Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung nativer Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungsbibliotheken für die Nukleosomendichteanalyse. Diese Methode kann Fragen in der Epigenetik beantworten, wie z.B. die Aufdeckung epigenomischer Merkmale in einer Zellpopulation auf Einzelnukleosomenebene und die Auflösung heterogener Chromatinsignaturen in ihre kontinuierlichen Elemente. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die MNase-Eigenschaft des bevorzugten Zugangs zur offenen Chromatinregion zu nutzen, um eine Messung zu erzeugen, die die Zugänglichkeit der MNase mit der Histonmodifikation kombiniert.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie nicht in der Lage sind, einen optimalen MNase-Verdau zu erhalten. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Zellvorbereitung, wie im Textprotokoll beschrieben. Tauen Sie am ersten Tag jedes Zellpellet 10 Sekunden lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.

Übertragen Sie dann die Zellen auf Eis. Geben Sie sofort einen eiskalten One-X-Lysepuffer plus One-X-PIC zu einem Endkonzentrat von 10.000 Zellen pro 20 Mikroliter. Mischen Sie 10 Mal, indem Sie auf und ab pipettieren, ohne Blasen zu bilden.

Bei der Arbeit auf Eis aliquotieren Sie 20 Mikroliter der resultierenden Lysate pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte. Decken Sie die Platte mit dem Plastiksiegel ab, bevor Sie sie 20 Minuten lang auf Eis inkubieren. Beschriften Sie die Platte als MNase, und notieren Sie die Wells in einem Vorlagenschlüssel.

Kurz bevor die 20-minütige Lyse abgeschlossen ist, verdünnen Sie das MNase ein Enzym mit MNase einem Verdünnungspuffer auf eine Endkonzentration von 20 Einheiten pro Mikroliter und bewahren Sie es auf Eis auf. Bereiten Sie auf Eis den MNase One Digestion Master Mix zu, wie im Textprotokoll beschrieben. Aliquotieren Sie dann 20 Mikroliter des Mastermixes pro Probenreihe plus fünf Mikroliter zusätzliches Volumen in eine 96-Well-Reservoirplatte.

Nachdem die Lysate fertig inkubiert sind, entfernen Sie die MNase-Aufschlussplatte aus dem Eis. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter MNnase, einen Aufschluss-Mastermix, in jede Probenreihe und mischen Sie, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Ändere die Spitzen zwischen den Reihen.

Inkubieren Sie die Platte dann genau fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Um die Reaktion nach fünf Minuten zu stoppen, geben Sie mit einer Mehrkanalpipette sechs Mikroliter 250-mikromolares EDTA in jede Probenreihe und mischen Sie einige Male auf und ab. Achten Sie darauf, die Spitzen zwischen den Reihen zu wechseln.

Nach der EDTA-Zugabe stellen Sie die Pipette auf 20 Mikroliter ein und mischen Sie wie zuvor 10 Mal, um einen vollständigen Stopp der Aufschlussreaktion zu gewährleisten. Zum Schluss fügen Sie sechs Mikroliter 10X Lysepuffer zu jeder Reihe der MNase aufgeschlossenen Proben hinzu und mischen Sie gut, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Decken Sie die Platte mit einem Plastiksiegel ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang auf Eis.

Bereiten Sie die Antikörperbead-Komplexplatte und die Pre-Clearing-Platte vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Drehen Sie beide Platten schnell, indem Sie sie 10 Sekunden lang bei 200 Mal G zentrifugieren. Platzieren Sie dann die Platte des Antikörperbead-Komplexes auf einem Plattenmagneten und warten Sie 15 Sekunden, bis die Lösung klar ist. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette, ohne die Kügelchen zu beschädigen.

Nehmen Sie dann die Platte vom Plattenmagneten und halten Sie sie auf Eis. Legen Sie die Reaktionsplatte vor der Reinigung auf einen Plattenmagneten und warten Sie 15 Sekunden, bis sich die Kügelchen getrennt haben und die Lösung klar wird. Ohne die Kügelchen zu beschädigen, den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in die entsprechenden Vertiefungen der auf Eis aufbewahrten Platte des Antikörperbead-Komplexes übertragen.

Mischen Sie jede Vertiefung vorsichtig, indem Sie 15 Mal auf und ab pipettieren. Verschließen Sie die Platte gut mit einer Aluminiumplattenabdeckung und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform. Beschriften Sie die Platte nach der Inkubation mit IP-Reaktion.

Stellen Sie am zweiten Tag den Heizmischer auf 65 Grad Celsius ein und bereiten Sie dann einen salzarmen Waschpuffer und einen salzreichen Waschpuffer auf Eis vor. Drehen Sie die IP-Reaktionsplatte 10 Sekunden lang mit dem 200-fachen G.Setzen Sie die IP-Reaktionsplatte auf einen Plattenmagneten und warten Sie 15 Sekunden, bis die Lösung klar geworden ist. Mit einer Mehrkanalpipette den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen, ohne die Kügelchen zu stören.

Nehmen Sie die Platte vom Plattenmagneten ab und legen Sie sie auf Eis. Zu jeder Probenreihe in der IP-Reaktionsplatte 150 Mikroliter eiskalten, salzarmen Waschpuffer hinzufügen und 10 Mal langsam auf und ab mischen, um die Kügelchen vollständig zu resuspendieren. Setzen Sie die IP-Reaktionsplatte wieder auf den Plattenmagneten und entfernen Sie den Überstand wie zuvor.

Legen Sie dann die Platte wieder auf Eis und wiederholen Sie die Waschschritte für insgesamt zwei Wäschen. Bei der Arbeit auf Eis werden 150 Mikroliter des salzreichen Waschpuffers zu jeder Probenreihe in der IP-Reaktionsplatte gegeben. Mischen Sie die Proben langsam, indem Sie sie 10 Mal auf und ab pipettieren, um die Kügelchen vollständig zu resuspendieren.

Nachdem Sie den Überstand wie zuvor entfernt haben, legen Sie die IP-Reaktionsplatte auf Eis und kühlen Sie eine neue 96-Well-Platte daneben vor. Zu jeder Probenreihe in der IP-Reaktionsplatte werden 150 Mikroliter des salzreichen Waschpuffers hinzugefügt und 10 Mal langsam durch Auf- und Abpipettieren gemischt, um die Kügelchen vollständig zu resuspendieren. Nach der Resuspension wird jede Probenreihe in die entsprechende Reihe der neuen, vorgekühlten 96-Well-Platte übertragen.

Entsorgen Sie die alte Platte. Setzen Sie die neue IP-Reaktionsplatte auf den Plattenmagneten und entsorgen Sie den Überstand wie bisher. Bewahren Sie die Platte bei Raumtemperatur auf.

Zu jeder Probenreihe in der IP-Reaktionsplatte werden 30 Mikroliter des ChIP-Elutionspuffers hinzugefügt und langsam durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren gemischt. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen bilden. Verschließen Sie die Platte mit einem PCR-Deckel und inkubieren Sie sie in einem Heizmischer bei 65 Grad Celsius für 1 1/2 Stunden mit einer Mischgeschwindigkeit von 1.350 U/min.

Nach einer 1 1/2-stündigen Inkubation wird die IP-Reaktionsplatte eine Minute lang bei vier Grad Celsius bei 200 μg heruntergeschleudert. Setzen Sie dann die IP-Reaktionsplatte auf einen Plattenmagneten und warten Sie, bis sich die Lösung geklärt hat. Mit einer Mehrkanalpipette werden vorsichtig 20 Mikroliter des Überstands mit frischen Spitzen für jede Reihe in eine neue 96-Well-Platte überführt, ohne die Kügelchen zu stören.

Beschriften Sie die Platte mit IP Reaction und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur auf. Fahren Sie mit dem Proteinverdau fort, gefolgt von der Erstellung einer Bibliothek, wie im Textprotokoll beschrieben. Hier sind repräsentative Ergebnisse von optimalem, unter- und überverdautem MNase verdautem Chromatin vor der Bibliotheksgenerierung dargestellt.

Das optimal verdaute Profil wird durch die Größe einzelner Nukleosomenfragmente dominiert, während sie nicht überverdaut werden, um die Rückgewinnung von Nukleosomenfragmenten höherer Ordnung zu ermöglichen. Ein suboptimaler Verdau des Chromatins wird sich auch im Profil der Sequenzierungsbibliothek zeigen, die aus dem IP-Material generiert wurde. Um die Bibliotheken mittels qPCR zu validieren, wurde die Fold-Anreicherung von IP-Bibliotheken in Bezug auf die Eingabebibliothek auf positive und negative Ziele untersucht.

Darüber hinaus sollte die Inspektion der ausgerichteten Reads von Bibliotheken mit hoher qPCR-bewerteter Faltungsanreicherung auf einem Genombrowser visuell nachweisbare Anreicherungen im Vergleich zur Eingabebibliothek aufzeigen. Erfolgreiche ChIP-Sequenzierungsbibliotheken mit Nukleosomendichte enthalten hochkorrelierte Replikate mit einem signifikanten Anteil an ausgerichteten Reads innerhalb von MACS2-identifizierten angereicherten Peaks. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie native Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungsbibliotheken für die Nukleosomendichteanalyse generieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Chromatin optimal verdaut wird, und nur Antikörper zu verwenden, die eine hohe Affinität zu dem interessierenden Epitop aufweisen und eine geringe oder keine Kreuzreaktivität mit anderen Epitopen aufweisen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine computergestützte Modellierung der MNase-Zugänglichkeit durchgeführt werden, um Fragen wie epigenetische Signaturen aufgrund der Heterogenität innerhalb einer Zellpopulation zu beantworten.

Diese Methode bietet Einblicke in die kombinatorische Wirkung der Nukleosomenposition und der lokalen Dichte sowie der posttranslationalen Modifikation ihrer Histon-Untereinheiten und kann auf beliebige Systeme wie Mensch oder Maus, Primärzellen und gefrorenes Gewebe angewendet werden.