Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von Leberstammzellen, um die klonale Expansion unter Verwendung der Zelloberflächenexpression von CD 1 33 nach chronischer Leberschädigung zu untersuchen. Zuerst wird einer Maus mit chronischer Leberschädigung die Leber entnommen und verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu produzieren. Dann wird ein Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzugefügt, um die roten Blutkörperchen zu entfernen, und die Lösung wird auf eine magnetische CD 45-Antikörpersäule aufgetragen, die zur Entfernung von CD 45-Leukozyten enthält.

Die CD 45-depletierten Zellen werden dann sortiert, um CD 1 33-positive Leberstammzellen anzureichern. Schließlich werden isolierte CD 1 33 positive Leberstammzellen kultiviert und expandiert. In vitro Gen- und Proteinexpressionsanalysen zeigen, dass die isolierten CD 1 33-positiven Stammzellen in der Lage sind, sich sowohl in Hepatozyten als auch in Osteozyten zu differenzieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der Kolokalisation von Markern mit immunhistochemischen Techniken, besteht darin, dass einzelne Zellen für die klonale Expansion und funktionelle Analyse isoliert werden können. Um die Phänotypen von Stamm- und Pro-Generator-Zellen zu bestätigen, wird die Technik von mir und ihm demonstriert. Ein Doktorand in meinem Labor. Bereiten Sie alle Puffer 24 Stunden im Voraus in Medien vor und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis alle Lösungen verwendet sind.

Medien, Instrumente, Filter und Schläuche sollten steril sein und mit steriler Technik behandelt werden. Um das Risiko einer Kontamination zu verringern, wischen Sie den Bauchbereich einer euthanasierten Maus mit 70%igem Ethanol ab. Öffnen Sie mit sterilen Instrumenten die Bauchhöhle und erklären Sie die Leber auf Block.

Entfernen Sie die Gallenblase aus der explantierten Leber, übertragen Sie dann die gesamte Leber in eine Laminar-Flow-Haube in einer geschlossenen sterilen Schale in einer Laminar-Flow-Haube, verwenden Sie eine sterile Rasierklinge, um die Leber mit einer Kombination aus mehreren horizontalen und vertikalen Schnitten zu zerkleinern. Teilen Sie die gehackte Leber eine Minute lang in vier Teile und geben Sie jeden Teil in ein eigenes 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Enzymaufschlusslösung. Legen Sie dann die Röhrchen für 45 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad in einem Shaker, der auf ein bis zwei Zyklen pro Sekunde eingestellt ist.

Nach der Inkubation die Röhrchen mit 70% Ethanol abwischen. Pipettieren Sie dann unter einer Laminar-Flow-Haube die verdaute Leberpulpa durch einen 70-Mikron-Maschenfilter und sammeln Sie den Durchfluss in einer sterilen Schale, um die Parenchymfraktion zu entfernen, die die größeren Hepatozyten enthält. Der Filter wird mit zwei Millilitern steril zugesetztem D-M-E-M-F 12-Medium gespült.

Verwenden Sie das Gummiende eines Spritzenkolbens, um das verdaute Fruchtfleisch durch den Filter zu zerdrücken. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal, um ein Gesamtvolumen von etwa 20 Millilitern zu erhalten. Teilen Sie das Filtrat in zwei gleich große 15-Milliliter-Röhrchen auf und zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 50 mal G.

Dem Spin folgen. Übertragen Sie das SUP-Natin in ein Röhrchen mit der Aufschrift Snat Nummer eins und entsorgen Sie das Parenchym-Palt. Als nächstes, um die nicht-parenchymale Fraktion zu sammeln, die die Stamm- und Vorläuferzellen enthält, zentrifugieren Sie SUP Natin Nummer eins, fügen Sie 50 mal G für eine Minute hinzu.

Übertragen Sie den Überstand in ein Röhrchen mit der Bezeichnung Überstand. Nummer zwei, und werfen Sie das Kügelchen wieder weg. Dann zentrifugieren Sie Supernat Nummer zwei bei 50 mal G für eine Minute.

Nach dem Schleudern überträgst du den Überstand in ein Röhrchen mit der Aufschrift Überstand Nummer drei und wirfst das Kügelchen weg. Schließlich zentrifugieren Sie das abschließende SNAT Nummer drei acht Minuten lang für 180 mal G, um eine nicht-parenchymale Fraktion nach dem Schleudern zu erhalten, verwerfen Sie den Überstand und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt des Protokolls fort, in dem die roten Blutkörperchen und das Pellet geschnürt werden. Die für diesen Teil des Verfahrens verwendeten Erythrozytenlyse-, Puffer- und Millene-Puffer hätten am Vorabend zubereitet und bei vier Grad Celsius gemäß den Anweisungen im schriftlichen Begleitdokument gelagert werden müssen.

Arbeiten in einer Laminar-Flow-Haube mit den Zellen und Lösungen auf Eis. Suspendieren Sie das nicht-parenchymale Pellet aus der obigen Stufe in einem Milliliter eines x verdünnten Lysionspuffers für rote Blutkörperchen und übertragen Sie es in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen. Verschließen Sie die Tube und wirbeln Sie sie fünf Sekunden lang vorsichtig ein.

15 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach Ablauf von 15 Minuten vor Licht geschützt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen nach dem Schleudern fünf Minuten lang bei 200-fachem G, um den Überstand, der lysierte rote Blutkörperchen und Reanimation enthält, zu vernarben.

Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Eis, kalt und steril. Schmelzen Sie eine Pufferzentrifuge von 200 mal G für fünf Minuten. Nach dem Schleudern den Überstand entsorgen und das Pellet in einem Milliliter eiskalt und steril resuspendieren.

Milton e buffer. Entfernen Sie dann 10 Mikroliter dieser Zellsuspension und fügen Sie 10 Mikroliter Streifen am Blau hinzu. Zählen Sie die nicht-parenchymalen Zellen mit einem Hämozytometer, um die hämatopoetische Zelldepletion von CD 45 aus der nicht-parenchymalen Fraktion durchzuführen.

Beginnen Sie in der Laminar-Flow-Haube, indem Sie die Konzentration der Zellen auf 10 auf die siebte auf 10 auf die achte einstellen. Gesamtheit der Zellen in 100 Mikrolitern schmelzendem Puffer. Achten Sie darauf, die Zellen und Puffer während des gesamten Eingriffs kalt zu halten.

Tragen Sie anschließend 20 Mikroliter mil auf, einen beliebigen CD 45-Mikrokügelchen-Antikörper pro 10 Millionen Zellen und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation fügen Sie weitere zwei Milliliter mil und einen beliebigen Puffer hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang 200 Mal G. Entfernen Sie nach dem Schleudern die Schlinge und resuspendieren Sie bis zu 10 bis zu einem Achtel der Zellen in einem Milliliter.

Milt, jeder Puffer in einer Laminar-Flow-Haube, platzieren Sie eine Milt, eine beliebige LD-Magnetsäule in einem Magnethalter. Legen Sie ein steriles Fünf-Milliliter-Röhrchen unter den Filter, um das Filtrat aufzufangen. Laden Sie dann zwei Milliliter ein.

Schmelzen Sie den Puffer, um eine Filtervorwäsche durchzuführen. Sobald der Waschvorgang abgeschlossen ist, laden Sie die Zellen auf die Säule. Sobald sich die Zellsuspension in der Säule befindet, fügen Sie einen Milliliter Schmelzpuffer hinzu, um die Säule zu waschen, und führen Sie diese Wäsche zwei weitere Male durch.

Verwenden Sie nicht den mit einer Säule gelieferten Kolben, um die Filtrationsgeschwindigkeit zu erhöhen. Sobald alle Waschgänge durchgeführt wurden, zentrifugieren Sie das gesammelte Filtrat der CD 45-abgereicherten nicht-parenchymalen Zellen fünf Minuten lang bei 200 mal G. Verwerfen Sie die Spalte mit den verbleibenden cd 45 positiven Zellen.

Als nächstes wird eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um CD 1 33 positive Zellen zu isolieren, Zellen in Milt, einem beliebigen Puffer, zu resuspendieren, 10 auf die sieben Zellen pro 100 Mikroliter aliquotiert 100 Mikroliter in drei Röhrchen zum ersten Röhrchen. Geben Sie zwei Mikroliter konjugierten Antikörper CD 1 33 PE in das zweite Röhrchen. Fügen Sie IgG PE-konjugierten Antikörper als Kontrolle hinzu.

Das dritte Röhrchen mit den Zellen dient als ungefärbte Kontrolle, inkubiert 15 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius, nach der Inkubation resuspendiert in zwei Millilitern Färbepuffer und zentrifugiert fünf Minuten lang 200 mal G. Überstand verwerfen und das Pellet in einem Milliliter Milton e Puffer resuspendieren. Als nächstes werden auf dem Durchflusszytometer ungefärbte Zellen und IGPE-Färbezellen verwendet, um die Sortierparameter für ein optimiertes Gating der CD 1 33-positiven Zellpopulation anzupassen.

Unser FICO ERYN oder RPE kann im Allgemeinen mit jedem Durchflusszytometer verwendet werden, das über einen Laser verfügt, der 488 Nanometer emittiert. Zum Schluss isolieren Sie die CD 1 33-positive Zellpopulation mit CD 1 33-positivem Gang und sammeln Sie die Zellen in steril filtriertem ovalem Zellmedium. Die Zellen können nun kultiviert und klonal isoliert werden, gefolgt von einer Echtzeit-PCR, um den potenziellen Status CD 1 33 zu beurteilen.

Positive Leberstammzellen wurden aus Wildtyp- und MAT-Ein-A-Knockout-Mäusen isoliert, wie in diesem Video beschrieben, wie hier zu sehen ist. CD 1 33-positive Zellen machen 0,4 % der hochangereicherten CD 45-depletierten nicht-parenchymalen Kontrollfraktion aus, die aus unverletzter Leber von Wildtyp-Mäusen im genetischen Knockout MAT one A minus minus stammt, das ein Modell für chronische Leberschäden ist. Die CD 1 33-positive Population vergrößert sich in der gleichen hochangereicherten Fraktion um das Zehnfache oder mehr.

Anschließend wurden Sortierzellen kultiviert und Klone expandiert. Gezeigt. Hier sind Phasenkontrastbilder von vier Kolonien, die von einzelnen CD 1 33 positiven Zellen stammen, die auf lamininbeschichteten 96-Well-Platten expandiert wurden. Diese Zellen sind sieben Tage nach der Isolierung und zeigen am siebten Tag kleine kompakte Epithelzellkolonien, wenn die Kolonien etwa 25 Zellen umfassen.

RNA wurde aus den Zellen isoliert und die Genexpression des Cholangio-Site-Markers CK 19 analysiert, wie in diesen R-T-P-C-R-Experimenten zu sehen ist. Die Genexpression zeigt die Expression des Hepatozytenmarkers Albumin und des Cholangio-Site-Markers CK 19, was durch den potentiellen Status von CD 1 33 positiven Zellen mehrere Wochen nach CD 1 33 positive initiale Einzelzellisolierung und -expansion in vitro eins mal 10 bestätigt, bis die sechs Zellen aus dem matteneinen, A minus minus Modell subkutan in immundefiziente Nacktmäuse injiziert werden. Pfeile zeigen Tumore an, die vier Wochen nach der Injektion der Zellen wachsen.

CD 1 33 positive Zellen aus toxininduzierten chronischen Leberschäden wie CCL 4 oder 0,1%DDC-Diät bilden keine Tumoren. Die Tumorbildung von vivo wird verwendet, um das maligne Potenzial oder den Phänotyp von Krebsstammzellen innerhalb der Stammzellpopulation zu identifizieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Fügen Sie nach diesem Verfahren zusätzliche Faktenmarkierungen wie EPAM oder andere Fakten hinzu. Techniken wie die Seitenpopulation flx können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Verfeinerung der Oberflächenmarker von Lebervorläuferzellpopulationen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Leberstamm- und Vorläuferzellen mithilfe der Durchflusszytometrie isoliert werden können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit tierischem Gewebe gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und geeignete Labortechniken getroffen werden sollten.