Name: LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie die LarvaSPA-Methode zur Langzeit-Zeitraffer-Imaging von Drosophila-Larven für neuronale Entwicklungsstudien. Diese Technik ermöglicht über 10 Stunden kontinuierliche Bildgebung peripherer sensorischer Neuronen und Dendritenwachstum.

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Wir danken Lingfeng Tang für die Einrichtung einer früheren Version der LarvaSPA-Methode; Glenn Swan von Cornell Olin Hall Machine Shop für frühere Prototypen der Bildgebungskammer; Philipp Isermann für den Bau von Metallrahmen und Vorschläge zur Herstellung von PDMS-Quadern; Cornell BRC Imaging-Anlage für den Zugang zu Mikroskopen (finanziert durch NIH-Zuschuss S10OD018516); Maria Sapar für die kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch ein Cornell Fellowship unterstützt, das H.J. verliehen wurde; ein Cornell-Start-up-Fonds und NIH-Stipendien (R01NS099125 und R21OD023824), die an C.H. H.J. und C.H. vergeben wurden, konzipierten das Projekt und entwarfen die Experimente. H.J. führte die Experimente durch. H.J. und C.H. schrieben das Manuskript.

1. Herstellung der Bildgebungskammer
<ol><li>Der Metallrahmen kann aus einem Aluminiumblock in einer typischen Maschinenwerkstatt gefertigt werden. Die Spezifikationen des Rahmens sind in Abbildung 1Adargestellt.</li>
	<li>Um die Bildkammer zu konstruieren, versiegeln Sie die Unterseite des Metallrahmens mit einem langen Abdeckschlupf (22 mm x 50 mm) und UV-Kleber(Abbildung 1A). Den UV-Kleber mit einer handgehaltenen UV-Lampe aushärten.</li>
</ol>2. Herstellung von PDMS-Quadern
<ol><li>Bereiten Sie die Form für PDMS-Quader vor.<ol>
<li>Befestigen Sie Schichten von Verpackungsband an der Innenfläche einer rechteckigen (80 mm x 55 mm) Petrischale oder runden Zellkulturplatte. Verwenden Sie eine Schicht (0,063 mm dick) für zweite Instar-Larven, 2 Schichten (0,126 mm dick) für frühe dritte Insternlarven oder drei Schichten (0,189 mm dick) für spätdritte Instarlarven(Abbildung 1B).</li>
		<li>Schneiden Sie das Band in Streifen mit spezifischer Breite mit einer Rasierklinge: 1,5 mm für das 1-Schicht-Band und 2 mm für 2-Schicht- oder 3-Schicht-Band. Die Breite und Dicke des Streifens bestimmt die Größe der Larven, die der endgültige PDMS-Quader aufnehmen kann. Lassen Sie mindestens einen Abstand von 5 mm zwischen den beiden Streifen. Entfernen Sie die Bandschichten, die den Raum abdecken (Abbildung 1B).</li>
		<li>Entfernen Sie Staub von der Innenfläche der Platte mit Klebeband. Die Form ist einsatzbereit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie den PDMS-Mix vor.<ol>
<li>7 g PDMS-Basis und 0,7 g Aushärtungsmittel (10:1-Verhältnis) in einem kleinen Behälter gründlich mischen.</li>
		<li>Legen Sie den Behälter mindestens 15 min in einen Vakuumaustrocknungsor, um Luft aus dem Gemisch zu entfernen.</li>
		<li>Etwa 5,5 g PDMS-Mischung langsam auf die Form gießen, um eine Dicke von 1–2 mm zu erreichen (Abbildung 1B).</li>
		<li>Legen Sie das PDMS-Gemisch mindestens 15 min im Vakuumaustrocknungsor wieder auf, um die verbleibenden Luftblasen aus der Mischung zu entfernen. Brechen Sie die letzten Blasen mit einer Pipettenspitze.</li>
		<li>Das PDMS auf einer ebenen Oberfläche in einem Wärmeinkubator bei 65 °C für 2 h aushärten.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das ausgehärtete PDMS entlang der Kante der Form zu lösen und von der Form zu lösen. Bewahren Sie das PDMS zwischen zwei Stücken großem Klebeband bei Raumtemperatur auf.</li>
		<li>Schneiden Sie das PDMS für frühe und späte dritte Instar-Larven in 8 mm x 2 mm x 1 mm Quader (entlang der gepunkteten Linien in Abbildung 1B) durch Positionierung der Nut, die durch den Bandstreifen (Schritt 2.1.2) in der Mitte der langen Seite des Quaders erzeugt wird (Abbildung 1B,C). Für zweite Instar-Larven den Quader auf 8 mm x 1 mm x 1 mm schneiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montage von Larven für langzeitzeitliche Zeitraffer-Bildgebung
<ol><li>Bereiten Sie den oberen Deckelschlupf für die Montage vor.<ol>
<li>Wählen Sie sechs PDMS-Quader mit Nuten, die den Größen der Larven entsprechen. Befolgen Sie die empfohlene Nut und Größe von PDMS basierend auf den Schritten 2.1.1, 2.1.2 und 2.2.7.</li>
		<li>Entfernen Sie Staub von der Oberfläche des PDMS mit Klebeband.</li>
		<li>Befestigen Sie vier Stück doppelseitiges Klebeband (12 mm x 5 mm) auf einem langen Abdecksch (22 mm x 50 mm) zur späteren Befestigung von PDMS-Quadern. Die Leerzeichen zwischen den beiden Stücken doppelseitig liegendem Band sollten mit der Breite der PDMS-Nut identisch sein.</li>
		<li>Tragen Sie einen kleinen Tropfen UV-Kleber in die Nut jedes PDMS-Quaders auf und fügen Sie sechs kleine Tropfen UV-Kleber in den Raum zwischen dem doppelseitigen Klebeband auf dem Deckel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Larven für die Montage vor.<ol>
<li>Reinigen Sie die Larven mit einem Zangenpaar in Wasser, um Nahrung von der Körperoberfläche zu entfernen.</li>
		<li>Legen Sie saubere Larven auf ein kleines Stück befeuchtetes Tissuepapier in eine kleine (35 mm) Petrischale ohne Deckel. Legen Sie die kleine Petrischale in eine große (60 mm) Petrischale mit einem Stück Trockenpapier. In einer chemischen Haube 8–12 Tropfen (160–240 l) Isofluran e.V. mit einer Kunststoff-Transferpipette auf das Trockenepapier auftragen und den Deckel der großen Petrischale schließen.</li>
		<li>Warten Sie 2–3 min, während Sie die Larven überwachen. Nehmen Sie die Larven aus der großen Petrischale heraus, sobald ihre Mundhaken aufhören sich zu bewegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montieren Sie die Tiere.<ol>
<li>Um Strukturen auf der Dorsalseite des Tieres abzubilden, legen Sie die immobilisierten Larven auf den UV-Kleber zwischen dem doppelseitigen Klebeband auf dem Deckblatt mit der dorsalen Nagelhaut, die dem Deckel zugewandt ist.</li>
		<li>Bedecken Sie jede Larve mit einem PDMS-Block und passen Sie den Stamm der Larve in die Nut des PDMS. Lassen Sie den Kopf und den Schwanz der Larve außerhalb der PDMS-Nut. Vermeiden Sie es, die Spappel der Larve durch den Kleber zu blockieren.</li>
		<li>Drücken Sie auf die Enden des PDMS-Blocks auf das doppelseitige Band, ohne Kraft auf die Nut anzuwenden. Ziehen Sie vorsichtig am Schwanz der Larve, um die Nagelhaut unter dem PDMS abzuflachen.</li>
		<li>Den UV-Kleber 4 min mit einer handgehaltenen UV-Lampe an der hohen Einstellung (bei ca. 0,07 mW/mm2)aushärten. VORSICHT: Schützen Sie die Augen mit einer Schutzbrille, während Sie die UV-Lampe verwenden.</li>
		<li>Drehen Sie den Coverslip auf den Kopf und wiederholen Sie Schritt 3.3.4.</li>
		<li>Befeuchten Sie ein kleines Stück Linsenpapier (15 mm x 30 mm) mit 20 l–30 l Wasser. Legen Sie das befeuchtete Linsenpapier an der Unterseite der Bildkammer (Abbildung 1A,D).</li>
		<li>Legen Sie den Deckelaufschub auf die Kammer, so dass die Larven nach innen in die Kammer blicken. Mit UV-Kleber an beiden Enden des Deckels an der Metalloberfläche anhaften (Abbildung 1A,D). Die Dorsalseite der Larven ist unter dem konfokalen Mikroskop zur Bildgebung bereit (Abbildung 1E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Imaging
<ol><li>Bildlarven mit einem geeigneten Mikroskop. Alle in diesem Protokoll gezeigten Ergebnisse (Abbildung 2, Abbildung 3, Video S2, Video S3und Video S4) wurden mit einem konfokalen System mit einem 40x (1.30 NA) Ölobjektiv erworben.</li>
</ol>5. Wiederherstellung von Bildkammer und PDMS-Quadern
<ol><li>Entfernen Sie nach der Bildgebung das Öl auf dem oberen Deckelmitrutsche mit einem Linsenpapier. Lösen Sie den oberen Deckelrutsch vom Metallrahmen, indem Sie mit einer Rasierklinge in den Raum zwischen dem Coverslip und dem Metallrahmen schneiden. Die Bildgebungskammer ist wiederverwendreif.</li>
	<li>Lösen Sie die PDMS-Quader mit Zangen vom oberen Deckel. Rollen Sie die PDMS-Quader auf Klebeband, um Klebstoffrückstände und Staub zu entfernen. Die PDMS-Quader sind wiederverwendreif.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Hier beschreiben wir LarvaSPA, eine vielseitige Methode zur Montage lebender Drosophila-Larven für die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung. Diese Methode erfordert keine Wiederherstellung oder Wiedermontage von Larven, was eine unterbrechungsfreie Bildgebung ermöglicht. Es ist daher ideal für die Verfolgung biologischer Prozesse, die Stunden in Anspruch nehmen, wie Zerstitendegeneration und Regeneration. Diese Methode kann auch für die Bildgebung intrazellulärer Kalziumdynamik und subzelluläre Ereignisse wie Mikrotub...

Die Zeitraffer-Live-Bildgebung ist eine leistungsstarke Methode zur Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse. Die räumlichen und zeitlichen Informationen, die von Zeitrafferfilmen bereitgestellt werden, können wichtige Details für die Beantwortung zellbiologischer Fragen aufdecken. Die Drosophila Larve ist ein beliebtes In-vivo-Modell für Untersuchungen mit Live-Bildgebung, weil ihre transparente Körperwand eine nichtinvasive Bildgebung der inneren Strukturen1,2ermöglicht. Darüber hinaus stehen in Drosophila zahlreiche genetische Werkzeuge zur Fluoreszenz zur Kennzeichnung anatomischer Strukturen und Makromoleküle zur Verfügung3. Jedoch, langfristige Zeitraffer-Bildgebung von Drosophila Larven ist eine Herausforderung. Im Gegensatz zu stationären frühen Embryonen oder Pupas bewegen sich Drosophila-Larven ständig, was eine Immobilisierung für die Live-Bildgebung erforderlich macht. Effektive Möglichkeiten zur Immobilisierung lebender Drosophila-Larven umfassen die Montage in Halocarbonöl mit Chloroform4,anästhesieren mit Isofluran- oder Dichlorvos-Lösung5, und das Komprimieren zwischen dem Deckelrutsch und dem Mikroskopschlitten6. Obwohl einige dieser Methoden für die Mikroskopie verwendet wurden, keine von ihnen ist wirksam für langfristige Live-Bildgebung. Andere Methoden wurden für die Bildgebung von Körperwandneuronen in kriechenden Larven mittels konventioneller konfokaler Mikroskopie oder Lichtbogenmikroskopie7,8,9entwickelt. Diese Methoden sind jedoch nicht ideal für die Überwachung der zellulären Dynamik aufgrund der Bewegung der Larven.
Neue Methoden wurden entwickelt, um eine langfristige Zeitraffer-Bildgebung von Drosophila-Larven zu erreichen. Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) "Larvenchip" können Drosophila-Larven durch vakuumgenerierte Absaugung in einer spezialisierten Mikrokammer ohne Anästhesisierung effektiv immobilisiert werden. Diese Methode bietet jedoch keine hohe zeitliche Auflösung für zellbiologische Studien und hat strenge Einschränkungen für die Tiergröße10. Eine andere Methode mit einem Anästhesisierungsgerät erreicht Live-Bildgebung von Drosophila Larven an mehreren Zeitpunkten und wurde angewendet, um neuromuskuläre Knoten11,12,13,14,15,16. Diese Methode erlaubt jedoch auch keine kontinuierliche Bildgebung länger als 30 min und erfordert die wiederholte Verwendung von Desfluran, was die neuronale Aktivität hemmen und den untersuchten biologischen Prozess beeinflussen kann17,18. Kürzlich wurde eine neue Methode, die mikrofluidische Vorrichtung und Kryoanesthesie kombiniert, verwendet, um Larven verschiedener Größen für kurze Zeiträume (Minuten) zu immobilisieren19. Diese Methode erfordert jedoch spezielle Geräte wie ein Kühlsystem und längere Immobilisierungsphasen erfordern eine wiederholte Kühlung der Larven.
Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode zur Immobilisierung von Drosophila-Larven, die mit ununterbrochener Zeitraffer-Bildgebung länger als 10 h kompatibel ist. Bei dieser Methode, die wir "Larvenstabilisierung durch Partielle Befestigung" (LarvaSPA) nennen, wird die Larvenhaut an einem Deckblatt für die Bildgebung in einer kundenspezifischen Bildgebungskammer anhaften. Dieses Protokoll beschreibt, wie man die Bildkammer macht und wie man Larven in einer Vielzahl von Entwicklungsstadien montiert. Bei der LarvaSPA-Methode werden die gewünschten Körpersegmente mit einem UV-reaktiven Kleber am Deckschein befestigt. Ein PDMS-Quader übt zusätzlich Druck auf die Larven aus und verhindert so das Entweichen. Die Luft und Feuchtigkeit in der Bildkammer sichern das Überleben der teilweise immobilisierten Larven während der Bildgebung. Vorteile von LarvaSPA gegenüber anderen Techniken sind die folgenden: (1) Es ist die erste Methode, die eine kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven für Stunden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht; (2) Die Methode hat weniger Beschränkungen für die Larvengröße; (3) Die Bildkammer und PDMS-Quader können zu minimalen Kosten hergestellt werden und sind wiederverwendbar.
Neben der Beschreibung der Larvenmontagemethode, bieten wir mehrere Beispiele für seine Anwendung für die Untersuchung der Dendritenentwicklung und Dendritendegeneration von Drosophila dendritischen Arborisation (da) Neuronen.

<table><tbody><tr><td>6061 Aluminiumstangen</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K421</td><td></td></tr><tr><td>3M doppelseitiges Klebeband</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16093</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch Verpackungsband</td><td>3M</td><td></td><td>1.88"W x 22.2 Yards</td></tr><tr><td>DUMONT #3 Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-241-34</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckglas</td><td>Azer Scientific</td><td>1152250</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>193.33161.3</td><td></td></tr><tr><td>Leica Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>SP8 ausgestattet mit einem Resonanzkörper scanner</td><td></td></tr><tr><td>Linsenpapier</td><td>Berkshire</td><td>LN90.0406.24</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (mittel)</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (klein)</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-20</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckige Petrischale</td><td>VWR</td><td>25384-322</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit (PBMS Kit)</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1371126</td><td></td></tr><tr><td>UV-Kleber</td><td>Norland products</td><td>#6106, NOA 61</td><td>Brechungsindex 1,56</td></tr><tr><td>UV-Lampe (Workstar 2003)</td><td>Maxxeon</td><td></td><td></td>MXN02003</tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71232</td><td></td></tr><tr><td>Tücher</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimwipes</td><td></td></tr></tbody></table>

larvaspa, eine methode zur montage von drosophila larva für langzeit-zeitraffer-imaging

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live Imaging ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung zellbiologischer Fragen. Die Drosophila Larve eignet sich besonders für in vivo Live-Bildgebung, da die Larvenkörperwand und die meisten inneren Organe transparent sind. Die kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven über 30 min war jedoch eine Herausforderung, da es schwierig ist, Larven lange Zeit nicht invasiv zu immobilisieren. Hier präsentieren wir eine Larvenmontagemethode namens LarvaSPA, die eine kontinuierliche Bildgebung von lebenden Drosophila-Larven mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung für länger als 10 Stunden ermöglicht. Bei diesem Verfahren werden Larven teilweise mit einem UV-reaktiven Kleber am Deckschein befestigt und zusätzlich die Larvenbewegung mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Block zurückgeschraubt. Diese Methode ist mit Larven in Entwicklungsstadien vom zweiten Instar bis zum wandernden dritten Instern kompatibel. Wir zeigen Anwendungen dieser Methode bei der Untersuchung dynamischer Prozesse von Drosophila somatosensorischen Neuronen, einschließlich Dendritenwachstum und verletzungsinduzierter Dendritendegeneration. Diese Methode kann auch angewendet werden, um viele andere zelluläre Prozesse zu studieren, die in der Nähe der Larvenkörperwand passieren.

Die Larven-Bildkammer wird durch Verkleben eines maßgeschneiderten Metallrahmens und zweier Abdeckungen konstruiert. Das Design des Metallrahmens ist in Abbildung 1Aangegeben. Drosophila-Larven in der Kammer werden mit Hilfe von UV-Kleber und PDMS-Quadern am oberen Deckelbedeckungsslip aufgeklebt. Die Nut auf dem PDMS-Quader und das doppelseitige Band des Quaders wird befestigt, um den Raum für die Larven zu schaffen (Abbildung 1B,C). Das PDMS ü...

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Montage von Drosophila-Larven, um länger als 10 h ununterbrochene Zeitraffer-Bildgebung bei intakten lebenden Tieren zu erreichen. Diese Methode kann verwendet werden, um viele biologische Prozesse in der Nähe der Larvenkörperwand abzubilden.

LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

LarvaSPA ist die erste Methode, die eine kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven für mehr als 10 Stunden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht. Diese Methode wird verwendet, um dynamische zelluläre Prozesse von Larven periphere sensorische Neuronen zu enthüllen und für die Untersuchung vieler anderer zellulärer Prozesse, die in der Nähe der Larvenkörperwand geschehen. Diese Methode ist einfach zu bedienen und hat weniger Begrenzung auf Larvengröße.Sechs bis neun Larven können gleichzeitig in der Bildkammer montiert werden, was das Experiment ermöglicht. Die Bildgebungskammer der PDMS-Quader kann kostengünstig hergestellt werden und ist wiederverwendbar. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von Mechanismen der Dendritenentwicklung und Dendritendegeneration mit drosophila larva dendritischen Autorisierung neuronen.Die Möglichkeit, das gleiche Neuron stundenlang abzubilden, kann zeigen, wie langfristige globale Veränderungen dendritischer Muster aus kurzfristigen Verhaltensweisen auf der Ebene der einzelnen Zweigstellen entstehen. Die Verwendung von PDMS-Quadern, die den Larvengrößen entsprechen, erhöht die Erfolgsrate bei immobilisierenden Larven. Weitere nützliche Bänder finden Sie in unserem Abschnitt zur Fehlerbehebung.Nachdem Sie einen Aluminiumblock aus einer Maschinenhalle gebaut haben, versiegeln Sie den Boden des Metallrahmens mit einem langen Deckelschlupf mit UV-Kleber. Härten Sie den UV-Hinweis 30 Sekunden lang mit einer Hand-UV-Lampe aus. Befestigen Sie Schichten von Verpackungsband an der Innenfläche einer rechteckigen Petrischale oder runden Zellkulturplatte.Verwenden Sie eine Schicht für zweite In-Stern-Larven, zwei Schichten für frühe dritte In-Stern-Larven oder drei Schichten für spätdritte In-Stern-Larven. Schneiden Sie das Band in Fahrten von spezifischer Breite mit einer Rasierklinge, 1,5 Millimeter für das einlagige Band und zwei Millimeter für das zwei- oder dreilagige Band. Lassen Sie mindestens einen Abstand von fünf Millimetern zwischen den beiden Streifen.Entfernen Sie die Bandschichten, die den Raum abdecken. Entfernen Sie Staub von der Innenfläche der Platte mit Klebeband. Danach ist die Form einsatzbereit.Um die PDMS-Mischung vorzubereiten, mischen Sie sieben Gramm PDMS-Basis in 0,7 Gramm Aushärtungsmittel gründlich in einem kleinen Behälter. Legen Sie den Behälter mindestens 15 Minuten in einen Vakuumaustrocknungsor, um Luft aus dem Gemisch zu entfernen. Gießen Sie langsam etwa 5,5 Gramm PDMS-Mischung auf die Form, um eine Ein- bis Zwei-Millimeter-Dicke zu erreichen.Legen Sie das PDMS-Gemisch für mindestens 15 Minuten wieder in den Vakuumaustrocknungser, um die verbleibenden Luftblasen aus der Mischung zu entfernen. Brechen Sie die letzten Blasen mit einer Pipettenspitze. Das PDMS auf einer ebenen Oberfläche in einem Wärmebrutschrank bei 65 Grad Celsius zwei Stunden lang aushärten.Als nächstes verwenden Sie eine Rasierklinge, um das ausgehärtete PDMS entlang der Kante der Form zu lösen und es von der Form zu lösen. Bewahren Sie das PDMS zwischen zwei Stücken großem Klebeband bei Raumtemperatur auf. Für frühe und späte dritte In-Star-Larven, schneiden Sie das PDMS in acht mal zwei mal einen Millimeter Quader, indem Sie die Nut durch den Bandstreifen in der Mitte der langen Seite des Quaders erstellt.Für die zweite In-Star-Larven den Quader um einen Millimeter auf acht schneiden. Um den oberen Deckelschlupf für die Montage vorzubereiten, wählen Sie sechs PDMS-Quader mit Nuten, die den Größen der Larven entsprechen. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche des PDMS mit Klebeband.Befestigen Sie vier Doppelbandstücke in der Größe 12 mal fünf Millimeter an einem langen Decksbeleg von 22 mal 50 Millimetern, um PDMS-Quader später zu fixieren. Passen Sie die Leerzeichen zwischen den beiden Stücken doppelseitigem Band auf die gleiche Breite wie die Breite der PDMS-Nut an. Tragen Sie einen kleinen Tropfen UV-Kleber in die Nut jedes PDMS-Quaders auf und fügen Sie sechs kleine Tropfen UV-Kleber in den Raum zwischen den doppelseitigen Bändern auf dem Deckelschlupf ein.Um die Larven für die Montage vorzubereiten, mit einem Paar Zange, reinigen Sie die Larven in Wasser, um Nahrung von der Körperoberfläche zu entfernen. Legen Sie die sauberen Larven auf ein kleines Stück befeuchtetes Tissuepapier in eine kleine Petrischale ohne Deckel und legen Sie die kleine Petrischale in eine große Petrischale, die ein Stück trockenes Gewebepapier enthält. Verwenden Sie in einer chemischen Haube eine Kunststoff-Transferpipette, um 160 bis 240 Mikroliter Isofluran auf das Trockenepapier aufzutragen und den Deckel der großen Petrischale zu schließen.Warten Sie zwei bis drei Minuten, während Sie die Larven überwachen. Sobald ihre Mundhaken aufhören sich zu bewegen, nehmen Sie die Larven aus der großen Petrischale heraus. Legen Sie die immobilisierten Larven auf den UV-Kleber zwischen den doppelseitigen Bändern auf den Deckelschlupf mit der dorsalen Nagelhaut, die dem Deckelschlupf zugewandt ist.Bedecken Sie jede Larve mit einem PDMS-Block und passen Sie den Stamm der Larve in die Nut des PDMS. Lassen Sie den Kopf und den Schwanz der Larve außerhalb der PDMS-Nut. Vermeiden Sie es, die Spappel der Larve durch den Kleber zu blockieren.Drücken Sie auf die Enden des PDMS-Blocks auf das doppelseitige Band, ohne Kraft auf die Nut anzuwenden. Ziehen Sie vorsichtig am Schwanz der Larve, um die Nagelhaut unter dem PDMS abzuflachen. Tragen Sie eine Schutzbrille und verwenden Sie eine handgeführte UV-Lampe, um den UV-Kleber vier Minuten lang auf der hohen Einstellung auszuhärten.Drehen Sie den Deckelschlupf auf den Kopf und verwenden Sie die UV-Lampe, um den UV-Kleber für weitere vier Minuten auszuhärten. Legen Sie ein kleines Stück Linsenpapier mit der Größe von 15 mal 30 Millimetern an der Unterseite der Bildkammer. Befeuchten Sie das Papier mit 20 bis 30 Mikroliter Wasser.Legen Sie den Deckelschlupf auf die Kammer, so dass die Larven nach innen in die Kammer blicken. Verwenden Sie den UV-Kleber, um beide Enden der Abdeckung auf die Metalloberfläche zu befestigen. Die Dorsalseite der Larven ist unter einem konfokalen Mikroskop zur Bildgebung bereit.Entfernen Sie nach der Bildgebung das Öl auf der oberen Abdeckung mit Linsenpapier. Lösen Sie den oberen Deckelvom Metallrahmen, indem Sie mit einer Rasierklinge in den Raum zwischen dem Deckelschlupf und dem Metallrahmen schneiden. Die Bildgebungskammer ist wiederverwendreif.Lösen Sie die PDMS-Quader mit Zangen vom oberen Deckelschlupf. Rollen Sie die PDMS-Quader auf Klebeband, um Klebstoffrückstände und Staub zu entfernen. Die PDMS-Quader sind wiederverwendreif.In diesem Protokoll wurden Drosophila-Larven länger als 10 Stunden für die kontinuierliche Bildgebung immobilisiert. Diese Abbildung zeigt sechs späte dritte In-Stern-Larven, die in der Kammer montiert sind. Die Stämme der Larven wurden fixiert, während ihre Köpfe und Schwänze frei waren, sich zu bewegen.Hier zeigen wir die Anwendung von LarvaSPA bei der Untersuchung der neuronalen Dendritendynamik und Dendritendegeneration anhand von DA-Neuronen der Klasse 4 als Modell. Um Larven mit dieser Methode erfolgreich immobilisieren zu können, ist es wichtig, die Larven nicht mehr Isofluran zu bedecken, sobald sich die Mundhaken nicht mehr bewegen und den UV-Kleber aushärten, bevor die Larven vollständig aufwachen. Um die Degeneration und Regeneration von Dendriten zu untersuchen, kann eine Laserverletzung durchgeführt werden, wenn Larven in der Bildkammer immobilisiert werden.LarvaSPA hat uns geholfen zu verstehen, wie dynamisch wachsende Dendriten epidermale Zellen wie in Leberzellproteoglykanen nicht in ninvalieren und wie Phosphatidylserin nach Laserverletzungen degenerierenden Dendriten ausgesetzt ist. Schützen Sie die Augen mit einer Schutzbrille, während Sie die UV-Lampe verwenden. Das Ausstoßen von Larven mit Isofluran sollte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Hier beschreiben wir die Methode, die wir angewendet haben, um hochmotile dendritische Filopodia in einer Live-Vorbereitung des Drosophila-Larvenhirns abzubilden, und das Protokoll, das wir entwickelt haben, um Zeitraffer-3D-Bildgebungsdatensätze für quantitative Bewertungen von Dendriten zu quantifizieren. Dynamik bei der Entwicklung von Neuronen.

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Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

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In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Langzeit-Live-Bildgebung des Drosophila-Beins während des Puppenstadiums vorgestellt, bei dem das Puparium vollständig entfernt wird. Dieses Protokoll kann auch auf andere Gewebe angewendet werden.

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Erfahren Sie die LarvaSPA-Methode zur Langzeit-Zeitraffer-Imaging von Drosophila-Larven für neuronale Entwicklungsstudien. Diese Technik ermöglicht über 10 Stunden kontinuierliche Bildgebung peripherer sensorischer Neuronen und Dendritenwachstum.

LarvaSPA, Eine Methode zur Montage von Drosophila Larva für Langzeit-Zeitraffer-Imaging

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