Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Analyseprotokolls ist die gleichzeitige Extraktion und Quantifizierung der beiden Krebsmedikamente Doxorubicin und Mitomycin C, die von Polymer-Lipid-Hybrid-Nanopartikeln gemeinsam verabreicht werden, und des Metaboliten des Doxorubicins, Doxorubicinol, in biologischen Matrices unter Verwendung einer einfachen und robusten Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Methode. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Nanomedizin zu beantworten, z. B. wie ein wirksames Nanocarry-System auf der Grundlage der Nanopharmakokinetik von Arzneimittelkombinationen entwickelt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Quantifizierung von drei Wirkstoffen in derselben biologischen Matrix ermöglicht, ohne dass die mobile Phase der HPLC geändert werden muss.

Diese Methode kann also einen Einblick in das biologische Verhalten von Doxorubicin, Mitomycin C und Doxorubicinol bei primären Brusttumoren geben. Es kann auch bei anderen Krebsarten angewendet werden, die mit ähnlichen Medikamenten behandelt werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da effiziente Schritte zur Probenvorbereitung schwer zu erlernen sind.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, sammeln und frieren Sie das Vollblut, die wichtigsten Organe und den Brusttumor ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Wiegen Sie das gefrorene Gewebe schnell und notieren Sie das Gewicht im Labornotizbuch. Füllen Sie sie dann in ein konisches 13-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden um.

Als nächstes fügen Sie zwischen einem und fünf Millilitern eiskalten Cell Lysis Puffer hinzu. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem elektrischen Handhomogenisator mit einer Auf- und Abbewegung auf Eis bei 18.000 U/min. Waschen Sie danach die 10-Millimeter-Sonde des Sägezahngenerators des Homogenisators mit destilliertem deionisiertem Wasser.

Waschen Sie die Sonde mit 70% Ethanol und dann erneut mit destilliertem deionisiertem Wasser. Übertragen Sie 50 Mikroliter Gewebehomogenat oder Vollblut in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Dann mit fünf Mikrolitern eines internen Standard-4-Methylumbelliferons von 2.000 Nanogramm pro Milliliter aufspießen.

Fügen Sie ein eiskaltes Extraktionslösungsmittel hinzu, das 150 Mikroliter Acetonitril und 100 Mikroliter fünf Millimolar Ammoniumacetat enthält. Wirbeln Sie die Mischung zwei Minuten lang kräftig ein. Bei 3.000 g und vier Grad Celsius 10 Minuten zentrifugieren.

Danach werden 200 Mikroliter des Überstands in ein frisches, vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt. Verwenden Sie einen langsamen Strom von Stickstoffgas, um den Überstand bei 60 Grad Celsius unter Schutz vor Licht zu verdampfen. Anschließend rekonstituieren Sie den getrockneten Rückstand mit 100 Mikrolitern eiskaltem Methanol.

30 Sekunden lang kräftig vortexen. Zentrifugieren Sie bei 3.000 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Übertragen Sie dann den Überstand in einen HPLC-Fläschcheneinsatz.

Legen Sie die Probenfläschchen zur Injektion in ein Autosampler-Tablett. Bereiten Sie zunächst die mobile HPLC-Phase vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Anfangsbedingungen für die Zusammensetzung der mobilen Phase sind auf 16,5 % H2O und 83,5 % Acetonitril festgelegt.

Stellen Sie die isokratische Durchflussrate auf 1,0 Milliliter pro Minute ein. Trennen Sie dann die Arzneimittel unter Verwendung der Gradientenbedingung der mobilen Phase, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie als Nächstes den UV-Detektor auf zwei Kanäle ein: einen auf 310 Nanometer für den internen Standard 4-MethylUmbelliferon und den anderen auf 360 Nanometer für Mitomycin C. Stellen Sie danach den ersten Kanal des Fluoreszenzdetektors auf eine Anregungswellenlänge von 365 Nanometern und eine Emissionswellenlänge von 445 Nanometern für 4-Methylumbelliferon ein.

Stellen Sie den zweiten Kanal auf eine Anregungswellenlänge von 480 Nanometern und eine Emissionswellenlänge von 560 Nanometern für Doxorubicin und Doxorubicinol ein. Verwenden Sie zunächst den Autosampler, um 15 Mikroliter der Probe zu injizieren. Die programmierte Zusammensetzung der mobilen Phase des Gradienten ändert sich automatisch, indem die Zusammensetzung des Acetonitrils über Null auf 18 Minuten erhöht wird.

Nach 18 Minuten wird der Zustand der mobilen Phase wieder in den Ausgangszustand versetzt und für die nächste Injektion wieder ausgeglichen. Notieren Sie sich nach jeder Probe die Peaks der Wirkstoffe und ihre Retentionszeiten. Verwenden Sie dann die HPLC-Software, um den Peakbereich unter der Kurve für die Wirkstoffverbindungen zu integrieren.

Berechnen Sie den prozentualen Prozentsatz der Arzneimittelrückgewinnung und die Fläche unter der Kurve zwischen den einzelnen Wirkstoffen und dem internen Standard, wie im Textprotokoll beschrieben. Bei diesem Verfahren werden zwei Krebsmedikamente, Doxorubicin und Mitomycin C, zusammen mit dem Doxorubicin-Metaboliten Doxorubicinol ohne biologische Interferenz nachgewiesen. Die HPLC-Analyse zeigt, dass jedes Medikament gut von den anderen getrennt ist.

Die entwickelte HPLC-Methode weist eine Abweichung von weniger als 15 % in der Präzision und Genauigkeit innerhalb und zwischen den Tagen für jedes der untersuchten Arzneimittel auf, sowohl im Vollblut als auch in verschiedenen biologischen Matrices, was auf eine hervorragende Reproduzierbarkeit hinweist. Anschließend wird die pharmakokinetische und biologische Verteilung von lang zirkulierenden oder pegylierten Nanopartikeln auf Basis von Doxorubicin und Mitomycin C bestimmt. Im Blut sind die Wirkstoffkonzentrationen, die von Polymer-Lipid-Hybrid-Nanopartikeln im Laufe der Zeit abgegeben werden, mindestens sechsmal höher als in den entsprechenden freien Arzneimittellösungen.

In einem orthotopen Brusttumor können Polymer-Lipid-Hybrid-Nanopartikel Doxorubicin und Mitomycin C in ihrem synergistischen Wirkstoffverhältnis gemeinsam abgeben. Im Vergleich zu freier Wirkstofflösung weisen Nanopartikel eine erhöhte Tumorakkumulation auf. Dies ist auf die verlängerte systematische Zirkulation zurückzuführen, die es den Nanopartikeln ermöglicht, die erhöhte Permeabilität und Retentionseffekte des Tumors zu nutzen.

Die weitere quantitativ bestimmte Bildung von Doxorubicinol im Brusttumor über 24 Stunden zusammen mit der verstärkten Tumor-Apoptose deutet darauf hin, dass die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels für die Entwicklung einer wirksamen Nanopartikelformulierung entscheidend ist. Mit dieser HPLC-Methode konnte erfolgreich gezeigt werden, dass Polymer-Lipid-Hybrid-Nanopartikel in vivo präzise synergistische Wirkstoffkombinationen in Krebszellen abgeben können, was zu einer verbesserten Chemotherapie führt. Diese Technik kann in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Um eine mögliche Vernichtung von Medikamenten zu minimieren, ist es wichtig, direkte Sonneneinstrahlung zu vermeiden und die Probe auf Eis zu halten, während Sie dieses Verfahren versuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik dem Forscher auf dem Gebiet der Nanomedizin den Weg, die Nanopharmakokinetik der Wirkstoffkombination zu erforschen und die wirksame Nanopartikelformulierung für die Krebstherapie besser zu gestalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie Doxorubicin, Mitomycin C und den Metaboliten von Doxorubicin, Doxorubicinol, über einen weiten Bereich der biologischen Proben, die Nanopartikel enthalten, die Wirkstoffkombination enthalten, gleichzeitig extrahieren und nachweisen können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krebsmedikamenten und Säure extrem gefährlich sein kann, und Sicherheitsvorkehrungen wie das Tragen von Handschuhen, Schutzbrillen und Laborkitteln sollten bei der Durchführung dieses Protokolls immer getroffen werden.