Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Krebspathologie zu beantworten, indem Biomarkerproteine aus routinemäßig verarbeitetem Biopsiematerial quantifiziert werden. Die Hauptvorteile dieser Technik in Bezug auf die konventionelle Immunhistochemie sind, dass sie objektiv ist, einen breiten Dynamikbereich hat und die Quantifizierung von Proteinen in bestimmten Zelltypen ermöglicht. Das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter so genannter Biomarker-Proteine, insbesondere der relativen Häufigkeit dieser Proteine in Krebsbiopsieproben, kann sehr nützlich sein, um eine spezifische pathologische Diagnose bestimmter Krebsarten zu erstellen.

Aber es kann auch nützlich sein, um die Reaktion auf Krebsbehandlungen vorherzusagen, deshalb ist diese Technik sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung von Krebspatienten relevant. In diesem Protokoll geht es vor allem darum, wie die Proteinquantifizierung in verewigten Zelllinien verwendet werden kann, um die quantitative Natur des immunfluoreszenzbasierten Assays zu validieren. Aber es ist wichtig zu beachten, dass Immunfluoreszenz leicht in einen Multiplex-Ansatz integriert werden kann, und auf primäre Biopsieproben angewendet werden.

Unterstützt und demonstriert dieses Verfahren lee Boudreau, ein Techniker, und Shakeel Virk, der Direktor der Operationen. Beide vom Queen es Laboratory for Molecular Pathology. Zunächst zentrifugieren Sie die zuvor geernteten Zellen in einem 50 Milliliter konischen Rohr bei 225 Gs für fünf Minuten.

Dekantieren Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet in 10 Milliliter PBS wieder auf. Zentrifugieren Sie dann die resuspendierten Zellen bei 225 Gs für fünf Minuten. Setzen Sie das Zellpellet mit 10 Millilitern von 10%NBF aus.

Dann inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei 24 RPMs über Nacht. Nach der Fixierung der Zellen zentrieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 225 Gs. Entfernen Sie dann den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter PBS wieder aus.

Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und pellet die Zellen über Zentrifugation. Dann aspirieren Sie den Überstand. Fügen Sie etwa 500 Mikroliter 1%Agarose-Lösung zu jedem Rohr enthaltende Zellen hinzu.

Dann pipette die Mischung nach oben und unten zu mischen. Nachdem die Agarose-Zelllösung aushärtet, fügen Sie den Röhren einen Milliliter 10% NBF hinzu. Entfernen Sie später die NBF aus den Proben.

Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Zellstecker zu entfernen, und legen Sie den Stecker in eine Kunststoff-Gewebekassette. Verarbeiten Sie Proben über Nacht mit einem automatisierten Gewebeprozessor. Dann betten Sie die Proben in Paraffinwachs ein, mit Standard-Histologie-Methoden.

Mit einem Tissue-Arrayer-Instrument duplizieren Sie duplizierte 6-Millimeter-Kerne aus dem Paraffinblock und fügen Sie sie in einen leeren Paraffinblock ein. Verwenden Sie anschließend ein Mikrotom, um zwei histologische Abschnitte der neu erstellten Zelllinie TMA vorzubereiten. Montieren Sie dann die Abschnitte auf einer Histologiefolie, und deparaffinisieren Sie sie.

Laden Sie zunächst die beiden Dias der Zelllinie TMA in ein automatisiertes Färbesystem. Färben Sie eine Seite mit der optimalen primären Antikörperverdünnung, so dass die andere als negativer Kontrollschlitten. Auf beiden Dias einen nuklearen Gegenfleck und einen sekundären Antikörper auftragen.

Fügen Sie nach dem Färbevorgang die Tyramidsignalverstärkungsreagenzien hinzu. Danach scannen Sie die immunbefleckten Dias mit den entsprechenden Anregungs- und Detektionswellenlängen für die verwendeten Fluorophore. Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um das zelluläre Fach von Interesse zu identifizieren, ob Kern oder Zytoplasma, und quantifizieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität oder MFI für jede Linie.

Um zu bestimmen, welche Zelllinie die größte Fülle des Zielproteins hat, wird aliquot kostbar zubereitete Zelllysat in Mikrozentrifugenröhren lysiert. Fügen Sie dann 2,5 Mikroliter 6x Laemly Buffer und genügend RIPA-Lysepuffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf 15 Mikroliter zu bringen. Als nächstes laden Sie ein SDS-Seitengel mit einer Proteinleiter und den zuvor vorbereiteten Proben.

Danach laemly Puffer in die leeren Brunnen. Führen Sie das Gel, bis der blaue Farbstoff den Boden der Platte erreicht. Nach einem halbtrockenen Proteintransfer verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Membran horizontal zu schneiden, um das von Interesse bestosliche Protein vom Kontrollprotein zu trennen.

Führen Sie Blockierungs- und Antikörperinkubationen gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Dann legen Sie die Membranstreifen in eine durchsichtigen Plastiktüte. Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die Membranen mit ECL-Mischung zu bedecken.

Dann versiegeln Sie den Beutel und bebrüten die Membranen bei Raumtemperatur im Dunkeln für ein bis zwei Minuten. Legen Sie als Nächstes die Plastiktüte mit den Membranen in eine digitale Bildgebungsplattform. Verwenden Sie Chemilumineszenz und kolorimetrische Markererkennung, um verschiedene Belichtungen der Membran zu erfassen.

Bestimmen Sie mithilfe von Bildanalysesoftware oder visueller Beobachtung, welche Zelllinie das zielreichste Protein ausdrückt. Nachdem Sie eine serielle Verdünnung dieser Zelllinie immunisiert haben, öffnen Sie die Belichtungsbilder mit der Bildanalysesoftware. Verwenden Sie das rechteckige Auswahlwerkzeug, um die erste Spur des Gels auszuwählen.

Gehen Sie dann zu analysieren, Gele, und wählen Sie die erste Spur. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie das werkzeug für die rechteckige Auswahl auf die nächste Spur verschieben, und gehen Sie zu analysieren, Gele, und wählen Sie die nächste Spur aus. Gehen Sie als Nächstes zu analysieren, Gele und Plotspuren.

Verwenden Sie das Werkzeug gerade, um Linien über die Basen jeder Spitze zu zeichnen, um das Hintergrundrauschen zu entfernen. Verwenden Sie dann das Werkzeug Zauberstab, um jeden Peak auszuwählen und die Bandintensität jedes Peaks aus dem Ergebnisfenster abzusuchen. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Bandintensität im Vergleich zur Gesamtproteinmenge, die für jeden primären Antikörper geladen wird, wobei die Densitometrie-Ausgabe verwendet wird.

Verwenden Sie dann eine Linie der besten Anpassung und visuellen Beobachtung, um die Position des linearen Dynamikbereichs jedes Antikörpers zu bestimmen. Wählen Sie eine Proteinkonzentration aus, die eine Bandintensität innerhalb des linearen Bereichs ergibt, und führen Sie einen Immunoblot aller Zelllinienlysate mit dieser Proteinkonzentration durch, wie zuvor gezeigt. Führen Sie als Nächstes die Densitometrie für die digitalen Scans durch und wählen Sie Belichtungen aus, die Signale innerhalb der zuvor identifizierten linearen Bereiche für jeden Antikörper liefern.

Danach berechnen Sie das Verhältnis der Zielproteinbandintensität zur Ladekontrollbandintensität für jede Zelllinie. Schließlich verwenden Sie statistische Software, um einen Pearson-Korrelationstest zwischen den Werten, die aus der Bildanalyse der IF-Färbung erhalten wurden, und denen, die durch Immunoblotting erhalten, durchzuführen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Fähigkeit von IF zu bestätigen, die relative Menge des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 zu bestimmen.

Unterschiedliche Verdünnungen des primären Antikörpers wurden mit einem immunhistologischen Färbemittel am menschlichen Mandelgewebe getestet. Für dieses Experiment wurde eine Verdünnung von eins bis 50 als die optimale Verdünnung bestimmt, die ein starkes Signal mit wenig Hintergrundrauschen ergab. Diese Verdünnung wurde verwendet, um die Zelllinie TMA durch Immunfluoreszenz zu färben, und Bildanalyse wurde verwendet, um das zytoplasmatische Cy5-Signal zu quantifizieren, das Bcl-2 zugeschrieben wird.

Basierend auf dem Immunoblot für alle getesteten Zelllinien hatte Granta-519 die größte Fülle von Bcl-2. Ein Immunoblot der seriellen Verdünnung von Granta-519-Lysat wurde dann verwendet, um den linearen Dynamikbereich von Bcl-2 zu finden und das Protein GAPDH zu kontrollieren. Der Dynamikbereich für Bcl-2 reichte in diesem Test von einer Bandintensität von fast 0 bis 7500 Einheiten.

Der Dynamikbereich für GAPDH reichte von 3000 bis 6500 Einheiten. Der Immunoblot wurde mit Expositionen innerhalb dieses linearen Bereichs wiederholt. Und das Verhältnis von Bcl-2 zu GAPDH wurde für jede Zelllinie berechnet.

Ein Pearson-Korrelationstest zeigte, dass die Intensitätsverhältnisse von Immunoblotting stark und positiv mit den Intensitätswerten aus quantitativem IF korrelierten. Beim Versuch dieses Verfahrens, ist es wichtig, daran zu denken, die endgültige Membran für mehrere Zeitpunkte zu belichten, Um die optimale Belichtung zu finden, wo alle Bänder innerhalb ihrer jeweiligen linearen Bereiche sind. Nach der Validierung des quantitativen Charakters des IF-Protokolls kann es für Multiplex IF in routinemäßig verarbeiteten Gewebeproben modifiziert werden, um klinische Fragen zu beantworten, z. B. wo ein Zielprotein exprimiert wird.