drei beschriftet ist, und entsorgen Sie das Pellet. Zentrifugieren Sie abschließend den endgültigen Überstand Nummer drei für acht Minuten mit 180 × g, um die nicht parenchymale Fraktion zu erhalten. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie den Überstand und fahren Sie unverzüglich mit dem nächsten Schritt des Protokolls fort, bei dem die roten Zellen und das Pellet lysiert werden. Der für diesen Teil des Verfahrens verwendete Puffer zur Hämolyse roter Zellen sowie der Milli-Q-Wasser-Puffer sollten am Vortag vorbereitet und gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Dokument bei vier Grad Celsius gelagert worden sein.Arbeiten Sie in einer laminaren Luftströmungswerkbank und stellen Sie die Zellen und Lösungen auf Eis. Resuspendieren Sie das nicht parenchymale Pellet aus dem vorherigen Schritt in einem Milliliter eines 1 x verdünnten Puffer zur Lyse der roten Blutkörperchen und überführen Sie es in ein fünf Milliliter fassendes Reagenzglas. Verschließen Sie das Gefäß und mischen Sie es vorsichtig fünf Sekunden lang im Vortex.Ansatz für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach Ablauf von 15 Minuten vor Licht geschützt lagern. Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 200 × g für fünf Minuten; danach verwerfen Sie das Überstand, der lysierte rote Blutkörperchen und Resus enthält.Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskaltem, sterilen Schmelz-Puffer und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 200 × g. Nach dem Zentrifugieren entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter eiskaltem, sterilem Puffer.Milton-e-Puffer. Anschließend 10 Mikroliter dieser Zellsuspension entnehmen und 10 Mikroliter Stripe-Am-Blau zugeben. Die nichtparenchymalen Zellen mit einem Hämozytometer zählen, um die CD45-Hämatopoetischen-Zellen-Ausschaltung aus dem nichtparenchymalen Anteil durchzuführen.Beginnen Sie im laminaren Flusswerk, indem Sie die Zellkonzentration auf 10 hoch sieben bis 10 hoch acht Gesamtzellen in 100 Mikroliter Melty-Puffer einstellen. Achten Sie darauf, die Zellen und Puffer während des gesamten Verfahrens kalt zu halten.Als Nächstes 20 Mikroliter Miltenyi CD45 Mikroperlen-Antikörper pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und 15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation zwei Milliliter Miltenyi-Puffer zugeben und fünf Minuten bei 200 × g zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und bis zu 108 Zellen in einem Milliliter resuspendieren.Milt, einen beliebigen Puffer in einer laminaren Luftströmungsabsaughaube, stellen Sie eine Milt, eine beliebige LD-Magnetsäule in einen Magnethalter. Stellen Sie ein steriles Fünf-Milliliter-Gefäß unter den Filter, um das Filtrat aufzufangen. Geben Sie dann zwei Milliliter auf.Schmelzen Sie einen beliebigen Puffer, um eine Filter-Vorwäsche durchzuführen. Sobald die Wäsche abgeschlossen ist, geben Sie die Zellen auf die Säule. Sobald die Zellsuspension in der Säule ist, geben Sie ein Milliliter geschmolzenen Puffer zu, um die Säule zu waschen; wiederholen Sie diese Wäsche noch zweimal.Verwenden Sie den mit einer Säule gelieferten Kolben nicht, um die Filtrationsgeschwindigkeit zu erhöhen. Nachdem alle Waschschritte durchgeführt wurden, zentrifugieren Sie das gesammelte Filtrat der CD45-depletierten nicht parenchymalen Zellen bei 200 × g für fünf Minuten. Entsorgen Sie die Säule mit den zurückgehaltenen CD45-positiven Zellen.Als Nächstes wird die Durchflusszytometrie durchgeführt, um CD133-positive Zellen zu isolieren. Die Zellen in Miltenyi-Puffer suspendieren, 10^7 Zellen pro 100 µl Aliquot. 100 µl in drei Röhrchen überführen. Zum ersten Röhrchen 2 µl CD133-PE-konjugierten Antikörper hinzufügen, zum zweiten Röhrchen IgG-PE-konjugierten Antikörper als Kontrolle.Das dritte Gefäß mit Zellen dient als nicht angefärbte Kontrolle, die nach der Inkubation 15 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius inkubiert wird, anschließend in zwei Milliliter Färbepuffer resuspendiert, fünf Minuten lang bei 200 × g zentrifugiert. Das Überstand verwerfen und den Pellet in einem Milliliter Milton’scher Puffer resuspendieren. Danach am Durchflusszytometer die nicht angefärbten Zellen und die mit IGPE angefärbten Zellen verwenden, um die Sortierparameter für eine optimierte Gating-Strategie der CD133-positiven Zellpopulation einzustellen.Unser FICO ERYN oder RPE kann im Allgemeinen mit jedem Durchflusszytometer verwendet werden, das einen Laser mit einer Emission von 488 Nanometern besitzt. Isolieren Sie abschließend die CD133-positive Zellpopulation mittels CD133-positiver Gating-Strategie und sammeln Sie die Zellen in steril filtriertem Ovalzellmedium. Die Zellen können nun kultiviert werden, gefolgt von einer klonalen Isolierung und anschließender Echtzeit-PCR zur Beurteilung des Expressionsstatus von CD133.Positive Leberstammzellen wurden aus Wildtyp- und MAT1A-Knockout-Mäusen, wie in diesem Video beschrieben, isoliert, wie hier zu sehen ist. CD133-positive Zellen machen 0,4 % der stark angereicherten, CD45-depletierten, nicht parenchymalen Kontrollfraktion aus, die aus unverletzter Leber von Wildtyp-Mäusen gewonnen wurde. Bei dem genetischen Knockout MAT1A−/−, einem Modell für chronische Leberschädigung, vergrößert sich die CD133-positive Population in derselben stark angereicherten Fraktion um das Zehnfache oder mehr.Nach der Sortierung wurden die Zellen kultiviert und die Klone vergrößert. Dargestellt sind hier Phasenkontrastaufnahmen von vier Kolonien, die von einzelnen CD133-positiven Zellen stammen und auf lamininbeschichteten 96-Well-Platten expandiert wurden. Diese Zellen befinden sich sieben Tage nach der Isolierung und zeigen am Tag sieben kleine, kompakte epitheliale Zellkolonien, die jeweils etwa 25 Zellen umfassen.Die RNA wurde aus den Zellen isoliert, und die Genexpression des Cholangiozytenmarkers CK 19 wurde analysiert, wie in diesen RT-PCR-Experimenten zu sehen ist. Die Genexpression zeigt die Expression des Hepatozytenmarkers Albumin sowie des Cholangiozytenmarkers CK 19, was den Differenzierungspotential der CD133-positiven Zellen bestätigt. Mehrere Wochen nach der initialen Einzelzell-Isolierung und in vitro Expansion von CD133-positiven Zellen wurden je eine Million Zellen aus dem Mat1-A−/−-Modell subkutan in immundefiziente Nude-Mäuse injiziert. Pfeile zeigen Tumore an, die vier Wochen nach der Zellinjektion wachsen.CD133-positive Zellen aus toxisch induzierten chronischen Leberschäden, wie beispielsweise durch CCL4 oder eine 0,1 % DDC-Diät, bilden keine Tumore. Die Tumorbildung in vivo dient dazu, das maligne Potenzial oder das Krebs-Stammzell-Phänotyp innerhalb der Stammzellpopulation zu identifizieren. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in acht Stunden abgeschlossen werden.Nach Durchführung dieses Verfahrens können zusätzliche Faktorenmarker wie EPAM oder andere Faktoren hinzugefügt werden. Techniken wie die Side-Population-Flux können durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Verfeinerung der Oberflächenmarker von Leberprogenitorzellpopulationen. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Leberstammzellen und Progenitorzellen mittels Durchflusszytometrie isoliert werden können.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Tiergewebe gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und die Einhaltung geeigneter Laborverfahren, während Sie diesen Vorgang durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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