Stabiler Knockdown von Genen, die extrazelluläre Matrixproteine in der C2C12 Myoblast-Zelllinie mit Small-Hairpin (sh)RNA kodieren

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es uns erlaubt, die Funktion von Proteinen zu untersuchen, wie extrazelluläre Matrixproteine, die in späteren Stadien der Myotube-Bildung oder Reifung hochreguliert werden. Diese Methode kann verwendet werden, um jedes Gen von Interesse in C2C12-Zellen zu fallen, indem spezifische shRNAs und die entsprechenden Analysewerkzeuge für die Phänotypisierung verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass wir C2C12-Zellen erzeugt haben, die unsere Gene kontinuierlich unterdrücken können, selbst in reifen Myoröhren.

Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Aufrechterhaltung von C2C12-Zellen im undifferenzierten Zustand, d. h. bei einer niedrigen Zelldichte während der Routinezellkultur. Am Tag vor der Transfektion samen sie fünfmal 10 bis vier C2C12-Zellen pro Milliliter in zwei Millilitern komplettem DMEM pro Brunnen in einer Sechs-Brunnen-Platte, um eine 40 bis 50%ige Konfluzigkeit nach nächtlicher Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 zu erreichen. Am nächsten Morgen 100 Mikroliter 25-Millimolar-Natriumchlorid in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsrohr pro Kultur gut mit 25,5 MikroliterPEI-Stammlösung einer undifferenzierten C2C12-Zellkultur für eine fünfminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius kombinieren.

Als nächstes kombinieren Sie drei Mikrogramm Plasmid-DNA mit 100 Mikroliter 25-Millimolar-Natriumchlorid pro Kultur gut für eine fünfminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Kombinieren Sie am Ende der Inkubationen das gesamte Volumen jedes verdünnten PEI-Reagenzes mit jeder verdünnten Plasmidlösung mit einer sanften Pipettion für eine 25-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie während der Inkubation die Überdrinzien der C2C12-Zellkulturen durch DMEM ohne Antibiotika oder Serum.

Am Ende der Inkubation fügen Sie jedem Brunnen in Tröpfchen das gesamte Volumen jedes Transfektionsmixes hinzu, während Sie die Zellkulturschale kontinuierlich bewegen. Nach sechs Stunden im Zellkultur-Inkubator das Medium in jedem Brunnen durch komplettes DMEM ersetzen. 24 Stunden nach der Transfektion, ersetzen Sie das komplette DMEM in jedem Brunnen mit Selektionsmedium ergänzt mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Puromycin, und geben Sie die Zellen an den Zellkultur-Inkubator für 10 bis 14 Tage oder bis stabile C2C12-Zellen beobachtet werden.

Dann erweitern Sie die Puromycin-resistenten C2C12-Zellen in Kulturen mit niedriger Zelldichte in Gegenwart von fünf Mikrogramm pro Milliliter Puromycin und kryokonservieren Sie sechs bis zehn Durchstechflaschen von Zellen für die zukünftige Verwendung. Um die C2C12-Zellen für die Differenzierung vorzubereiten, samen Sie 1,5 mal 10 bis zu den fünften stabilen Puromycin-resistenten C2C12-Zellen in einem Milliliter Selektionsmedium pro Brunnen in einer 12-Well-Platte, und bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid brüten, bis die Kulturen zu 95% konfluent sind. Um Differenzierung zu induzieren, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen alle zwei Tage nach der Myotube-Formation auf einem invertierten Hellfeldmikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist, durch serumfreies DMEM.

Zur myosinschweren Kettenimmunfärbung der differenzierten Zellen fünfmal 10 bis zu den vierten Puromycin-resistenten C2C12-Zellen in 500 Mikrolitern komplettem DMEM pro Kammer auf eine Acht-Well-Kammerrutsche und geben die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurück. Wenn die Zellen 95% Konfluenz erreichen, ersetzen Sie das Selektionsmedium in jedem Brunnen durch 500 Mikroliter serumfreies DMEM. Zu den entsprechenden versuchsmäßigen Zeitpunkten spülen Sie die Differenzierungszellen in jedem Brunnen dreimal mit 5 MilliliterPBS pro Waschgang ab, bevor Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd in PBS pro Brunnen fixieren.

Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten dreimal mit frischem PBS pro Waschgang, wie gerade gezeigt, gefolgt von einer Inkubation mit 200 Mikroliter5-Molarenglycin in PBS pro Brunnen für fünf Minuten. Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal waschen, bevor Sie die Zellen 10 Minuten lang mit 200 Mikrolitern 1%nichtionischen Tensids in PBS durchdringen. Als nächstes blockieren Sie die unspezifischen Antikörperbindungsstellen mit 200 Mikrolitern 5%rinderserumalbumin in PBS pro Brunnen für eine Stunde, gefolgt von drei Wärhöfen in PBS.

Nach der letzten Wäsche die Zellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern Myosin-Schwerkettenantikörper beschriften. Nach drei PBS-Waschungen die Zellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden Sekundärantikörper bebrüten, geschützt vor Licht. Nach drei letzten Wähungen, aspirieren Sie die PBS, und montieren Sie die Zellen mit einem Tropfen Montagemedium mit DAPI und einem Coverslip ergänzt.

Beobachten Sie dann jede Kammer auf einem Fluoreszenzmikroskop mit dem entsprechenden Filtersatz. Um die Knockdown-Effizienz in den Zellkulturen durch Western-Blotting zu bewerten, zuerst zuerst 10 bis die fünften Puromycin-resistenten C2C12-Zellen in zwei Millilitern komplettem DMEM pro Brunnen in einer Sechs-Well-Platte auszusäen. Nach 24 Stunden die Kulturen mit PBS abspülen und die Differenzierung der Zellen mit zwei Millilitern serumfreiem DMEM initiieren, wie gezeigt.

Für die Analyse der sezernierten Proteine an den entsprechenden versuchsweisen Zeitpunkten sammeln Sie jeweils einen Milliliter serumfreies konditioniertes Medium in einzelne 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen für die Zentrifugation. Nach der Zentrifugation einen Milliliter der konditionierten mittleren Überstände in neue 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen übertragen und die Proteine mit 391 Mikroliter Trichloressigsäure in nichtionischem Tensid pro Tube ausstoßen. Nach 30 Sekunden Wirbel die Mischungen 10 Minuten auf Eis bebrüten.

Am Ende der Inkubation die ausgefällten Proteine durch Zentrifugation pellet und die Proteinpellets dreimal mit frischem eiskaltem Aceton und einer Zentrifugation pro Waschgang waschen. Nach der letzten Wäsche die Pellets drei bis vier Minuten bei Raumtemperatur lufttrocknen, bevor sie in 50 Mikroliter SDS-PAGE Probenpuffer pro Tube wieder aufgefedert werden. Dann kochen die Proben für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius vor Western Blot Analyse nach Standardprotokollen.

Für die intrazelluläre und membrangebundene Proteinanalyse spülen Sie die Zellschicht in jedem Brunnen mit zwei Milliliterpbs pro Brunnen ab und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig in einem Milliliter-Volumen von PBS zu entfernen. Übertragen Sie die Zellen in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren zur Zentrifugation, gefolgt von drei Wäschen in einem Milliliter PBS pro Röhre pro Waschmittel über Zentrifugation. Nach der letzten Wäsche die Zellpellets in 200 MikroliterLysepuffer, ergänzt mit EDTA-freiem Protease-Inhibitor-Cocktail-Reagenz, für eine 30-minütige Inkubation auf Eis wieder aufsetzen.

Am Ende der Inkubation die Proben 15 Sekunden lang auf Eis mit einer Leistungseinstellung von 10 bei einer Betriebsfrequenz von 23 Kilohertz beschallen und die Zellablagerungen durch Zentrifugation entfernen. Übertragen Sie die Überstande in neue 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen nach Standardprotokollen. Kombinieren Sie 100 Mikrogramm Protein mit 5X SDS-PAGE Probenpuffer in einem Gesamtvolumen von 60 Mikroliterpro-Probe, und kochen Sie die Proben für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius.

Analysieren Sie dann die Proben durch Western-Blotting auf das Vorhandensein des gewünschten Zielproteins. Die Auswahl von puromycinresistenten C2C12-Zellen kann innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach transfektion durch eine effiziente Eliminierung der nicht resistenten Zellen erreicht werden. In der Regel lösen sich während dieses Zeitraums mehr als 80 % der C2C12-Zellen von der Zellkulturschale und werden während der routinemäßigen Zellwartung entfernt.

Puromycin-resistente C2C12-Zellen, die die Kontrolle exzellent, oder die ADAMTSL2 shRNA behalten ihre spindelförmige, längsförmige Zellmorphologie bei geringer Zelldichte bei, sowie ihre Fähigkeit, sich in Myoröhren zu differenzieren. Die C2C12-Differenzierung bei Serumentzug kann durch Hellfeldmikroskopie und Immunfärbung für den Myotube-Marker Myosin-schwere Kette überwacht werden. Myosin schwere kettenpositive Myotuben werden zwischen drei und fünf Tagen nach Derikulierungbeobachtet beobachtet und multinukleiert, wie durch das Vorhandensein von mehr als einem DAPI-positiven Kern innerhalb der Zellgrenzen beobachtet.

Wie die Genexpressionsdaten unter Proliferationsbedingungen zeigen, ist die Knockdown-Effizienz der Transfektion 40 bis 60%Westliche Blot-Analyse kann durchgeführt werden, um den Erfolg des Knockdown sinzellierenden Inzellen zu bestätigen, das beispielsweise von C2C12-Zellen erhalten wurde, die stabil shRNA exemitzenieren, die auf ADAMTSL2 im Vergleich zu Kontroll-shRNA-exeklierenden Zellen abzielt. Achten Sie darauf, die Puromycin-Konzentration während des Selektionsprozesses hoch genug zu halten, um alle nicht transfizierten C2C12-Zellen zu eliminieren, oder die nicht transfizierten Zellen können die transfizierten Zellen auswachsen. Dieser Assay ermöglicht es uns, die Funktion von extrazellulären Matrixproteinen zu bestimmen, die später in der Muskelentwicklung exprimiert werden, auch wenn sie fünf oder 10 Tage nach der C2C12-Differenzierung induziert werden.

Denken Sie daran, dass das RNA-Extraktionsreagenz und Beta-Mercaptoethanol in einer Dunstabzugshaube behandelt werden und die Trichloressigsäure gemäß den entsprechenden Sicherheitsprotokollen behandeln sollten. Vielen Dank für das Zuschauen und viel Glück mit Ihrem Experiment.