Name: Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Lernen Sie eine modifizierte native ChIP-seq-Methode zur Analyse der Nukleosomdichte, die MNase-Zugänglichkeit mit Histonmodifikationsmessungen kombiniert. Dieses Protokoll ermöglicht epigenetische Einblicke auf einzelner Nukleosom-Ebene.

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A.L. wurde von einem kanadischen Graduate Stipendium Canadian Institutes of Health Research unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse vom Genom British Columbia und die Canadian Institute of Health Research (CIHR-120589) als Teil der kanadischen Epigenetik, Umwelt und Gesundheit Forschungsinitiative Konsortium und der Terry Fox Research Institute Program unterstützt. Projekt Grant #TFF-122869, m.h. und ein Forschungsinstitut der Terry Fox New Investigator Award (Grant # 1039), m.h.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Angesichts der kombinatorischen der Chromatin-Modifikation und Nukleosom Positionierung in transcriptional Verordnung dürfte eine Methode, die ermöglicht die simultane Messungen dieser Funktionen bieten neue Einblicke in die epigenetischen Regulation. Hier vorgestellten NdChIP-Seq-Protokoll ist ein native ChIP-Seq-Protokoll so optimiert, dass um gleichzeitige Verhör Histon-Modifikationen und Nukleosom Dichte in seltenen Primärzellen9,10zu ermöglichen. NdChIP-Seq nutzt enzymatische Verdauung von Chromatin, wenn gepaart-End massiv parallelen Sequenzierung und ein "glockenförmig" Mischung Verteilungsmodell gekoppelt, ermöglicht die Untersuchung Histon Änderungen an einzelnen Nukleosom-Ebene und die Entfaltung der epigenomischen Profile getrieben von Heterogenität innerhalb einer Population. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir bereits eine eindeutige Verteilung der Immuno-ausgefällt Fragment Größen, bestimmt durch gepaart-End lesen Grenzen, verbunden mit bestimmten Chromatin Zustände definiert durch ChromHMM10,24berichtet.
Die Qualität einer NdChIP-Seq-Bibliothek hängt von mehreren Faktoren ab, z. B. Antikörper Spezifität und Sensitivität, optimale MNase Verdauung Bedingungen und Qualität des Chromatins. Die Besonderheit der verwendeten Antikörper ist entscheidend in der Herstellung von erfolgreichen NdChIP-Seq-Bibliothek. Ein ideale Antikörper zeigt hohen Affinität gegen das Epitop des Interesses mit kleinen Kreuz Reaktivität mit anderen Epitope. Es ist ebenso wichtig, magnetische Beads mit der höchsten Affinität für den Antikörper Wahl zu wählen.
MNase Verdauung ist eine kritische und zeitkritische und Konzentration Reaktion in diesem Protokoll. Daher bei der Verarbeitung von mehreren Proben ist es wichtig, dass jede Reaktion für eine äquivalente Menge an Zeit ausgebrütet wird (siehe Punkt 2.2). Die Qualität des Chromatins ist ein weiterer Faktor, der wesentlich das Ergebnis der NdChIP-FF fragmentierte Chromatin führt zu einem suboptimalen MNase Verdauung Profil und Ergebnisse in Bibliotheken mit einem low-Signal Rauschabstand bewirkt. Einzelproben mit niedrigen Zelle Lebensfähigkeit oder Chromatin, abgebaut, wie z. B. Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe sind nicht zu empfehlen für dieses Protokoll.
Die Zugabe von ein Bild während der Chromatin-Extraktion reduziert unerwünschte (d.h., zufällige) Chromatin Fragmentierung und Konserven Integrität der Histone Tails. Als solche muss PIC Lyse Puffer und Immunopräzipitation Puffer kurz vor hinzugefügt werden. Während Auswahl Zellen über Durchflusszytometrie, wählen Sie für lebensfähige Zellen und sorgen sind Zellen mit einer low-Flow-Rate zu erhöhen die Genauigkeit der Zelle Nummer Schätzung und Lebensfähigkeit der Zellen sortiert. Sortieren von Zellen direkt in Lyse Puffer zu vermeiden. Der Mantel-Puffer wird die Lyse-Puffer verdünnen und verhindert effektiv Permeabilisierung der Zellmembran auf MNase. Je nach einer Art von Zellen oder Organismus eventuell die Titration von MNase optimale Verdauung zu erhalten.
NdChIP-Seq auf Säugetier-Zellen erfordert eine minimale Sequenzierung Tiefe von 50 Millionen gepaart liest (25 Millionen Fragmente) für schmale Mark und 100 Millionen gepaart-liest (50 Millionen Fragmente) für große Marken und Input. Die Gaußsche Mischung Verteilung Algorithmus führt nicht optimal auf Bibliotheken, die bis zu einer Tiefe deutlich unterhalb dieser Empfehlung sequenziert worden. NdChIP-Seq wird nicht Promotoren mit wenig Trennung zwischen der gewichtete Verteilungswert für Mono - und di-Nukleosom-Fragment-Längen in Mono oder di-Nukleosom dominiert Promotoren klassifizieren. Daher müssen diese Promotoren in der nachfolgenden Analyse entfernt werden. Biologischer Replikate können generiert werden, um Vertrauen in die prognostizierten Ausschüttungen und technische Variabilität im MNase Verdauung und Bibliothek zu identifizieren.
Im Gegensatz zu früheren Iterationen der native ChIP-Seq-Protokolle ermöglicht NdChIP-Seq, kombinatorische Wirkung der Chromatin Struktur und Histon-Modifikationen zu untersuchen, durch die Verwendung von Fragment Größe Post Immunopräzipitation Nukleosom Dichte zu integrieren, durch MNase Zugänglichkeit mit Histon-Änderung-Messungen bestimmt. Anwendung des NdChIP-Seq primäre Zellen und Gewebe werden neuartige Einblicke in die integrative Art der epigenetischen Regulation und Identifizierung der epigenetischen Signaturen aufgrund der Heterogenität innerhalb der Bevölkerung ermöglichen.

Die eukaryotische Genom ist verpackt in Chromatin über Wiederholung Nukleosom-Strukturen, die aus zwei Kopien der vier Histonproteine (z.B.H2A, H2B, H3 und H4) umschrieben von 146 Basenpaare der DNA-1,2bestehen. Chromatin umgestaltet komplexe Nukleosom Position innerhalb gen Veranstalter Grenzen kontrollieren und Teilnahme an der Regulation der Genexpression durch Veränderung der Zugänglichkeit der DNA um Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase Maschinen3, 4.
Amino terminal Enden der Histone innerhalb der Nukleosom unterliegen verschiedenen kovalente Modifikationen, einschließlich der Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitylation, Sumoylierung, Formylation und Hydroxylierung von bestimmten Aminosäuren5 , 6 , 7 , 8. Positionen und Grad dieser Modifikationen diktieren einen Chromatin-Staat, der Chromatin Struktur und Kontrolle Zugang der molekularen komplexe beeinflussen, die Aktivierung der Transkription7ermöglichen. Angesichts der Tatsache, dass beide Nukleosom-Dichte und Histon-Modifikationen spielen eine Rolle in der lokalen Kontrolle der Gentranskription, entwickelten wir einen nativen ChIP-Ansatz, der es die gleichzeitige Messung von Nukleosom Dichte und Histon Änderung9ermöglicht, 10.
Native ChIP-Seq nutzt die Endonuklease Micrococci Nuklease (MNase) intakt Chromatin in seiner nativen Zustand bis zum Kern11,12, eine Eigenschaft zu verdauen, die genutzt wurden, um Nukleosom Positionierung13 Karte , 14 , 15. Nukleosom Dichte ChIP-Seq (NdChIP-Seq) nutzt die Eigenschaft des präferenziellen Zugang von MNase öffnen Regionen des Chromatins Messungen zu generieren, die MNase Zugänglichkeit mit Histon Änderung10zu kombinieren. NdChIP-Seq eignet sich für die Profilierung der Histon-Modifikationen in seltene primäre Zellen, Geweben und kultivierten Zellen. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll, das die Generation der Sequenz Datasets geeignet für eine zuvor beschriebenen analytischen Rahmen arbeiten10 , das Fragment Größe Post Immunopräzipitation ermöglicht, bestimmt durch gepaart-End Grenzen, um zu lesen integriert untersuchen Sie gleichzeitig MNase Zugänglichkeit mit Histon Modifikation Messungen. Früher Anwendung dieses Protokolls auf 10.000 primären menschlichen Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ Zellen und menschliche embryonale Stammzellen offenbart einzigartige Beziehungen zwischen Chromatin Struktur und Histon Änderungen innerhalb dieser Zelltypen10 . Aufgrund ihrer Fähigkeit, simultane Messung von Nukleosom Zugänglichkeit und Histon-Modifikation, NdChIP-Seq ist in der Lage ist, enthüllt epigenomischen Funktionen in einer Zellpopulation auf einem einzigen Nukleosom-Niveau, und Lösung von heterogenen Signaturen in ihre Tatbestandsmerkmale. Ein Beispiel für die Erforschung der heterogenen zellularen Bevölkerungen durch NdChIP-Seq ist Untersuchung der bivalenten Promotoren, wo sind H3K4me3, eine aktive Mark, und H3K27me3, eine repressive Mark vorhanden10.

<table><tbody><tr><td>1M Tris-HCl &ndash; pH 7,5</td><td>Thermo Scientific</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl &ndash; pH 8</td><td>Thermo Scientific</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma</td><td>1001385276</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>1001412354</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Desoxycholat</td><td>Sigma</td><td>1001437582</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Bicarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>100 % EtOH</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>V-Boden 96 Well-Platte (AB 1400)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1400-L</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P2 Pipettierer</td><td>Mandel</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P10 Pipettierer</td><td>Mandel</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P20 Pipettierer</td><td>Mandel</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P100 Pipettierer</td><td>Mandel</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P200 Pipettierer</td><td>Mandel</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P1000 Pipettierer</td><td>Mandel</td><td>F123603</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokokken-Nuklease&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>Thermomischer C (Heizblockmischer)</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12-Kanal Pippet P20</td><td>Rainin</td><td>17013803</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12-Kanal Pippet P200</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml LoBind Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml LoBind Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffplattenabdeckung</td><td>Edge Bio</td><td>48461</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Abdeckung</td><td>Bio Rad</td><td>MSD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumplattenabdeckung</td><td>Bio Rad</td><td>MSF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Elutionspuffer (EB-Puffer)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>1M DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22625004</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Protein A Dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Drehplattform</td><td>Mandel</td><td>1b109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Plattenmagnet</td><td>Alpaqua</td><td>2523</td><td></td></tr><tr><td>Gewölbter Streifen mit 12 Kappen</td><td>Bio Rad</td><td>TCS1201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer G2</td><td>Qiagen</td><td>1014636</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>Röhrenmagnet (DynaMag-2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Röhrenmagnet (DynaMag-2)</td><td>LabCore</td><td>730-006</td><td></td></tr><tr><td>V-förmiges Kunststoffreservoir</td><td>Mandel</td><td>S0100A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Mandel</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS2035</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Mandel</td><td>LB109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Schnellligationsreaktionspuffer, 5X</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Polymerase I, großes (Klenow) Fragment</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Klenow-Fragment (3'-5' exo)</td><td>NEB</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4-Polynukleotidkinase</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Desoxynukleotid-Lösungsmix, 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>dATP-Lösung 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>Schnelle T4-DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5'-Triphosphat (ATP), 25mM</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>Hank's gepufferte Salzlösung</td><td>ThermoScientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Thermo</td><td>Scientific A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Scientific 10010023</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Cell Signaling</td><td>9751S</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410037</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>pAb-069-050</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410056</td><td></td></tr><tr><td>SeraMag&nbsp; superparamagnetisch Perlen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von nativen chromatin immunopräzipitation sequenzierung bibliotheken für nukleosom dichteanalyse

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Wir präsentieren eine modifizierte native Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (ChIP-Seq) experimentelles Protokoll kompatibel mit einer Gaußschen Mischung basierende Distribution Analysemethodik (Nukleosom Dichte ChIP-Seq; NdChIP-Seq), die es die Generierung von ermöglicht kombinierte Messungen der micrococcal Nuklease (MNase) Barrierefreiheit mit Histon-Modifikationen genomweite. Nukleosom Position und lokale Dichte und die posttranslationale Modifikation ihrer Histon-Untereinheiten handeln, lokale Transkription Staaten zu regulieren. Kombinatorische Messungen der Nukleosom Zugänglichkeit mit Histon Änderungen erzeugt durch NdChIP-Seq ermöglicht die gleichzeitige Befragung dieser Funktionen. Die NdChIP-Seq-Methodik ist anwendbar auf geringe Mengen von Primärzellen für Vernetzung nach ChIP-Seq-Protokolle nicht zugänglich. Zusammengenommen, ermöglicht NdChIP-Seq die Messung von Histon-Modifikation in Kombination mit lokalen Nukleosom Dichte, neue Einblicke in die gemeinsame Mechanismen zu erhalten, die RNA-Transkription in seltenen primären Zellpopulationen zu regulieren.

Wir präsentieren eine modifizierte native Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (ChIP-Seq) Methodik für die Generation der Sequenz Datasets geeignet für ein Nukleosom Dichte ChIP-Seq analytischer Rahmen micrococcal Nuklease (MNase) Zugänglichkeit zu integrieren mit Histon Modifikation Messungen.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, native Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungs-Bibliotheken für die Analyse der Nukleosomendichte zu erzeugen. Diese Methode kann Fragen in der Epigenetik beantworten, beispielsweise indem sie epigenomische Merkmale in einer Zellpopulation auf Ebene einzelner Nukleosomen offenlegt und heterogene Chromatinsignaturen in ihre kontinuierlichen Elemente auflöst. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, die Eigenschaft von MNase, die bevorzugt offene Chromatinbereiche zugänglich macht, zu nutzen, um eine Messung zu erzeugen, die die MNase-Zugänglichkeit mit der Histonmodifikation kombiniert.Im Allgemeinen haben Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie keine optimale MNase-Digestion erzielen können. Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Zellpräparation, wie im Textprotokoll beschrieben. Am ersten Tag tauen Sie jedes Zellpellet 10 Sekunden lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf.Überführen Sie die Zellen anschließend auf Eis. Geben Sie zu jedem Zellenpellet sofort eiskaltes 1×-Lysepuffer sowie 1× PIC in einer Endkonzentration von 10.000 Zellen pro 20 Mikroliter zu. Mischen Sie durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren, ohne Blasen zu bilden.Unter Arbeit auf Eis 20 µL pro Vertiefung der resultierenden Lysate in eine 96-Loch-Platte aliquotieren. Die Platte vor der Inkubation 20 Minuten auf Eis mit der Kunststoffabdichtung abdecken. Die Platte als MNase beschriften und die Vertiefungen in einem Vorlageschlüssel dokumentieren.Kurz bevor die 20-minütige Lyse abgeschlossen ist, verdünnen Sie die MNase-Einzelenzyme mit MNase-Verdünnungspuffer auf eine Endkonzentration von 20 Einheiten pro Mikroliter und stellen Sie es auf Eis. Unter Arbeit auf Eis bereiten Sie die Master-Mischung für die MNase-Einzelverdauung gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Anschließend entnehmen Sie 20 Mikroliter der Master-Mischung für jede Probezeile sowie zusätzlich fünf Mikroliter in eine 96-Well-Vorratsplatte.Nachdem die Lysate die Inkubation abgeschlossen haben, nehmen Sie die MNase-Digestionsplatte vom Eis. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter der MNase-Digestions-Hauptmischung in jede Probezeile und mischen Sie durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren. Wechseln Sie die Spitzen zwischen den Reihen.Anschließend die Platte genau fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Um die Reaktion nach fünf Minuten zu stoppen, mit einer Mehrkanalpipette sechs Mikroliter 250-Mikromolar-EDTA zu jeder Probe Reihe hinzufügen und mehrmals auf und ab pipettieren, um zu mischen. Zwischen den Reihen unbedingt die Pipettenspitzen wechseln.Nach der Zugabe von EDTA die Einstellung der Pipette auf 20 Mikroliter umstellen und 10-mal wie zuvor mischen, um sicherzustellen, dass die Verdauungsreaktion vollständig gestoppt ist. Schließlich sechs Mikroliter 10X-Lysepuffer zu jeder Reihe der MNase-verdauten Proben hinzufügen und durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen. Die Platte mit einer Kunststoffabdichtung abdecken und 15 Minuten auf Eis inkubieren.Bereiten Sie die Antikörper-Perlen-Komplex-Platte und die Vorreinigungsplatte wie im Textprotokoll beschrieben vor. Zentrifugieren Sie beide Platten kurz für 10 Sekunden bei 200 ×g. Anschließend stellen Sie die Antikörper-Perlen-Komplex-Platte auf einen Plattenmagneten und warten Sie 15 Sekunden, bis die Lösung klar wird. Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette, ohne die Perlen zu stören.Entfernen Sie dann die Platte vom Plattenmagneten und stellen Sie sie auf Eis. Stellen Sie die Platte mit der Vorreinigungsreaktion auf einen Plattenmagneten und warten Sie 15 Sekunden, bis sich die Perlen abgetrennt haben und die Lösung klar ist. Übertragen Sie unter Vermeidung von Verwirbelungen der Perlen mit einer Pipette vorsichtig den Überstand in die entsprechenden Vertiefungen der Platte mit den Antikörper-Perlen-Komplexen, die auf Eis gehalten wird.Mischen Sie jede Vertiefung vorsichtig durch 15-maliges Auf- und Abpipettieren. Verschließen Sie die Vertiefung mit einer Aluminiumplatte und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform. Nach der Inkubation beschriften Sie die Platte erneut als IP-Reaktionsansatz.Am zweiten Tag den Heizrührer auf 65 Grad Celsius einstellen und dann einen Puffer mit niedriger Salzkonzentration und einen Puffer mit hoher Salzkonzentration auf Eis vorbereiten. Die IP-Reaktionsplatte 10 Sekunden bei 200 × g kurz zentrifugieren. Die IP-Reaktionsplatte auf einen Plattenmagneten stellen und 15 Sekunden warten, bis die Lösung klar wird. Mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig, ohne die Perlen zu stören, den Überstand abnehmen und verwerfen.Nehmen Sie die Platte vom Plattenmagneten und stellen Sie sie auf Eis. Geben Sie zu jeder Probe in der IP-Reaktionsplatte 150 µL eiskalten Puffer mit niedrigem Salzgehalt und pipettieren Sie langsam 10-mal auf und ab, um die Perlen vollständig zu resuspendieren. Stellen Sie die IP-Reaktionsplatte erneut auf den Plattenmagneten und entfernen Sie die Überstände wie zuvor.Danach die Platte erneut auf Eis stellen und die Waschschritte insgesamt zweimal wiederholen. Unter Arbeit auf Eis 150 Mikroliter des Pufferlösungsreagenz mit hohem Salzgehalt zu jeder Probezeile in der IP-Reaktionsplatte hinzufügen. Die Proben langsam durch 10-maliges Auf- und Abpipettieren mischen, um die Kügelchen vollständig neu aufzuschwemmen.Nachdem das Überstand wie zuvor entfernt wurde, stellen Sie die IP-Reaktionsplatte auf Eis und kühlen eine neue 96-Well-Platte daneben vor. Geben Sie zu jeder Probe in der IP-Reaktionsplatte 150 Mikroliter Puffer mit hohem Salzgehalt hinzu und mischen Sie langsam 10-mal durch Auf- und Abpipettieren, um die Kügelchen vollständig zu resuspendieren. Nach der Resuspension überführen Sie jede Probe in die entsprechende Reihe der neuen, vorgekühlten 96-Well-Platte.Entfernen Sie die alte Platte. Stellen Sie die neue IP-Reaktionsplatte auf den Plattenmagneten und entfernen Sie den Überstand wie zuvor. Halten Sie die Platte bei Raumtemperatur.Fügen Sie jeder Probe in den Reihen der IP-Reaktionsplatte 30 Mikroliter ChIP-Elutionspuffer hinzu und mischen Sie vorsichtig durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren. Achten Sie darauf, die Bildung von Blasen zu vermeiden. Verschließen Sie die Platte mit einer PCR-Abdeckung und inkubieren Sie sie 1½ Stunden bei 65 °C in einem Heizrührgerät mit einer Rührgeschwindigkeit von 1.350 U/min.Nach einer 1 1/2-stündigen Inkubation die IP-Reaktionsplatte bei 200 ×g eine Minute lang bei vier Grad Celsius abzentrifugieren. Danach die IP-Reaktionsplatte auf einen Plattenmagneten stellen und warten, bis die Lösung klar ist. Mit einer Mehrkanalpipette, ohne die Perlen zu stören, vorsichtig 20 Mikroliter des Überstandes unter Verwendung frischer Spitzen für jede Reihe in eine neue 96-Loch-Platte übertragen.Die Platte mit „IP-Reaktion“ beschriften und bei Raumtemperatur aufbewahren. Danach wie im Textprotokoll beschrieben die Proteindigestion und anschließend die Bibliothekskonstruktion durchführen. Hier sind repräsentative Ergebnisse einer optimalen, unterverdauten und überverdauten MNase-verdauten Chromatinprobe vor der Bibliotheksgenerierung dargestellt.Das optimal verdauten Profil wird von Fragmenten einzelner Nukleosomen dominiert, ohne überverdaut zu sein, um die Rückgewinnung von Fragmenten höherer Ordnung zu ermöglichen. Eine suboptimale Verdauung des Chromatins zeigt sich ebenfalls im Profil der aus dem IP-Material erzeugten Sequenzierbibliothek. Zur Validierung der Bibliotheken mittels qPCR wurde die Anreicherung der IP-Bibliotheken im Vergleich zur Input-Bibliothek für positive und negative Zielstrukturen bestimmt.Außerdem sollte die Untersuchung der alignierten Reads von Bibliotheken mit hoher, mittels qPCR bewerteter Anreicherung im Genombrowser im Vergleich zur Input-Bibliothek sichtbare Anreicherungen zeigen. Erfolgreiche ChIP-Sequencing-Bibliotheken zur Nukleosomendichte enthalten hochgradig korrelierte Replikate mit einem signifikanten Anteil an alignierten Reads innerhalb der durch MACS2 identifizierten angereicherten Peaks. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie native Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungs-Bibliotheken für die Analyse der Nukleosomendichte erzeugt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Chromatin optimal verdaut wird, und ausschließlich Antikörper zu verwenden, die eine hohe Affinität für das gewünschte Epitop aufweisen und nur geringe oder keine Kreuzreaktivität mit anderen Epitopen zeigen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine computergestützte Modellierung der MNase-Zugänglichkeit durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise bezüglich epigenetischer Signaturen aufgrund der Heterogenität innerhalb einer Zellpopulation.Diese Methode liefert Einblicke in den kombinatorischen Effekt der Nukleosomenposition und lokalen Dichte sowie der posttranslationalen Modifikation ihrer Histon-Untereinheiten und kann auf beliebige Systeme wie menschliche oder murine Zellen, Primärzellen und gefrorene Gewebe angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

In diesem Video demonstrieren wir die Chromatin-Immunpräzipitationstechnik zur Identifizierung von Proteinbindungsstellen an spezifischen Regionen der genomischen DNA von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch die selektive Immunpräzipitation von proteingebundenen Chromatinfragmenten. Diese Methode hilft, das Zusammenspiel mehrerer regulatorischer Proteine zu untersuchen, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die an der Genregulation beteiligt sind.

Chromatin-Immunpräzipitation zur Identifizierung von Zielprotein-Bindungsstellen auf genomischer DNA

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Methoden zur Kartierung von Protein-DNA-Interaktionen in vivo werden für jeden Aspekt der Genomforschung immer wichtiger, aber sie sind mühsam, kostspielig und zeitaufwändig. Hier wird ein kommerziell verfügbares robotisches Liquid-Handling-System vorgestellt, das die Chromatin-Immunpräzipitation automatisiert, um in vivo Protein-DNA-Wechselwirkungen mit begrenzten Zellmengen abzubilden.

Automatisierung von ChIP-seq Experimente Epigenetische Profile auf 10.000 HeLa-Zellen zu generieren

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

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Die Anreicherung und Sequenzierung von proteinassoziierter junger DNA (eSPAN) wurde entwickelt, um die relative Häufigkeit eines chromatinassoziierten Proteins auf zwei replizierenden DNA-Strängen zu erkennen und so molekulare Einblicke in die Chromatinreplikation und ihre gekoppelten Prozesse zu gewinnen. Dieses Protokoll beschreibt eSPAN-Verfahren in Hefe- und Mausembryonalen Stammzellen (ES).

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Lernen Sie eine modifizierte native ChIP-seq-Methode zur Analyse der Nukleosomdichte, die MNase-Zugänglichkeit mit Histonmodifikationsmessungen kombiniert. Dieses Protokoll ermöglicht epigenetische Einblicke auf einzelner Nukleosom-Ebene.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

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