Détection des virus de bioaérosols à l’aide de résine échangeuse d’anions

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le type, le niveau et la distribution des virus dans les bioaérosols qui sont importantes pour la santé publique et vétérinaire. Les principaux avantages de cette méthode sont l’amélioration de la sensibilité de la détection moléculaire des virus à partir de bioaérosols, sa facilité d’utilisation sur le terrain et sa facilité d’utilisation. Créer des suspensions des concentrations expérimentales de particules virales d’intérêt dans des volumes de 100 millilitres de PBS dans les récipients en verre d’un nébuliseur à collision à six jets.

Pour configurer la chambre de bioaérosol, préchargez deux impacteurs liquides avec 20 millilitres de PBS de 0,01 molaire, suivis de l’ajout de 0,5 gramme de résine échangeuse d’anions à un seul impacteur. Assemblez l’impacteur. Installez les suspensions à l’intérieur de la chambre.

Utilisez des supports de pince pour positionner les impacteurs de liquide en parallèle à l’intérieur de la chambre de bioaérosol, les entrées de l’échantillonneur d’aérosols faisant face au nébuliseur. Placez un instrument à lecture directe près des impacteurs de liquide pour surveiller les variables environnementales et placez un moniteur d’aérosol supplémentaire à lecture directe près des impacteurs de liquide pour mesurer la concentration massique du bioaérosol. Ensuite, faites fonctionner les ventilateurs axiaux dans les coins de la chambre de bioaérosol pour faciliter le mélange de l’aérosol.

Lorsque la chambre est prête, démarrez les instruments de mesure des variables à l’intérieur de la chambre de bioaérosol. Utilisez un étalon de débit primaire pour calibrer le système afin de maintenir l’uniformité entre les volumes d’échantillonnage. Scellez la chambre pour une purge de 10 minutes avec de l’air filtré HEPA.

Fournir de l’air filtré et séché au nébuliseur à une pression de 6,9 kilopascals pour générer une concentration cible de bioaérosols viraux. Lorsque la concentration massique cible de l’aérosol a été atteinte, arrêtez la nébulisation. Ensuite, utilisez une ligne filtrée HEPA située près du nébuliseur pour fournir de l’air dilué, en prenant soin de maintenir une pression constante à l’intérieur de la chambre et échantillonnez activement l’atmosphère de la chambre de bioaérosol pendant 40 minutes pour atteindre un volume d’échantillonnage de 500 litres par échantillon.

L’étalonnage de l’instrument est essentiel pour déterminer la concentration de contaminants atmosphériques. La chaîne d’échantillonnage doit être étalonnée avant et après chaque échantillonnage. Les pré et post-étalonnages doivent être à moins de 5 % l’un de l’autre.

Éteignez les pompes à la fin de l’échantillonnage. Pour isoler les acides nucléiques directement de la résine échangeuse d’anions, transférez tout le liquide contenant de la résine échangeuse d’anions des impacteurs de liquide dans des tubes coniques individuels stériles de 50 millilitres. Après avoir laissé la résine se déposer, décantez lentement l’échantillon liquide de la résine échangeuse d’anions, à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre pour éliminer tout liquide restant de la résine.

Ensuite, ajoutez 560 microlitres de tampon de lyse virale contenant de l’ARN porteur d’un kit d’isolement d’ARN viral directement dans la résine échangeuse d’anions, pour une incubation de 10 minutes à température ambiante avec mélange périodique. À la fin de l’incubation, à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, transférer le lysat viral dans un tube conique stérile de 1,5 millilitre et procéder à l’isolement de l’ARN selon les instructions du fabricant. Ensuite, effectuez une PCR quantitative en temps réel pour la détection de la bactérie MS2, des phages et des virus de la grippe A et B à l’aide de cinq microlitres d’éluant d’acide nucléique par échantillon.

Comme le montrent ces courbes d’amplification représentatives de la qRT-PCR, la détection des virus de la grippe de type A peut être réalisée jusqu’à 3,26 cycles plus tôt lorsque la résine échangeuse d’anions est utilisée, par rapport au test direct du liquide d’impact. Dans une qRT-PCR efficace à 100 %, un gain d’un cycle de seuil correspond à une augmentation de deux fois de la concentration cible, de sorte que les résultats représentatifs indiquent une amélioration de 9,58 fois de la sensibilité de détection. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que lorsque l’échantillonnage de l’air est effectué sur le terrain, des paramètres tels que l’humidité relative et la température peuvent affecter l’efficacité de la collecte et que les tampons de collecte peuvent devoir être optimisés pour différents virus. Après cette procédure, d’autres méthodes basées sur la culture peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’infectiosité virale. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs et autres professionnels dans les domaines de l’agriculture et de la santé publique, pour explorer des méthodes alternatives de capture et de concentration virales à partir de bioaérosols pour l’évaluation des risques dans la surveillance des maladies virales.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de capturer et de concentrer les virus à partir de bioaérosols à l’aide d’impacteurs liquides modifiés, d’extraire les acides nucléiques directement de la résine échangeuse d’anions et de détecter les virus à l’aide de la qRT-PCR. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes viraux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’un équipement de protection individuelle et d’un niveau de biosécurité de deux ou plus doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.