Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

DIE RNA-Immunpräzipitation im Tandem, gefolgt von der Sequenzierung, oder RIPiT-Seq, ist eine Methode, um zu identifizieren, welche Regionen der RNA durch ein bestimmtes Paar von RNA-bindenden Proteinen gebunden sind. Der einzigartigste Vorteil von RIPiT ist seine Fähigkeit, zwei verschiedene Proteine in zwei Reinigungen anzuvisieren. Dies bietet eine leistungsstarke Möglichkeit, sich für einen kompositorisch unterschiedlichen RNA-Proteinkomplex aus anderen Komplexen anzureichern.

Außerdem ist RIPiT-Seq UV-vernetzungunabhängig und kann auf viele Proteine angewendet werden, die auf RNA wirken, ohne sie direkt zu binden. Während sich diese Methode nicht direkt auf die Therapie oder Diagnose erstreckt, wurden RNA-bindende Proteine und RNA-Verarbeitung mit mehreren Krankheiten wie Neuropathien und Krebs in Verbindung gebracht. RIPiT-Seq bietet ein Werkzeug zur Untersuchung von Funktionen von krankheitsverbundenen RNA-bindenden Proteinen.

RIPiT-Seq erfordert ein System, in dem ein mit Epitopen markiertes Protein exprimiert werden kann. Es wurde nur in HEK293 Zellen getestet und ist am besten für die Zellkultur zugänglich. Mit unserer Fähigkeit, Proteine mit CRISPR zu kennen, kann RIPiT-Seq jedoch auf verschiedene moderne Systeme anwendbar sein.

Der Erfolg von RIPiT hängt von zwei effizienten Immunpräzipitationen ab, daher ist es entscheidend, die Immunpräzipitationsbedingungen für den verwendeten Antikörper zu optimieren. Auch die Arbeit mit RNA erfordert angemessene Vorsichtsmaßnahmen, daher sollten RNase-freie Reagenzien während und nach der RNA-Extraktion verwendet werden. Das Verfahren wird Lauren Woodward demonstrieren, eine Studentin in meinem Labor.

Beginnen Sie damit, Monolayer-Zellen sanft mit 15 Millilitergekühltem PBS pro 15 Zentimeter Platte zu waschen. Dann kratzen Sie Zellen in 30 Milliliter PBS und sammeln Sie sie in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Pellet die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, und entsorgen Sie den Überstand.

Fügen Sie vier Milliliter eiskalten hypotonischen Lysepuffer hinzu und verwenden Sie eine P1000 Pipette, um die Zellen wieder zu suspendieren. Das Lysat in ein Fünf-Milliliter-Rohr geben und 10 Minuten auf Eis brüten. Legen Sie das Lysat in ein Eisbad und beschallen Sie nach Manuskriptanweisungen.

Dann 108 Mikroliter von fünf Mol-Natriumchlorid hinzufügen, um die Salzkonzentration auf 150 Millimolar einzustellen. Dann zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln 20 Mikroliter des Überstandes für die Western-Blot-Analyse. Vorwaschen FLAG Agarose Perlen nach Manuskript Richtungen und gelten verbleibenden Überstand auf 750 Mikroliter Perlen in einem Fünf-Milliliter-Rohr.

Die FLAG-Agaroseperlen mit dem Zellextrakt ein bis drei Stunden bei vier Grad Celsius bei sanfter Mischung inkubieren. Nach der Inkubation pellet die Perlen durch Zentrifugation bei 400 g für eine Minute bei vier Grad Celsius und sammelt 20 Mikroliter des Überstandes für die Western-Blot-Analyse. Entsorgen Sie den verbleibenden Überstand und waschen Sie die Perlen, indem Sie sie in vier Milliliter Iso-Waschpuffer wieder aufhängen.

Pellet die Perlen wieder und entfernen Sie den Überstand. RNase I in 750 Mikroliter Iso-Waschpuffer nach Manuskriptanweisungen verdünnen und zu den FLAG-Agaroseperlen hinzufügen. Die Mischung bei vier Grad Celsius mit sanftem Mischen bebrüten und dann die Perlen durch Zentrifugation pelleten.

Sammeln Sie 20 Mikroliter Überstand für die Western-Blot-Analyse, und entsorgen Sie den Rest. Dann waschen Sie die Perlen mit Iso-Waschpuffer, wie zuvor beschrieben. Als nächstes führen Sie die Affinitätselution durch, indem Sie 375 Mikroliter Elutionspuffer zu den Perlen hinzufügen und die Mischung bei vier Grad Celsius für ein bis zwei Stunden sanft schütteln.

Nach der Inkubation pellet die Perlen und sammeln Sie einen 15 Mikroliter Aliquot der Elution für die Western Blot Analyse. Während Die Affinitätselution im Gange ist, führen Sie eine magnetische Ad-Antikörper-Konjugation durch. Beginnen Sie mit dem Waschen von 50 Mikrolitermagnetperlen in einem Milliliter Iso-Waschpuffer.

Setzen Sie die Perlen in 100 Mikroliter Konjugationspuffer aus und fügen Sie die entsprechende Menge an Antikörpern hinzu. Dann inkubieren Sie die Perlen für mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Magnetischen Perlen zweimal mit Konjugationspuffer und setzen Sie die Perlen in 375 Mikroliter RIPiT Verdünnungspuffer wieder auf.

Bewahren Sie die Perlen bis zur Immunpräzipitation auf Eis auf. Tragen Sie die FLAG-Affinitätselution auf die antikörpergekoppelten Magnetperlen auf und brüten Sie mit sanfter Mischung für ein bis zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Erfassen Sie die magnetischen Perlen mit einem Magneten und sammeln Sie 15 Mikroliter Überstand für die Western-Blot-Analyse.

Dann waschen Sie die Perlen sieben Mal mit Iso-Waschpuffer. Fahren Sie mit der Denaturierung der Elution fort, indem Sie magnetische Perlen in 100 Mikrolitern durcheinen klaren Probenpuffer wieder aufhängen und die Suspension 10 Minuten lang auf Eis brüten. Während der Inkubation, regelmäßig die Perlen, um sie wieder zu suspendieren.

Erfassen Sie die magnetischen Perlen auf einem Magneten und sammeln Sie 15 Mikroliter Elution für die Western-Blot-Analyse. Übertragen Sie die restliche Elution auf ein neues 1,5 Milliliter-Rohr. Um die RNA zu extrahieren, fügen Sie der RIPiT-Elution 320 Mikroliter RNase-freies Wasser und 400 Mikroliter Phenol-Chlorform-Isoamylalkohol hinzu.

Wirbeln Sie die Mischung und zentrifugieren Sie es dann bei 12.000 g für fünf Minuten. Sammeln Sie 350 Mikroliter der wässrigen Phase in ein separates Rohr. Natriumacetat, Magnesiumchlorid, Glykogen und Ethanol in die entnommene Probe geben und die Mischung über Nacht bei minus 20 Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag pellet die RNA durch Zentrifugation bei 12.000 g 30 Minuten bei vier Grad Celsius und waschen Sie sie in 70% Ethanol. Nach dem Ethanolwaschen die RNA mit T4-Polynukleotidkinase oder PNK ohne ATP behandeln und Phenol-Chlorform-Reinigung nach Manuskriptanweisungen durchführen. Setzen Sie die saubere RNA in 4,5 Mikroliter RNase-freiem Wasser wieder auf.

Um die RNA-Ausbeute zu quantifizieren, radiolabeldien die RNA mit PNK und 32P beschrifteten ATPs nach Manuskriptanweisungen. Verwenden Sie eine DNA-Leiter mit niedriger Reichweite und ein synthetisches Oligo mit 20 bis 40 Nukleotid für Größen- und Mengenstandards. Lösen Sie die beschriftete RNA auf einem 26%urea-polyacrylamid-Gel.

Trocknen Sie das Gel gemäß den Manuskriptrichtungen und setzen Sie das Gel einem Phosphoscreen aus, bis ein ausreichendes Signal erkannt wird. Diese Technik wurde verwendet, um die Wechselwirkungen des Exon-Kreuzungskomplexes oder EJC zu untersuchen. Die Western-Blot-Analyse von Proteinen, die aus jedem wichtigen Schritt des RIPiT-Verfahrens gereinigt wurden, zeigt, dass gereinigtes EJC sowohl EIF4A3 als auch MAGOH enthält.

Die Negativkontrolle HNRNPA1 wird in der Elution nicht nachgewiesen. Die Stärke des RNA-Fußabdrucksignals korreliert mit der Menge der RNA-Protein-Interaktion. Ein stärkerer Fußabdruck wird beobachtet, wenn RIPiT an Zellen durchgeführt wurde, die mit Puromycin behandelt wurden, was die EJC-Belegung auf RNA erhöht.

Um sicherzustellen, dass der RIPiT effektiv war, ist es wichtig, die Effizienz der IP durch Western Blot zu testen. Es ist auch wichtig, die Menge und die Qualität der RNA zu bewerten, bevor Sie mit der tiefen Sequenzierung fortfahren. Im Jahr 2018 nutzte das Singh-Labor erfolgreich diese Technik, um zwei kompositorisch unterschiedliche Variationen des Exon-Kreuzungskomplexes zu reinigen und RNA-Bindungsmuster zu identifizieren.

Wenn Forscher sich dafür entscheiden, RNA-Fußabdrücke mit Autoradiographie zu erkennen, sollten alle geeigneten Strahlensicherheitsverfahren und -protokolle befolgt werden.