Name: Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Erfahren Sie einen schnellen bildbasierten Virulenz-Assay für Bakterien mit D. discoideum-Amöben. Diese quantitative Methode ermöglicht die Analyse von Wirt-Tötungseffekten mittels Fluoreszenzmikroskopie.

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KP und AS schrieb und das Manuskript überarbeitet. KP durchgeführt die Experimente und die Analyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816), as unterstützt.

Alle experimentelle Verfahren erfolgten an der University of California, Irvine.
1. Puffer und Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Lysogeny Brühe (LB) in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von LB-Miller-Mischung 25 g in 1 L bidestilliertem Wasser (DdH2O vor). Fügen Sie für Petrischalen eine zusätzliche 20 g Agar. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des flüssigen Agar Medium in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Speichern von flüssigen Medien bei Raumtemperatur und Agarplatten bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Glukose Hefe Pepton (Gips) Platten in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen von 1 g D-Glucose, 2 g Pepton, 0,25 g Hefe-Extrakt, 4,2 g KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47 H2O und 25 g Agar in 1 L DdH2 O. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des geschmolzenen Nährbodens in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Shop bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Pepton S (PS) Medium in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen von 10 g Pepton, 7 g Hefe-Extrakt, 15 g D-Glucose, 0,12 g Na2HPO47 H2O, 1,4 g KH2PO4, 40 µg Vitamin B12 , und 80 µg Folsäure in 800 mL DdH2O. kalibrieren eine elektronischen pH-Meter pH 4 und pH 7 Standards verwenden, wenn der pH-Meter nicht innerhalb eines Tages verwendet worden ist.<ol>
<li>Messen Sie den pH-Wert des Mediums PS mit dem pH-Meter. Fügen Sie entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,5. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O. Filter sterilisieren mit 0,22 µm Vakuumfilter und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Gehen Sie vorsichtig mit den pH-Wert Anpassungen durch das Tragen von Schutzausrüstung einschließlich Schutzkleidung, Handschuhe, Augenschutz und stellen Sie Schutz zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 x Entwicklung Puffer Prime vorzubereiten (DB ") Puffer in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von 3,4 g KH2PO4, 13,4 g Na2HPO4 7 H2O und DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 800 mL. Kalibrieren einer elektronischen pH-Meter pH 4 und pH 7 Standards verwenden, wenn der pH-Meter nicht innerhalb eines Tages verwendet worden ist.<ol>
<li>Messen Sie den pH-Wert des Puffers mit dem elektronischen pH-Meter. Passen Sie den pH-Wert 6,5 indem sanft entweder 5 M KOH oder 5 M H3PO4 nach Bedarf an. Die letzte Lautstärke bis 1 L mit DdH2O und durch Autoklavieren zu sterilisieren. Bei Raumtemperatur lagern. Hinweis: Gehen Sie vorsichtig mit den pH-Wert Anpassungen durch das Tragen von Schutzausrüstung einschließlich Schutzkleidung, Handschuhe, Augenschutz und stellen Sie Schutz zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 x Entwicklung Puffer (DB) zu machen, durch Mischen 100 mL 10 x DB "Puffer mit 1 mL sterilisiert 2 M MgCl2und 1 mL 1 M CaCl2sterilisiert. Die letzte Lautstärke zu 1 L in einer 1 L Glasflasche mit einem Autoklaven sterilisiert DdH2O. Store bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie PS:DB Medium in einer 1 L Glasflasche durch Mischen 100 mL sterilisiert PS Medium, 100 mL sterilisiert 10 x DB "Puffer und sterilisierte DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 1 L. Ergänzung mit 1 mL sterilisiert 2 M MgCl2 und 1 mL sterilisiert 1 M CaCl 2. Store bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie die Calcein-AM Lager Lösung durch Zugabe von 50 µL von DMSO auf 50 µg von Calcein-AM in der vom Hersteller gelieferten Kunststoffbehälter. Shop bei-20 ° C.</li>
</ol>(2) Wachstum und Erhaltung der Amöben
<ol><li>Wachsen Sie E. Coli -Stamm B/r17 als Nahrungsquelle für die Amöben in der ersten Wachstumsphase. Streak E. Coli B/r aus einem gefrorenen bestand bei-80 ° C auf eine LB-Agar-Platte gespeichert und Inkubation bei 37 ° C über Nacht um einzelne Kolonien zu erhalten.</li>
	<li>Eine einzige Kolonie von E. Coli B/r in 2 mL LB-Medium zu impfen und über Nacht in einer Bandage oder einem Shaker bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Bringen Sie die Übernachtung E. Coli Kultur auf die Raumtemperatur. Mit einem Holzstab, impfen Sie Amöben aus einem gefrorenen bestand in 750 µL der Übernacht-Kultur bei-80 ° C gehalten. Hinweis: Verwendung D. Discoideum Stamm AX3, axenic Wachstum18dar. Dieser Schritt erfordert keine axenic Wachstum, aber nachfolgende Schritte habe seine Verpflichtung.</li>
	<li>Fügen Sie sofort 700 µL der Amöben -E. Coli -Mischung auf einen Teller Glukose Hefe Pepton (Gips). Verbreitung der Kultur gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte durch Kippen es hin und her und Seite-an-Seite nach Bedarf. Vermeiden Sie die Verwendung von einem Spreader.</li>
	<li>Platzieren Sie die GYP-Platte mit Agar nach oben in eine Box, die hohen Luftfeuchtigkeit führt. Verwenden Sie zwei Einweg-Kunststoff-Behälter (183 x 183 cm x 91 cm) oben auf einander gestapelt. Füllen Sie den unteren Behälter mit ca. 25 mL Wasser und stellen Sie den oberen Behälter mit mehreren 0,5 cm Durchmesser Löcher gebohrt, durch den Boden des Behälters, um Feuchtigkeit aus dem Wasserreservoir in den oberen Behälter verschieben kann.</li>
	<li>4-5 Tage bis Amöbe Sporen beobachtet sind nahe der Oberfläche der Platte (Abbildung 2) wächst inkubieren Sie die GYP Platte und Box bei 22 ° C. Verwenden Sie einen gekühlten Inkubator, um Platten anstatt Inkubation bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Nachdem Sporen gewachsen sind, bleiben sie auf Platten für mehrere Wochen lebensfähig, wenn bei 4 ° c gelagert Speichern Sie die Platten mit Agar Seite nach oben. Nach 3-4 Tagen Inkubation können Zonen Clearing innerhalb des bakteriellen Rasens beobachtet werden, die zeigen des Beginn der Amöbe Sporenbildung.<ol>
<li>Beobachten Sie kleine Amöben Sporen über die Plattenoberfläche nach 4-5 Tagen Inkubationszeit (Abbildung 2). Hinweis: Wachsen Sie nicht die Amöben für länger als eine Woche, da die Qualität der Sporen nach Ablaufen dieser Frist abnimmt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie Amöben Sporen vorzubereiten für das axenic Wachstum der Amöben durch eine sterile 1 mL PIPETTENSPITZE parallel zur Oberfläche der Platte zu fegen. Sporen aus der Hälfte einer 10 cm Petrischale zu sammeln. Hinweis: Berühren Sie die Spitze an die Oberfläche der Agar-Platte wie diese Bewegung große Zahlen von E. Colisammeln wird.</li>
	<li>Aufschwemmen der Amöben an der Spitze der Pipette durch Eintauchen der Spitze in 1 mL PS Medium und sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die beimpfte Mischung in einen 250-mL-Flasche mit 25 mL des Mediums PS ergänzt mit der Antibiotikum-antimykotische Lösung bei 0,25 X Konzentration. Hinweis: Bewahren Sie die Antibiotikum-antimykotische Lösung als 250 µL-Aliquots bei-20 ° C. Vermeiden Sie wiederholte Zyklen der Auftauen und Einfrieren dieser Lösung, da dadurch seine Wirksamkeit verringern kann.</li>
	<li>Amöben axenically bei 22 ° C in einem rotierenden Shaker bei 100 u/min zu wachsen. Für die Virulenz-Assay in Schritt 5 Zellen wachsen zu einer optischen Dichte, gemessen bei 600 nm (OD600) von 0,2 bis 0,5. Hinweis: Dieser Schritt erfordert ca. 3-4 Tage Wachstum ab dem Zeitpunkt der Impfung (Schritt 2.7). Wenn Zellen zu einer höheren Dichte gewachsen sind, verdünnen die Kultur zurück in PS Medium zu einem OD-600 von 0,05 oder niedriger und wachsen wieder zu einem OD-600 von 0,2 bis 0,5.</li>
</ol>(3) das Wachstum von p. aeruginosa
<ol><li>Wählen Sie eine einzelne Kolonie von p. Aeruginosa von eine LB-Platte, in ein 2 mL PS:DB Kultur zu impfen und wachsen über Nacht bei 37 ° C, Sättigung. Hinweis: Fügen Sie die Antibiotikum antimykotische Lösung nicht zu den PS:DB Medien.</li>
	<li>Verdünnen Sie Nacht Kultur 1: 100 oder 1:1,000 in eine 6 cm-Durchmesser Petrischale mit PS:DB. Wenn die Virulenz von planktonischen Zellen ausschließlich untersucht wird ist, wachsen Sie die Kulturen mit herkömmlichen Kultur Röhren statt. Schütteln Sie die Kultur auf ein Benchtop-Rotator bei 100 u/min bei 37 ° c eingestellt</li>
	<li>Ernte-Kulturen zu bestimmten Zeitpunkten auf Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Bereiten Sie bei 30 min bis 1 h vor der Beurteilung der Virulenz eine Agar-Pad, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Hinweis: Virulenz in p. Aeruginosa wird durch ca. 8 h des Wachstums auf Oberflächen induziert.</li>
	<li>Um die Oberfläche angebracht Zellen zu isolieren, entfernen Sie das flüssige Medium aus der Petrischale, waschen Sie sofort mit 1 mL der DB-Puffer, planktonischen Zellen zu entfernen und gehen Sie sofort zum Schritt 5.1. Achtung: Waschen Sie nicht länger als 30 s da dies durcheinanderbringen und Oberfläche angebracht Zellen zu lösen und die Virulenz Messung beeinträchtigen.</li>
	<li>Um planktonischen Zellen zu isolieren, übertragen Sie 10 µL der Kultur von der Petrischale auf einer sauberen Petrischale und gehen Sie sofort zu Schritt 5.1.</li>
</ol>(4) Mikroskopie - Vorbereitung der Agar-Pad
<ol><li>Bereiten Sie Agar Pads ca. 30 min bis 1 h bis Amöben mit p. Aeruginosamischbar sind.</li>
	<li>Mikrowelle 50 mL von 1 % (w/V) Agar in DB-Puffer in einem 250 mL-Kolben. Mix alle 20 s bis Klumpen von Agar verschwinden.</li>
	<li>Kühlen Sie die geschmolzene Agar indem man sie in vorgeheizten 55 ° C Wasserbad für 15 min.</li>
	<li>15 mL des geschmolzenen Nährbodens in einem konischen Rohr 15 µL der Stammlösung Calcein-AM hinzufügen. Mischen Sie durch sanft das Rohr 4 - 5 mal umdrehen und sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in einem Polypropylen 15 mL Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie einen dickes Glas-Container nicht, als dadurch der Agar, vorschnell zu festigen.</li>
	<li>Gießen Sie die flüssigen Agar Mischung auf einer 12 cm x 10 cm Glasplatte und erlauben Sie den Nährboden für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu festigen. Schneiden Sie indem du die Glasplatte über einem gedruckten Raster und schneiden entlang des Rasters ein Metall-Lineal mit erstarrtem Agar-Pad in kleinere Abschnitte von 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Halten Sie das Gel in einer feuchten Box hydratisiert, bis es betriebsbereit ist.</li>
</ol>(5) Mikroskopie - Vorbereitung der Bakterien-Amöbe Probe für die Bildgebung
<ol><li>Um die Virulenz der Oberfläche befestigt Bakterienzellen assay, fügen Sie 10 µL der Amöbe Zellen aus Schritt 2.10 Oberfläche befestigt Bakterien aus Schritt 3.4 hinzu. Hinweis: Diese Schritt beschreibt das Mischen von Amöben mit Bakterien.</li>
	<li>Um die Virulenz von planktonischen Zellen assay, mischen Sie 10 µL der Amöbe Zellen aus Schritt 2.10 mit 10 µL der planktonischen Bakterien aus Schritt 3.5. Hinweis: Waschen Sie die axenically gewachsen Amöbe Zellen (bei einer OD600 von 0,2 bis 0,5) vor dem Mischen mit den Bakterien nicht. Kein Wachstum von E. Coli wird in die Amöbe Kultur durch den Einsatz von Antibiotika-antimykotische Lösung beobachtet werden.</li>
	<li>Legen Sie sofort das 1,5 x 1,5 cm Calcein-AM Agar Pad ab Schritt 4.5 auf die Bakterien-Amöben-Mischung auf der Petrischale Oberfläche. Hinweis: Legen Sie das Agar-Pad auf der Mischung mit einer schnellen reibungslosen Bewegung. Senken Sie das Pad langsam auf die Mischung nicht, da diese Bewegung dazu neigt, Zellen in Richtung der Peripherie und Weg von der Unterseite des Pads schieben. Diese Schritt wird sichergestellt, dass Bakterien und Amöben gleichmäßig sind gemischt, immobilisiert und, dass beide Arten Zelle sind auf der gleichen Ebene beschränkt.</li>
	<li>Sanft pipettieren Sie alle verbleibenden Flüssigkeit umgibt das Agar-Pad, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Lassen Sie die Petrischale für 20 min bei Raumtemperatur trocknen.</li>
	<li>Mit der Petrischale mit einem Deckel decken Sie ab und inkubieren Sie die immobilisierten Amöben-Bakterien-Mischung bei Raumtemperatur für eine zusätzliche 40 min. gehen Sie zu Schritt 6.1. Hinweis: Es ist wichtig, alle Proben für die gleiche Menge an Zeit, wenn der Hintergrund Fluoreszenz erhöht im Laufe der Zeit zu inkubieren. Es empfiehlt sich eine Inkubationszeit von 1 h. Inkubationen länger als 1 h sind weniger reproduzierbar wie Amöben Zellen zu platzen beginnen können.</li>
</ol>(6) Mikroskopie - Bilderfassung
<ol><li>Bild Amöben mit einem Fluoreszenzmikroskop Hellfeld und grün Fluoreszenzbilder erwerben. Verwenden Sie für grüne Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz Protein (GFP) Filter mit 474/27 nm und 525/45 nm für Anregung und Emission, beziehungsweise. Verwenden Sie ein 10 X (≥0.3 numerische Apertur) Ziel der Amöben Image. Hinweis: Die Calcein-AM im Agar bewirkt sterbende Amöben, Fluoreszenz in den grünen Fluoreszenz-Kanal. Gesunde Amöben sind sonst nicht fluoreszierend.</li>
	<li>Einstellen Sie Erfassungszeiten für Phasenkontrast, GFP-Kanäle zu begrenzen Phototoxizität und optimiert den Dynamikumfang des Bildes Intensitäten. Das differential Interferenz Kontrast (DIC) Phasenkontrast zu ersetzen, wenn nötig. Hinweis: Verwenden Sie wenn möglich 100-200 ms Belichtungen für Phasenkontrast und GFP Fluoreszenz. Halten Sie die Einstellungen für Belichtung und Instrument unverändert während des gesamten Experiments. Dies ist entscheidend für die Berechnung des Host-Tötung-Indexes.</li>
	<li>Bilder für mindestens 100 Amöbe Zellen zu erwerben, um gute Statistiken zur Berechnung des Hosts Tötung Index zu erhalten.</li>
</ol>7. Bild-Analyse und Host-Tötung-Index
<ol><li>Durchführen Sie Bildanalyse mit ImageJ.</li>
	<li>Die Phase Kontrast-Image-Datei in ImageJ durch Anklicken Datei öffnen | Offene und das Bild auswählen. Passen Sie den Schwellenwert durch Bild anklicken | Analyse | Schwelle. Passen Sie den unteren und oberen Schwellenwert wählen Sie nur die Intensität Peak(Abbildung 3).</li>
	<li>Konvertieren Sie das Bild in Binary, indem Sie auf Prozess | Binäre | Stellen binäre. Löcher füllen, indem Sie Prozess auswählen | Binäre | Löcher füllen. Hinweis: Mit dem Bild in Abbildung 1 als Quelle, werden Schritte 7.1-7.2 ein Bild erzeugen, in denen die Amöben und Bakterien Oberfläche angebracht als dunkle Bereiche (Abbildung 3B) vorkommen.</li>
	<li>Sicherzustellen, dass die Felder Bereich und bedeutet Grauwert in Analyze geprüft werden | Legen Sie Messungen. Messen Sie die ungefähre Größe der Amöben durch Auswahl des ovalen Tools auf der Hauptsymbolleiste. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme und beachten Sie den Bereich der repräsentativen Amöben.</li>
	<li>Erstellen von Masken für die Amöben durch Klicken auf analysieren | Analysieren Sie Partikel. Geben Sie im Größenfeld des Bereichs, der wird die Amöben unter anderem die Bakterien ausschließen. Wählen Sie Masken im Dropdown-Menü die Option "anzeigen". Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Manager hinzufügen aktiviert ist.</li>
	<li>Klicken Sie auf "OK" und ein Bild zeigt nur die Amöben und ein ROI-Manager Dialogfeld wird angezeigt (Abbildung 3C).</li>
	<li>Die fluoreszenzbild mit Datei öffnen | Offene und die entsprechende Datei auswählen. Wählen Sie alle Regionen im ROI Manager durch Gedrückthalten der Shift-Taste und einem Klick auf jede Region in der Liste (Abbildung 3D).</li>
	<li>Klicken Sie auf Messen , im ROI-Manager. Dadurch öffnet sich ein Ergebnisfenster zeigt den mittleren Intensitätswert jede Amöbe.</li>
	<li>Die Fluoreszenz-Werte für jede Amöbe in einem Tabellenkalkulations-Programm kopieren und die Host Index zu töten, indem man den Durchschnitt aller Fluoreszenz-Werte zu berechnen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine rasche und quantitative Methode zur Virulenz in p. Aeruginosaassay. Dieses Protokoll kann mit anderen Bakterien getestet werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Wachstumsmedium mit der Amöbe Wachstumsbedingungen kompatibel sein sollten. Insbesondere haben wir das Protokoll mit PS:DB als das Bakterienwachstum Medium optimiert. Wenn andere Medien verwendet werden, ist es möglicherweise erforderlich, Wachstumskontrolle Medien nur durchzuführen, bei denen gibt es keine ba...

Bakterielle Infektion gehört zu den führenden Todesursachen in Mensch und Tier1,2. Die Fähigkeit, Virulenz der Bakterien in Kulturen oder Biofilme zu messen ist wichtig in Medizin und Forschung Einstellungen. Hier beschreiben wir eine vielseitige, schnelle und relativ einfache Methode, um bakterielle Virulenz zu quantifizieren. Die Eukaryotische Organismus Dictyostelium Discoideum (Amöben) dient als Modell Wirtsorganismus. D. Discoideum wurde als Host verwendet, um Virulenzfaktoren in Pseudomonas Aeruginosa (p. Aeruginosa)3,4,5 und andere Bakterien6,7 identifizieren ,8 und ist anfällig für weitgehend die gleichen Virulenzfaktoren, die Säugerzellen einschließlich Typ III-Sekretion9,10zu töten. Vorherigen Virulenz-Assays mit D. Discoideum haben im Laufe der Stunden3,4,5über längere Zeit von Bakterien mit D. Discoideum Zellen beteiligt. Hier das Protokoll stellt eine schnelle Methode zur Bestimmung der Virulenz verwenden diese Amöbe. Dieses Protokoll (Abbildung 1) beschreibt wie man: (1) wachsen die Amöben axenically (in Abwesenheit von Bakterien), (2) wachsen Bakterien für den Assay, (3) bereiten Bakterien und Wirtszellen für Mikroskopie, (4) Epifluoreszenz mikroskopie durchzuführen, und (5) analysieren Sie Amöbe Fluoreszenz.
Amöben sind zunächst gestreift von gefrorenen Vorräte und auf eine Rasenfläche von Escherichia coli (E. Coli), angebaut, wo die Amöben Sporen produzieren. Diese Sporen sind abgeholt und in eine angereicherte Medium für axenic Wachstum geimpft. Die Amöben sind durch axenic Wachstum in nährstoffreichen Bedingungen beibehalten, bis sie bereit sind, mit Bakterien für die Beurteilung der bakteriellen Virulenz gemischt werden. Das Überleben oder den Tod der Amöben wird durch die Messung der Fluoreszenz von Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM), die durch intrazelluläre Esterasen abgespalten und, dadurch aktiviert für Fluoreszenz11,12quantifiziert. Live Amöben zeigen wenig oder gar keine Fluoreszenz betont, und sterbende Zellen intensiv fluoreszieren. Dieses Ergebnis ist durch eine kleine oder gar keine Einarbeitung von Calcein-AM gesunden Amöben und Einbeziehung und Spaltung des Substrats im gestressten Amöben13. Dieses Verhalten unterscheidet sich vor allem von Calcein-AM Fluoreszenz in Säugerzellen11,14,15,16.
Bakterien, die für die Virulenz beurteilt werden separat angebaut. Hier beschreiben wir wie Sie messen die Virulenz von opportunistischen Erreger p. Aeruginosa und ausführlich, wie man die Virulenz von planktonischen (Schwimmen) und Oberfläche befestigt Sub-Populationen zu quantifizieren. Dieses Protokoll möglicherweise angepasst, die Virulenz von anderen Bakterien zu testen. Im Abschnitt Vertreter Ergebnisse wir zeigen, dass die Virulenz in Oberfläche angebracht Zellen aktiviert und ist niedrig im planktonischen Zellen, die hieß zuvor13. Virulenz-aktivierte Oberfläche angebracht p. Aeruginosa tötet Amöben, während nicht virulente planktonischen Zellen von den Amöben konsumiert werden. Wenn die Virulenz von planktonischen Bakterien ausschließlich untersucht wird ist, können Bakterien in gewöhnlichen Kultur Röhren anstatt Petrischalen zu verwenden, wie im Protokoll beschrieben kultiviert werden.
Das Wachstum der Amöben und p. Aeruginosa Kulturen muss koordiniert werden, so dass p. Aeruginosa Kulturen die beabsichtigten Wachstumsphase erreichen, während die Amöben im Steady-State in nährstoffreichen Bedingungen wachsen. Dieser Zustand erfordert in der Regel Amöben Kulturen mindestens 1 Tag vor dem verdünnt werden, wenn sie mit Bakterien vermischt werden. Amöben und Bakterien sind immobilisiert mit Agar-Pads sind für 1 h Co inkubierten und abgebildet, mit einer niedrigen Auflösung (10 X, numerische Apertur 0,3) Objektive, grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) filtert und eine Wärmebildkamera. Analyse mit frei verfügbare ImageJ-Software ausgeführt werden kann oder Bildanalyse-Software angepasst. Unsere Analyse erfolgte mittels eigener Software mit einer wissenschaftlichen Analyse Paket13geschrieben. Die Software sollte erstellen Sie eine Maske mit dem Phase Kontrast Bild und die maskierten Bereiche in der fluoreszenzbild Fluoreszenz Werte extrahieren. Fluoreszenz-Werte sind über mindestens 100 Zellen, was zu einer numerischen Host Tötung Index gemittelt.

<table><tbody><tr><td>ReagenzienBacto-Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, dehydriert</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot < 1 mL und lagern bei -20 μg; C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethylester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Calciumchlorid, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Folsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Spezialpepton</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhyroxid</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Stamm AX318</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Stamm B/r17</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 Stamm19</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa & Delta; lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14-abgeleiteter Stamm20</sup</td></tr><tr><td>>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filter&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>Für die Filtersterilisation</td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Vorratsflaschen aus Glas</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Petrischale, 6 cm Durchmesser</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm Polystyrolplatten</td></tr><tr><td>Petrischale, 10 cm Durchmesser</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm Polystyrolplatten</td></tr><tr><td>Kunststoffbehälter mit Deckel</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Quadratische 3-Tassen-Behälter</td></tr><tr><td>Glasplatten</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>Zur Zubereitung von Agarpads. Andere Glasplatten können mit ähnlichen Abmessungen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Holzstäbchen</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Mikroskop-Setup</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 Objektiv&nbsp; 0,3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Mikroskop-Setup</td></tr><tr><td>Fluoreszenzanregungsquelle</td><td>Lumencor</td><td>Sola Light Engine</td><td>Mikroskop-Setup</td></tr><tr><td>Fluoreszenzfilter-Set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&nbsp;</td><td>Aufbau des Mikroskops</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Einrichtung des Mikroskops</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software für die Bildanalyse</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software für die Bildanalyse</td></tr><tr><td>Orbitalschüttler Inkubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Für das Wachstum von Bakterien bei 37 & Grad; C</td></tr><tr><td>Plattformschüttler</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>Für das Wachstum von Amöben bei 22 > C</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Untertisch-Kühlbrutator</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>Für das Wachstum von Amöben bei 22 > C</td></tr><tr><td>Isotemp Wasserbad&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Für die Kühlung von Medien bis 55 & Grad; C</td></tr></tbody></table>

einen schnellen image-basierte bakteriellen virulenz-assay mit amöben

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditionelle bakteriellen Virulenz Tests beinhalten über längere Zeit Bakterien im Laufe von mehreren Stunden auf Wirtszellen. Während dieser Zeit können Bakterien in der Physiologie aufgrund der Exposition gegenüber Hostumgebung Wachstum und das Vorhandensein von Wirtszellen verändern. Wir entwickelten einen Test um den Zustand der Virulenz der Bakterien schnell zu messen, die das Ausmaß zu minimieren, um das Bakterien in Gegenwart von Wirtszellen wachsen. Bakterien und Amöben sind miteinander vermischt und auf einen einzigen Abbildungsebene mit einer Agar-Pad immobilisiert. Das Verfahren nutzt einzellige Fluoreszenz-Bildgebung mit Calcein-Acetoxymethyl Ester (Calcein-AM) als Indikator für Host Zellgesundheit. Die Fluoreszenz von Wirtszellen ist nach 1 h von Wirtszellen Bakterien ausgesetzt zu sein mit Epifluoreszenz mikroskopie analysiert. Bildanalyse-Software wird verwendet, um einen Host-Tötung-Index zu berechnen. Diese Methode wurde verwendet, um die Virulenz innerhalb von planktonischen und Oberfläche befestigt Pseudomonas Aeruginosa Messen Sub-Populationen in der Anfangsphase der Biofilmbildung und andere Bakterien und andere Wachstumsstadien Biofilm angepasst werden kann. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und robuste Methode zur Messung der Virulenz und vermeidet viele der komplexen Zusammenhang mit Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien. Virulenz Phänotypen mit Amöben hier gemessen wurden auch mit Maus Makrophagen validiert. Insbesondere wurde dieser Assay verwendet, um die Oberfläche Anlage reguliert Virulenz in p. Aeruginosazu etablieren.

Wir wuchsen Wild-Art p. Aeruginosa Belastung PA1419 oder eine ΔLasR 20 im gleichen PA14 Hintergrund in 6 cm Durchmesser-Petrischalen belasten und die Virulenz von planktonischen und Oberfläche angebracht Zellen untersucht. Kulturen wurden aus einzelnen Kolonien in PS:DB Kulturen, gewachsen über Nacht in Kultur Röhren in eine Bandage bei 37 ° C, Sättigung geimpft, verdünnt 1: 100 in PS:DB, für 8 h in 6 cm Durchmesser Petrisc...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Virulenz von planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterien mit D. Discoideum (Amöben) als Host zu messen. Virulenz wird gemessen über einen Zeitraum von 1 h und Host töten wird quantifiziert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse. Wir zeigen dieses Protokoll mit dem Bakterium p. Aeruginosa.

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der bakteriellen Pathogenese zu beantworten, z. B. wann wirtstötende Virulenzeffektoren in bakteriellen Zellen exprimiert werden und wie die Virulenzzustände von oberflächengebundenen implantonischen Zellen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell und quantitativ ist und die Wirtszellen relativ einfach zu handhaben sind. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass oberflächengebundene implantonische Subpopulationen von Pseudomonas unterschiedliche wirttötende Phänotypen aufweisen.Um mit dem Anbau von E.coli Stamm BR über Nacht zu beginnen, wie im Textprotokoll beschrieben. Bringen Sie dann die E.coli-Kultur auf Raumtemperatur. Mit einem Holzstäbchen die Amöbe in 750 l der Kultur imminkulieren.Geben Sie sofort 700 l der Amöben-E.coli-Mischung auf eine GYP-Platte. Kippen Sie die Platte, um die Kultur gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte zu verteilen. Stellen Sie die Platte dann in eine Box, die eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechterhält.Inkubieren Sie die Platte in der Box bei 22 °C für vier bis fünf Tage. Nachdem die Inkubationszeit beendet ist, verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze, um Amöbensporen von der Hälfte der Platte zu sammeln. Pipettieren Sie dann auf und ab, um die Amöbe an der Pipettenspitze in 1 ml PS-Medium zu resuspendieren.Das Impfgemisch in einen 250-ml-Kolben mit 25 ml PS-Medium, ergänzt mit einer antibiotischen antimikotischen Lösung, überführen. Züchten Sie die Amöbe bei 22 °C in einem rotierenden Shaker bei 100 U/min. Nachdem Sie Pseudomonas aeruginosa über Nacht kultiviert haben, verdünnen Sie die Kultur mit PSB-Medien in einer 6 cm großen Petrischale.Schütteln Sie dann die Kultur auf einem Tischrotator, der auf 100 U/min bei 37 °C eingestellt ist.Zuerst 50 mL 1%agar in DB-Puffer in einem 250-ml-Kolben in die Mikrowelle stellen. Fügen Sie 15 l Calcium AM zu den 15 ml geschmolzenem Agar hinzu und mischen Sie vorsichtig. Gießen Sie die geschmolzene Agarmischung in eine 12 x 10 cm große Glasplatte und lassen Sie den Agar zehn Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren.Schneiden Sie anschließend mit einem Metalllineal und einem bedruckten Gitter das erstarrte Agarpad in kleinere 1,5 x 1,5 cm große Abschnitte. Stellen Sie sicher, dass das Gel mit Feuchtigkeit versorgt bleibt, bis es gebrauchsfertig ist. Um die an der Oberfläche haftenden Zellen zu isolieren, entfernen Sie anschließend das flüssige Medium aus der Petrischale.Spülen Sie dann die Schale mit 1 mL Entwicklungspuffer ab, um die Planktonzellen zu entfernen. Um die Virulenz von oberflächengebundenen Bakterienzellen zu testen, fügen Sie 10 l Amöbenzellen aus den zuvor erhaltenen oberflächengebundenen Bakterienzellen hinzu. Um die Planktonzellen zu isolieren, geben Sie 10 L der Kultur in eine frische Petrischale.Als nächstes wird die Virulenz von Planktonzellen getestet, indem 10 L Amöbenzellen mit den zuvor gewonnenen Planktonbakterien gemischt werden. Legen Sie sofort das kleine Agarpad auf die entsprechende Bakterien-Amöben-Mischung auf der Petrischalenoberfläche. Entfernen Sie dann überschüssige Flüssigkeit, indem Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig pipettieren, und lassen Sie die Schüssel 20 Minuten lang trocknen.Decken Sie die Form mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie weitere 40 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie schließlich ein Fluoreszenzmikroskop, um Bilder von mindestens 100 Amöbenzellen aufzunehmen. In diesem Protokoll wurde die Virulenz von planktonischen und oberflächengebundenen Pseudomonas aeruginosa-Zellen untersucht.Die an der Oberfläche befestigte Wildtyp-Amöbe Pseudomonas aeruginosa tötete Amöben, was durch eine runde Amöbenzellform und das Vorhandensein von Calceinfluoreszenz angezeigt wird. Im Vergleich zu planktonischen Zellen hatte der oberflächengebundene Wildtyp Pseudomonas aeruginosa einen hohen Wirtstötungsindex. Planktonzellen wurden von der Amöbe verzehrt, was sich in den amorphen Amöbenzellformen und der relativ geringen Calceinfluoreszenz zeigt.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, einen frischen Vorrat an Kalkstein-AM und Amöbenzellen zu verwenden und die optische Dichte der Amöben genau zu verfolgen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie das Transkriptionsprofiling durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Welche Gene sind in planktonischen und oberflächengebundenen Subpopulationen aktiviert? Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den bildbasierten Virulenz-Schnelltest durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Chen, Y., et al. Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video demonstriert den C. elegans Liquid Toxicity Assay mit Aeromonas, eine Methode zur Bewertung bakterieller Virulenz durch Messung des Überlebens von Würmern in einer nährstoffarmen flüssigen Umgebung. Der Test zeigt stammspezifische Pathogenität anhand des Ausmaßes der durch Toxinen verursachten Schäden und Sterblichkeit bei C. elegans.

Bewertung der bakteriellen Virulenz mit dem C. elegans Liquid Toxicity Assay

Quelle: Perinbam, K., und Siryaporn, A. Ein schneller, bildbasierter bakterieller Virulenztest mit Amöben. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert eine schnelle, bildbasierte Methode zur Beurteilung der bakteriellen Virulenz, indem Amöben mit oberflächengebundenen oder planktonischen Bakterien inkubiert, ein Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM) Agarose-Pad angewendet und Fluoreszenz bildgeblich zur Erkennung von Wirtszellschäden durchgeführt wird.

Ein schneller, bildbasierter Test zur Überprüfung oberflächeninduzierter bakterieller Virulenz

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

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Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

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