Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da wir lernen, dass Gliazellen morphologisch, funktionell und genetisch regional heterogen sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie drei separate Glia-Untergruppen aus vier verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems untersuchen können. Dieses Verfahren werden von mir und Rachel Tinky, einer Doktorandin in meinem Labor, demonstriert.

Schneiden Sie mit einer feinen Schere die Hautschicht entlang der Mittellinie des Kopfes des Welpen ab, beginnend kaudal und rostral bis zur Schnauze. Vermeiden Sie es, tief in den Schädel zu schneiden, um Gewebeschäden zu vermeiden. Winkeln Sie den Kopf nach unten ab, ziehen Sie die Hautschicht zu jeder Seite des Schädels und machen Sie mit einer Federschere einen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels, beginnend am Foramen magnum.

Ziehe die Schädelhälften mit einer Pinzette mit feiner Spitze auseinander und lege die Hirnrinde, das Kleinhirn und den Hirnstamm frei. Heben Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Schädel und legen Sie es in eine 10 Zentimeter große Petrischale mit 10 Millilitern PBS und Antibiotikalösung. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn unbeschädigt bleibt, wenn das Hinterhirn befestigt ist.

Kneifen Sie das Kleinhirn mit einer fein gebogenen Pinzette ab. In ein dafür vorgesehenes konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis geben. Trennen Sie das Mittelhirn von der Hirnrinde.

Entfernen Sie die kortikalen Hirnhäute und legen Sie sie in eine dafür vorgesehene konische Röhre. Das Gewebe muss sorgfältig untersucht werden, um eine vollständige Entfernung der Hirnhäute zu gewährleisten. Wenn Meningealzellen in der Kultur verbleiben, können sie sich nachteilig auf das Wachstum von Gliazellen auswirken.

Um das Rückenmark zu präparieren, legen Sie es mit der Bauchseite nach oben und schneiden Sie mit einer feinen Federschere die Wirbel abwechselnd auf der linken und rechten Seite, bis das Rückenmarksgewebe freigelegt ist. Entfernen Sie vorsichtig das Rückenmark und die Hirnhäute und legen Sie sie in die dafür vorgesehene konische Röhre auf Eis. Geben Sie einen Milliliter 0,05 % Trypsin mit 0,53 millimolaren EDTA in jedes Röhrchen mit dem Gewebe.

Zerreiben Sie die Mischung mit einer 10-Milliliter-Pipette etwa 20 Mal. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein leeres konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Sanftes Rühren der Lysate nach acht Minuten. Nach der Inkubation fügen Sie fünf Milliliter MGM und 200 Mikroliter DNase I eins in jedes Röhrchen hinzu, um eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Trituieren Sie jedes Lysat 10 Mal mit einer 10-Milliliter-Pipette.

Lassen Sie die Zellsuspension dann drei Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen, damit sich nicht dissoziiertes Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen kann. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen, wobei das nicht dissoziierte Gewebe zurückbleibt. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in fünf Millilitern MGM resuspendieren und 20 mal verreiben. Plattieren Sie die Zellsuspensionen auf beschichtete T25-Kolben und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden, um Zellreste zu entfernen. Um die Isolierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durchzuführen, schütteln Sie die Zellen 15 Stunden lang, entfernen Sie dann den Überstand aus dem Kolben und legen Sie ihn auf eine sterile Petrischale. Inkubieren Sie den Überstand 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Nach 15 Minuten schwenken, um verbleibende Mikroglia zu entfernen. Entfernen Sie den nicht adhärenten Zellüberstand, zählen Sie die Zellen und plattieren Sie sie auf einer Poly-D-Lysin-beschichteten Oberfläche in der gewünschten Konzentration. Bringen Sie die Zellen für mindestens eine Stunde in den Inkubator zurück.

Saugen Sie dann vorsichtig 95 % des Mediums an und fügen Sie langsam warmes OPC-Medium hinzu, indem Sie es gegen die Wand der Vertiefung pipettieren, um die Störung der OPCs zu minimieren. Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass der Interferon-Gamma-Signalweg die OPC-Differenzierung und -Reifung beeinflusst. Ohne den Interferon-Gamma-Rezeptor differenzieren sich kortikale OPCs nicht ohne weiteres in reife myelinisierende Oligodendrozyten, was durch das Fehlen einer MBP-Färbung belegt wird.

Die Expression von GFAP wurde ebenfalls analysiert. Interferon-gamma-defiziente Zellen exprimieren stark GFAP, was darauf hindeutet, dass sie einen astrozytären Phänotyp annehmen könnten. Die regionale Heterogenität der ZNS-Zellen wird durch eine unterschiedliche Astrozytenmorphologie in der Hirnrinde, im Kleinhirn, im Hirnstamm und im Rückenmark belegt.

Astrozyten aus der gleichen Region können auch morphologische Heterogenität aufweisen, was die Annahme unterstützt, dass dieser gliale Subtyp hochdynamisch ist. Regionale Reaktionen von OPCs auf differentielle Zytokinstimulation wurden ebenfalls untersucht. Die Zytokin-Signalgebung beeinflusst das Verhalten von Stamm- und Immunzellen erheblich und kann beeinflussen, wie sich die OPCs zu reifen myelinisierenden Oligodendrozyten differenzieren.

Nach der regionalen Isolierung von Gliazellen können Zellen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen und unter Verwendung verschiedener Techniken, einschließlich Immunhistochemie, quantitativer Echtzeit-PCR und Western Blotting, verwendet werden.