Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, z. B. wann wirtstötende Virulenzeffektoren in bakteriellen Zellen exprimiert werden und wie die Virulenzzustände von oberflächengebundenen implantonischen Zellen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell und quantitativ ist und die Wirtszellen relativ einfach zu handhaben sind. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass oberflächengebundene implantonische Subpopulationen von Pseudomonas unterschiedliche wirttötende Phänotypen aufweisen.

Um mit dem Anbau von E.coli Stamm BR über Nacht zu beginnen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bringen Sie dann die E.coli-Kultur auf Raumtemperatur. Mit einem Holzstäbchen die Amöbe in 750 l der Kultur imminkulieren.

Geben Sie sofort 700 l der Amöben-E.coli-Mischung auf eine GYP-Platte. Kippen Sie die Platte, um die Kultur gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte zu verteilen. Stellen Sie die Platte dann in eine Box, die eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechterhält.

Inkubieren Sie die Platte in der Box bei 22 °C für vier bis fünf Tage. Nachdem die Inkubationszeit beendet ist, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um Amöbensporen von der Hälfte der Platte zu sammeln. Pipettieren Sie dann auf und ab, um die Amöbe an der Pipettenspitze in 1 ml PS-Medium zu resuspendieren.

Das Impfgemisch in einen 250-ml-Kolben mit 25 ml PS-Medium, ergänzt mit einer antibiotischen antimikotischen Lösung, überführen. Züchten Sie die Amöbe bei 22 °C in einem rotierenden Shaker bei 100 U/min. Nachdem Sie Pseudomonas aeruginosa über Nacht kultiviert haben, verdünnen Sie die Kultur mit PSB-Medien in einer 6 cm großen Petrischale.

Schütteln Sie dann die Kultur auf einem Tischrotator, der auf 100 U/min bei 37 °C eingestellt ist.Zuerst 50 mL 1%agar in DB-Puffer in einem 250-ml-Kolben in die Mikrowelle stellen. Fügen Sie 15 l Calcium AM zu den 15 ml geschmolzenem Agar hinzu und mischen Sie vorsichtig. Gießen Sie die geschmolzene Agarmischung in eine 12 x 10 cm große Glasplatte und lassen Sie den Agar zehn Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren.

Schneiden Sie anschließend mit einem Metalllineal und einem bedruckten Gitter das erstarrte Agarpad in kleinere 1,5 x 1,5 cm große Abschnitte. Stellen Sie sicher, dass das Gel mit Feuchtigkeit versorgt bleibt, bis es gebrauchsfertig ist. Um die an der Oberfläche haftenden Zellen zu isolieren, entfernen Sie anschließend das flüssige Medium aus der Petrischale.

Spülen Sie dann die Schale mit 1 mL Entwicklungspuffer ab, um die Planktonzellen zu entfernen. Um die Virulenz von oberflächengebundenen Bakterienzellen zu testen, fügen Sie 10 l Amöbenzellen aus den zuvor erhaltenen oberflächengebundenen Bakterienzellen hinzu. Um die Planktonzellen zu isolieren, geben Sie 10 L der Kultur in eine frische Petrischale.

Als nächstes wird die Virulenz von Planktonzellen getestet, indem 10 L Amöbenzellen mit den zuvor gewonnenen Planktonbakterien gemischt werden. Legen Sie sofort das kleine Agarpad auf die entsprechende Bakterien-Amöben-Mischung auf der Petrischalenoberfläche. Entfernen Sie dann überschüssige Flüssigkeit, indem Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig pipettieren, und lassen Sie die Schüssel 20 Minuten lang trocknen.

Decken Sie die Form mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie weitere 40 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie schließlich ein Fluoreszenzmikroskop, um Bilder von mindestens 100 Amöbenzellen aufzunehmen. In diesem Protokoll wurde die Virulenz von planktonischen und oberflächengebundenen Pseudomonas aeruginosa-Zellen untersucht.

Die an der Oberfläche befestigte Wildtyp-Amöbe Pseudomonas aeruginosa tötete Amöben, was durch eine runde Amöbenzellform und das Vorhandensein von Calceinfluoreszenz angezeigt wird. Im Vergleich zu planktonischen Zellen hatte der oberflächengebundene Wildtyp Pseudomonas aeruginosa einen hohen Wirtstötungsindex. Planktonzellen wurden von der Amöbe verzehrt, was sich in den amorphen Amöbenzellformen und der relativ geringen Calceinfluoreszenz zeigt.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, einen frischen Vorrat an Kalkstein-AM und Amöbenzellen zu verwenden und die optische Dichte der Amöben genau zu verfolgen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie das Transkriptionsprofiling durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Welche Gene sind in planktonischen und oberflächengebundenen Subpopulationen aktiviert? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den bildbasierten Virulenz-Schnelltest durchführen.