Name: Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie die simultane Extraktion und Quantifizierung von Doxorubicin, Mitomycin C und Doxorubicinol aus biologischen Matrizes mittels HPLC. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen für die Nanomedizin und Krebstherapieforschung.

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Die Autoren erkennen dankbar der Anlagen Zuschuss von naturwissenschaftlichen und technischen Forschung (NSERC) Council of Canada für HPLC, Betriebskostenzuschuss seitens des Canadian Institute of Health Research (CIHR) und Canadian Breast Cancer Research (CBCR) Allianz X.Y. Wu und der University of Toronto-Stipendium für R.X. Zhang und T. Zhang.

alle Tierversuche wurden genehmigt durch die Animal Care Ausschuss des University Health Network am Ontario Cancer Institute und im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien.
 1. biologische Probenvorbereitung <ol><li>sammeln die Vollblut, wichtige Organe und Brust-Tumor zu vorgegebenen Zeitpunkten nach der intravenösen (i.v.) Verabreichung von wirkstoffhaltigen Formulierungen (z.B. DMPLN, liposomale DOX) <ol><li>injizieren ein Brust-Tumor-tragenden Maus i.v. mit einer vorbereiteten wirkstoffhaltigen Formulierung.</li>
		<li>Die Maus zu festgelegten Zeitpunkten (z.B., 15 min) zu betäuben, indem man inhalierbare 2 % Isofluran in einer verschlossenen Kammer.</li>
		<li>Legen die narkotisierten Maus auf den Rücken und legte seine Nase durch einen Nasensteg, der ständig 2 % Isofluran versorgt. 
		Hinweis: Zur Gewährleistung die Maus erfährt Tiefe Narkose sanft kneifen vorderen Gliedmaßen der Maus und suchen Sie nach einer zuckenden Bewegung.</li>
		<li>Gründlich reinigen, die Brust und Bauch Regionen mit 70 % Ethanol und führen Sie dann ein terminal Verfahren der Herzpunktion auf die tiefen narkotisierten Mäuse mit einer heparinisierten 1 mL Spritze und Nadel 23 G.</li>
		<li>Sammeln die Vollblut in einer beschrifteten Natrium Heparin gespritzt Kunststoffrohr und sanft schwenken Sie das Rohr um gesammelten Vollblut kommt in Kontakt mit dem beschichteten Heparin der Rohrwand zu gewährleisten. Sammeln Sie ein Minimum von 50 µL Vollblut. Immer die Proben auf Eis</li>
		<li>Band alle vier Gliedmaßen der Maus, um es zu sichern und öffnen Sie den Bauchraum und Brustkorb der Maus mit einem paar der Schere und Zange. Verschieben Sie den Darm zur Seite und drücken der Leber nach oben in die Pfortader ausreichend verfügbar zu machen. Schneiden Sie die Pfortader zur Entwässerung Blut.</li>
		<li>Durchspülen die ganze Maus Körper mit 50 mL eiskaltes 0,9 % Kochsalzlösung durch das Herz mit einer 10 mL Spritze mit einer Nadel 25 G. 
		Hinweis: Biegen Sie die Nadel im 90 °-Winkel zur Führung der Spritze in die Pfortader.</li>
		<li>Verbrauchsteuern Organe in folgender Reihenfolge: Herz, Lunge, Leber, Milz, Nieren. Trennen Sie der Brusttumor dann, das umgebende Bindegewebe mit einem Einschnitt Schere an der rechten Mamma Fettlappen der Maus. Sammeln Sie alle Organe einzeln in 1,5 mL Polypropylenröhrchen und schnell einfrieren in flüssigem Stickstoff. 
		&#8203; Hinweis: die Gallenblase von der Leber trennen.</li>
		<li>Der Vollblut bei 4 ° C und ausgeschnittenen Gewebe im-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren, bis zur späteren HPLC Analyse.</li>
	</ol></li> <li>Extrahieren DOX, MMC und DOXol aus biologischen Matrizen.
	<ol><li>Wiegen alle gefrorenen seziert Gewebe schnell und in einem 13 mL gerundet unten konische Rohr übertragen. Um mögliche Arzneimittelstoffwechsel oder Verschlechterung zu vermeiden, halten Sie die Proben auf Ice</li>
		<li>Hinzufügen 1-5 mL eiskaltes Zelle Lysis Puffer in die Röhre. 
		Hinweis: Die Lautstärke des Puffers zu verwenden, hängt das Gewebe Gewicht bezogen auf das Gewebe-Puffer-Verhältnis von 1 g: 5 mL (w/V); für die kleinen Organe, wie Herz und Milz, das Verhältnis ist 1 g: 2 mL.</li>
		<li>Verwenden eine Hubbewegung von oben-unten, um die Gewebeproben auf Eis mit einer Geschwindigkeit von 18.000 u/min mit einem elektrischen Hand-Homogenisator homogenisieren. 
		Hinweis: Vollständige Homogenisierung erfordert ca. 3 bis 5 Wiederholungen eines kurzen Homogenisierung Prozesses von weniger als 15 s, gefolgt von Gewebe Kühlung über Eis zwischen einzelnen kurzen Homogenisierung.</li>
		<li>Waschen die 10 mm Sägezahn Generatorsonde des Homogenisators mit destilliertem deionisiertes (DDI) H 2 O, 70 % Ethanol und dann DDI H 2 O zwischen jede Gewebeprobe um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</li>
		<li>Transfer 50 µL Gewebe Homogenat oder Vollblut in einem 1,5 mL Polypropylen Mikro-Zentrifugenröhrchen und Spike mit 5 µL einer internen standard (I.S.) 4-Methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) in das Rohr. 
		Hinweis: 4-MU-Lösung bereit war, in Methanol hier.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL eines Lösungsmittels eiskalte Extraktion in das Röhrchen mit Blut oder Gewebe Homogenat. 
		Hinweis: Das Lösungsmittel Extraktion besteht aus 60 % Acetonitril (ACN) und 40 % Ammoniumacetat (5 mM) mit pH-Wert eingestellt auf pH = 3,5 mit 0,05 % Ameisensäure. Verwenden Sie eine 1:5 (V/V) Beispiel: Extraktion Lösungsmittel zum Volumenverhältnis.</li>
		<li>Kräftig Wirbel die Mischung für 2 min, Zentrifuge bei 3.000 x g-Kraft bei 4 o C für 10 min und Pipettieren 200 µL Überstand in ein anderes vorgekühlt frische Mikro-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Verflüchtigen Überstand bei 60 ° C unter einer langsamen Strom von Stickstoffgas mit Lichtschutz.</li>
		<li>Rekonstruieren Sie die getrockneten Reste mit 100 µL eiskalte Methanol, kräftig vortexen 30 s und Zentrifuge bei 3000 X g bei 4 ° C für eine weitere 5 min.</li>
		<li>Den Überstand in einer HPLC Vials einfügen und Probengefäße in einem Autosampler Tray Injektionslösung.</li>
	</ol></li></ol> 2. HPLC-Instrumentierung und Betriebsparameter <ol><li>bereiten HPLC Mobile-Phase mit konsistenten Reproduzierbarkeit <ol><li>500 mL HPLC-Klasse H 2 O mit einem Messzylinder messen.</li>
		<li>500 mL HPLC-Grade Acetonitril (ACN) mit einem separaten Messzylinder messen.</li>
		<li>Vorsichtig hinzugeben 0,5 mL Trifluoroacetic Säure (TFA) (Vorsicht) in jeweils 500 mL H 2 O und ACN zu der mobilen Phase von H 2 O und ACN mit 0,1 % TFA, bzw.. 
		Hinweis: TFA ist ätzend und giftig und sollte unter einem Labor Abzug gehandhabt werden. Alle Lösemittelgemische sind bei Raumtemperatur vorbereitet.</li>
		<li>Filter mobile Phasen durch ein Nylon-Membranfilter mit 0,45 µm Porengröße und in saubere Flaschen der HPLC-Reservoir übertragen.</li>
	</ol></li> <li>Set-up HPLC Instrumentierung für die simultane Detektion von DOX, MMC, und DOXol und I.S. 4-MU.
	<ol><li>Schalten Sie den Gradienten Pumpe de-Gasser, Auto-Sampler, Photodiode Array Detektor und Multi λ Fluoreszenz Detektor.</li>
		<li>Geben die Anfangsbedingungen des Mobile-Phasenzusammensetzung auf 16,5 % H 2 O (0,1 % TFA) und 83,5 % ACN (0,1 % TFA) (V/V).</li>
		<li>Set UV-Detektor auf zwei Kanälen, jeweils 310 nm für 4-MU (I.S.) und andererseits bei 360 nm für MMC.</li>
		<li>Einstellen den Fluoreszenz-Detektor auf zwei Kanälen, bei λ ex / λ Em = 365/445 nm für 4-MU und die andere am λ ex / λ Em = 480 nm/560 nm für DOX und DOXol, bzw..</li>
		<li>Legen Sie eine isokratische Durchfluss von 1,0 mL/min</li>
		<li>Eine vorinstallierte umgekehrter Phase C 18 Säule (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) bei Raumtemperatur für 10 min für Grundlinie Einrichtung equilibrate.</li>
	</ol></li> <li>Trennen Drogen (DOX, MMC, DOXol und 4-MU) mit Farbverlauf Mobile-Phasenlage.
	<ol><li>Injizieren 15 µL extrahiert und neu konzentrierte Proben mit der Auto-Sampler.</li>
		<li>Nach und nach ändern der Anfangsbedingung Mobile-Phase (siehe Protokoll Schritt 2.2.2) zu 100 % ACN (0,1 % TFA) über 18 min mit Farbverlauf Automatikpumpe. 
		Hinweis: Bei der Trennung, vier Kanäle (zwei UV-absorbierenden und zwei Leuchtstoffröhren) erscheinen gleichzeitig mit jedem Kanal ein Medikament zusammengesetzten anzeigen (siehe Protokoll Schritt 2.2.3 und 2.2.4).</li>
		<li>100 % von ACN halten (0,1 % TFA) für 1 min und dann zurück auf den ersten mobilen Phase Zustand innerhalb von 1 min.</li>
		<li>Neu Zustand die Spalte mit der mobilen Anfangsphase bei Durchfluss von 1,5 mL/min für 4 min für die nächste Probeninjektion.</li>
	</ol></li></ol> 3. HPLC-Validierung <ol><li>bereiten Arbeitsstandards DOX, MMC und DOXol und 4-MU (I.S.).
	<ol><li>Wiegen separat 1 mg DOX und MMC Medikament Pulver (Vorsicht) und 4-MU auf ein frisches, klein mit einem Gewicht von Papier (3 x 3 Zoll 2). 
		Beachten Sie, dass alle Krebsmedikamente gesundheitsschädlich gelten, die akute Toxizität und Keimzelle Mutagenität auf Einatmen oder Verschlucken verursachen können. Sie sollten vorsichtig mit Handschuhen und Masken behandelt werden.</li>
		<li>Übertragen die gewogenen DOX, MMC und 4-MU in eine neue individuelle 1,5 mL Polypropylen Mikro-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL methAnol und Vortex kurz zu 1 mg/mL Konzentration von DOX und MMC.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL Methanol in ein Fläschchen mit vorgewogene 1 mg DOXol (Vorsicht) und Vortex kurz zu 1 mg/mL Konzentration von DOXol. 
		Hinweis: DOXol ist ein Cardio-toxische Metaboliten und sollte vorsichtig behandelt werden.</li>
		<li>Pipette 20 µL bereit Stammlösungen DOX, MMC, DOXol und 4-MU in ein neues 1,5 mL Polypropylen Mikro-Zentrifugenröhrchen trennen und fügen 980 µL von Methanol, einen funktionierende Standard von 20 µg/mL jedes Medikament zu erhalten.</li>
		<li>Verdünnen 20 µg/mL DOX, MMC und DOXol unter Verwendung von Methanol zu Arbeitsstandards 50 ng - 20 µg /mL DOX, MMC und DOXol und 2000 ng/mL für I.S. 4-MU.</li>
		<li>Dichtung die Kappe des Rohres der Gebrauchslösungen mit einem schmalen Stück Paraffin Film Abdeckung an Methanol Verdunstung zu verhindern, wickeln das gesamte Rohr mit Alufolie zu meiden, direktes Licht und bei-20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Bestimmen die Linearität, Präzision und Genauigkeit der DOX, MMC und DOXol in biologischen Matrizen (d.h., Vollblut und Tumor-Homogenat).
	<ol><li>Gleichzeitig Spike 5 µL Arbeitsstandards DOX und DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1.000 ng/mL - 16 µg/mL), und 4-MU (2 µg/mL) in 50 µL leer Vollblut oder Gewebe Homogenat in Mikro-Zentrifuge Polypropylenröhrchen zu die standard Konzentrationskurve von 5-2000 ng/mL für Wirkstoffe und 200 ng/mL für 4-MU (I.S.) bis hin zu erhalten.</li>
		<li>Führen Sie die Droge Extraktion Assay im Protokoll 1.2 beschrieben.</li>
		<li>Verwenden Sie niedrige, mittlere und hohe Konzentrationen von DOX und DOXol (50, 500 und 2.000 ng/mL) und MMC (100, 1000, 2.000 ng/mL) für Intra - und inter - Tag Präzision und Genauigkeit. 
		Hinweis: Bereiten Sie frische standard Konzentrationen am Tag der Analyse.</li>
	</ol></li> <li>Analyse von Proben <ol><li>injizieren 15 µL der Probe mit der Auto-Sampler.</li>
		<li>Nach und nach ändern die mobile Phase über 0 bis 18 min, die Zusammensetzung von ACN über das Intervall zu erhöhen.</li>
		<li>Nach 18 min, halten Sie die mobile Phase Voraussetzung für 1 min.</li>
		<li>Wieder in den Ursprungszustand über die nächsten 2 min, dann wieder für 4 min vor der nächsten Injektion equilibrate.</li>
		<li>Nach jeder Probe laufen, beachten Sie, dass die Gipfel der Wirkstoffe mit ihren Retentionszeit wie folgt angezeigt werden: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) und DOX.</li>
		<li>Die Peakfläche unter der Kurve (AUC) Wirkstoffe mittels HPLC-Software zu integrieren.</li>
		<li>Das AUC Verhältnis zwischen einzelnen Droge zusammengesetzte und I.S. (Gleichung 1) zu berechnen und verwenden die Standardkurven unter der gleichen Extraktionsverfahren vorbereitet, die Droge-Konzentrationen von DOX, MMC und DOXol in DMPLN Formulierung bestimmen. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg" /></li> <li>berechnen die Droge Erholung Prozentsatz (Gleichung 2) durch den Vergleich der Droge Konzentrationen wieder hergestellt unter Verwendung von Methanol aus den Extrakten von Spike biologischen Proben, der Norm (&#34; ordentlich &#34;) medikamentöse Lösung in Methanol. 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg" /></li></ol></li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen und Interessenkonflikte.

Im Vergleich zu anderen chromatographischen Methoden, die den Nachweis einer einzigen Wirkstoff-Spezies zu einem Zeitpunkt zu ermöglichen, ist dieses HPLC-Protokolls in der Lage, gleichzeitig drei Wirkstoffe (DOX, MMC und DOXol) in der gleichen biologischen Matrix ohne die Notwendigkeit zu ändern quantitate die mobile Phase. Diese Vorbereitung und Analyse-Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von zwei Nanopartikel-based Drug Delivery Systeme bestimmen (z. B. liposomalen DO...

Chemotherapie ist eine primäre Behandlungsmethode für viele Krebsarten, dennoch es oft mit schweren Nebenwirkungen und begrenzte Wirksamkeit aufgrund von Resistenzen und anderen Faktoren1,2,3 ist. Um das Ergebnis der Chemotherapie zu verbessern, wurden Drogen Kombination Therapien angewendet in der Klinik basierend auf Kriterien wie nicht-überlappende Toxizitäten, verschiedene Mechanismen der Wirkdauer und nicht Kreuz Medikament Widerstand4,5 , 6. in klinischen Studien eine bessere Tumor-Response-Rate wurde oft beobachtet, gleichzeitig mit Medikamenten-Kombinationen im Vergleich zu einer Therapie von sequentiellen Medikament Lieferung7,8verabreicht. Gleichzeitige Injektion von mehreren Medikamenten kann jedoch durch suboptimale Bio-Verteilung des freien Arzneiformen, prominente Normalgewebe Toxizität verursachen, die die therapeutische Wirkung9,10,11überwiegt. Nanocarrier-based Drug-Delivery hat sich gezeigt, die Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von gekapselten Medikamenten, Verbesserung der Tumor gezielt Ansammlung12,13,14ändern. Wie in unserem letzten Artikel überprüft, haben Nanopartikel Co geladen mit synergistischen Wirkstoffkombinationen die Fähigkeit, die Probleme der freien Medikamenten-Kombinationen aufgrund ihrer kontrollierten zeitlichen und räumlichen Co Lieferung von mildern gezeigt. mehrere Medikamente zur Tumor-Gewebe, so dass synergistische Drogenwirkungen gegen Krebs Zellen4,15,16. Infolgedessen wurden in beiden präklinischen und klinischen Studien4,17,18überlegenen therapeutischen Wirksamkeit und geringe Toxizität nachgewiesen.
Unsere bisherigen in-vitro- Studien festgestellt, dass die Kombination von zwei Krebsmedikamente, Doxorubicin (DOX) und Mitomycin C (MMC), eine synergistische Wirkung gegen mehrere Brust-Krebs-Zelllinien hergestellt und darüber hinaus Co laden DOX und MMC innerhalb Polymer-Lipid-Hybrid-Nanopartikel (DMPLN) überwand verschiedenen multiresistenten verbunden Efflux Pumpen (z. B. P-Glykoprotein und Brust Krebs beständig Protein)19,20,21. In Vivo, konnten DMPLN räumlich-zeitliche Co Lieferung von DOX und MMC zu Tumor Websites und erhöhte Bioverfügbarkeit von Medikamenten innerhalb von Krebszellen, wie durch Moderation der Bildung von DOX Metaboliten Doxorubicinol (DOXol)22angegeben. Infolgedessen verbessert die DMPLN Tumor Zelle Apoptosis, Tumor Wachstumshemmung und längeren Host überleben im Vergleich um zu kostenlosen DOX und MMC-Kombination oder eine liposomale DOX Formulierung22,23,24, 25.
Die tatsächliche Menge an Drogen Co geliefert durch eine Nanocarrier Analyse ist von entscheidender Bedeutung für die Gestaltung effektiver Nanopartikel Formulierungen. Viele Methoden wurden entwickelt, um die Plasmaspiegel von DOX oder MMC Einzeldosen mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) allein oder in Kombination mit Massenspektrometrie (MS)26,27,28 analysieren , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. diese Methoden sind jedoch oft zeitaufwändig und unpraktisch für Kombinationstherapie wie eine große Anzahl von biologischen Proben muss separat für die Analyse von mehreren Medikamenten (manchmal einschließlich Droge Metaboliten) vorbereitet werden. Neben der starken Plasmaproteinbindung von DOX und MMC haben roten Blutkörperchen auch eine große Fähigkeit zu binden und konzentrieren sich viele Krebsmedikamente35,36. So kann Plasmaanalyse DOX oder MMC tatsächliche Droge Blutkonzentrationen verschleiern. Die vorliegende Arbeit (Abbildung 1) beschreibt eine einfache und robuste mehrere Drogen Analysemethode mit umgekehrter Phase HPLC gleichzeitig extrahieren und quantitate DOX, MMC und DOX Metaboliten Doxorubicinol (DOXol) aus Vollblut und verschiedenen Geweben ( z. B. Tumoren). Sie ist erfolgreich angewendet worden, um die Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von DOX und MMC sowie die Bildung von DOXol nach Drug-Delivery über kostenlose Lösungen oder Nanopartikel Formulare (d.h., DMPLN und liposomalen DOX) in einer Orthotopically zu bestimmen implantiert murinen Brusttumor Mausmodell nach intravenösen (i.v.) Injektion22.

<table><tbody><tr><td>Doxorubicin&nbsp;</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>111023</td><td>Krebsmedikament</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>060814</td><td>Krebsmedikament</td></tr><tr><td>Doxorubicinol (DOXol)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>D558020</td><td>Metabolit von DOX</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferon-Natriumsalz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1508</td><td>Interner Standard</td></tr><tr><td>Myristinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td>Materialien für Polylipid-Hybrid-Nanopartikel</td></tr><tr><td>Polyoxyethylen (100) Stearate</td><td>Spectrum</td><td>M1402</td><td>Materialien für Polylipid-Hybrid-Nanopartikel</td></tr><tr><td>Polyoxyethylen (40) Stearat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3440</td><td>Materialien für Polylipid-Hybrid-Nanopartikel</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (PF68)</td><td>BASF Corp.</td><td>9003-11-6</td><td>Materialien für Polylipid-Hybrid-Nanopartikel</td></tr><tr><td>Ultraschall (UP100H)</td><td>Hielscher, Ultraschalltechnologie</td><td>NA</td><td>Nanopartikelvorbereitung</td></tr><tr><td>Wasserbad (ISOTEMP 3016HS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NA</td><td>Nanopartikelzubereitung</td></tr><tr><td>Liposomales Doxorubicin&nbsp; (Caelyx)</td><td>Janssen</td><td>Gekauft in der Apotheke Princess Margaret Hospital</td><td>Klinisch zugelassene Nanopartikelformulierung&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC-zertifiziertes Methanol</td><td>Caledon Chemicals</td><td>6701-7-40</td><td>HPLC-Zusammensetzung für mobile Phasen</td></tr><tr><td>HPLC-graded H2O</td><td>Caledon Chemicals</td><td>8801-7-40</td><td>HPLC-Zusammensetzung für mobile Phasen</td></tr><tr><td>HPLC-zertifiziertes Acetonitril&nbsp;</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1401-7-40</td><td>HPLC Zusammensetzung der mobilen Phase</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td>HPLC Zusammensetzung der mobilen Phase</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Nylonmembran-Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>WHA7404004</td><td>HPLC-Vorbereitung der mobilen Phase</td></tr><tr><td>1cc Kunststoffspritzen</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2606-309659</td><td>Behandlungsinjektion</td></tr><tr><td>5cc Kunststoffspritzen</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2608-309646</td><td>Gewebeentnahmen</td></tr><tr><td>30G 1/2 Nadeln</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>Behandlung Injektion</td></tr><tr><td>25G 5/8 Nadeln</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>Gewebeentnahmen</td></tr><tr><td>Steril 0,9% Kochsalzlösung</td><td>Universität Toronto Hausmarke</td><td>1011</td><td>Gewebeperfusion</td></tr><tr><td>13 ml Konisches Röhrchen mit abgerundetem Boden&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>62.515.006</td><td>Prolyprolen, Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Zellmedium</td></tr><tr><td>1 x Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100 ML</td><td>Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1/5/3840</td><td>pH-Wert für Extraktionslösungsmittel einstellen</td></tr><tr><td>Natriumheparin besprühte Kunststoffröhrchen</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>367878</td> Analytische Waage für <td>Blutentnahme</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>NA pH-Messgeräte&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-637-671</td><td>accumet BASIC</td></tr><tr><td>Vortex Mixter</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td>Vortexen von Proben mit der gewünschten Geschwindigkeit</td></tr><tr><td>von 1,5 ml&nbsp; Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisherbrand</td><td>2043-05408129</td><td>Prolyprolen</td></tr><tr><td>Modell 1000 Homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-672</td> Zentrifuge für <td>Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>5702R</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td>Extraktionsvorbereitung</td></tr><tr><td>Beheiztes Verdampfersystem</td><td>Glas-Col</td><td>NA</td><td>Probenrekonstitution</td></tr><tr><td>HPLC Fläschchen mit Schraubgewinde</td><td>DIKMA</td><td>5320</td><td>HPLC-Probeninjektion</td></tr><tr><td>HPLC-Schraubverschlüsse mit PTFE-Septen aus weißem Silikon</td><td>DIKMA</td><td>5325</td><td>HPLC-Probeninjektion</td></tr><tr><td>HPLC-Polypropylen-Einsatz&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0549</td><td>Maximales Volumen 250 &mu; l, HPLC-Probeninjektion</td></tr><tr><td>Xbridge C18 Column</td><td>Waters Corporation</td><td>186003117</td><td>Arzneimittelanalytik</td></tr><tr><td>Gradientenpumpe&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W600</td> Autosampler <td>für die Arzneimittelanalytik</td></tr><tr><td></td><td>Waters Corporation</td><td>W2707</td><td></td></tr><tr><td>Photodioden-Array-Detektor</td> für die Arzneimittelanalyse<td>Waters Corporation</td><td>W2998</td><td>Wirkstoffanalyse</td></tr><tr><td>Multi- & Lambda-Fluoreszenzdetektor&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2475</td><td>Arzneimittelanalytik</td></tr><tr><td>EMPOWER 2</td><td>Waters Corporation</td><td>NA</td><td>Datenanalysesoftware</td></tr><tr><td>Wissenschaftler</td><td>Micromath</td><td>NA</td><td>Pharmakokinetische Analyse</td></tr><tr><td>Weibliche Balb/c-Mäuse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001026</td><td>In vivo</td></tr><tr><td>EMT6/WT Brustkrebszellen</td><td>zur Verfügung gestellt von Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute</td><td>NA</td><td>In vivo</td></tr></tbody></table>

probengewinnung und gleichzeitige chromatographische quantifizierung von doxorubicin und mitomycin c nach kombination medikamentenabgabe in nanopartikel zur tumor-tragenden mäusen

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Kombinations-Chemotherapie wird häufig in der Klinik zur Behandlung von Krebs verwendet; damit verbundenen negative Auswirkungen auf Normalgewebe schränken jedoch seine therapeutischen Nutzen. Nanopartikel-basierte Arzneimittelkombination hat sich gezeigt, um die Probleme der freien Kombination der Arzneimitteltherapie zu mildern. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die Kombination von zwei Krebsmedikamente, Doxorubicin (DOX) und Mitomycin C (MMC), produziert einen synergistischen Effekt gegen beide Murine und menschlichen Brustkrebs Zellen in Vitro. DOX und MMC Co geladenen Polymer-Lipid Hybrid Nanopartikel (DMPLN) umgangen verschiedenen Efflux-Transporter-Pumpen, die multidrug-Resistenz und nachgewiesene verbesserte Wirksamkeit bei Brustkrebs Tumormodellen übertragen. Im Vergleich zu konventionellen Lösung Formen, wurde diese überlegene Wirksamkeit von DMPLN die synchronisierten Pharmakokinetik von DOX und MMC und erhöhte intrazelluläre Medikament Bioverfügbarkeit innerhalb von Tumorzellen aktiviert, indem die Nanocarrier PLN. zugeschrieben
Zur Bewertung der Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von verwaltet Co DOX und MMC in kostenlose Lösung und Nanopartikel Formen, eine einfache und effiziente Multi-Drug-Analysemethode mit Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde entwickelt. Im Gegensatz zu den bisher gemeldeten Methoden, die DOX oder MMC einzeln im Plasma analysiert, ist diese neue HPLC-Methode in der Lage, gleichzeitig DOX, MMC und ein großer Cardio-toxische DOX Metabolit, Doxorubicinol (DOXol), in verschiedenen biologischen Matrizen ( quantitate z. B. Vollblut, Brusttumor und Herz). Ein dual fluoreszierende und UV absorbierende Sonde 4-Methylumbelliferone (4-MU) diente als interner Standard (I.S.) für einstufige Erkennung von mehreren Drogen-Analyse mit verschiedenen Wellenlängen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Konzentrationen von DOX und MMC geliefert durch Nanopartikel und Lösung Ansätze im Vollblut und verschiedenen Geweben in einer orthotopen Brust Tumor Mausmodell zu bestimmen. Die analytische Methode vorgestellt ist ein nützliches Werkzeug für die prä-klinischen Analyse von Nanopartikel-basierte Lieferung von Medikamenten-Kombinationen.

Zwei Krebsmedikamente, DOX und MMC sowie der DOX Metabolit, DOXol, wurden gleichzeitig ohne biologische Störungen unter der gleichen angewandte Gradienten HPLC Zustand mit 4-MU als die I.S. für die Fluoreszenz und die UV-Detektoren nachgewiesen. DOX, MMC, DOXol und 4-MU waren gut getrennt voneinander mit Retentionszeiten von 5,7 min für MMC, 10,4 min für DOXol, 10,9 min für 4-MU und 11,1 min für DOX (Abbildung 2). Jedes Medikament im Vollblut und verschiedene...

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und komfortable analytischen Prozess der Probengewinnung und gleichzeitige Bestimmung von mehreren Medikamenten, Doxorubicin (DOX), Mitomycin C (MMC) und ein Cardio-toxische DOX Metabolit, Doxorubicinol (DOXol), in der biologischen Proben aus einem präklinischen Brust-Tumor-Modell mit Nanopartikel Formulierungen von synergistischen Arzneimittelkombination behandelt.

Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Das übergeordnete Ziel dieses Analyseprotokolls ist die gleichzeitige Extraktion und Quantifizierung der beiden Krebsmedikamente Doxorubicin und Mitomycin C, die von Polymer-Lipid-Hybrid-Nanopartikeln gemeinsam verabreicht werden, und des Metaboliten des Doxorubicins, Doxorubicinol, in biologischen Matrices unter Verwendung einer einfachen und robusten Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Methode. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Nanomedizin zu beantworten, z. B. wie ein wirksames Nanocarry-System auf der Grundlage der Nanopharmakokinetik von Arzneimittelkombinationen entwickelt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Quantifizierung von drei Wirkstoffen in derselben biologischen Matrix ermöglicht, ohne dass die mobile Phase der HPLC geändert werden muss.Diese Methode kann also einen Einblick in das biologische Verhalten von Doxorubicin, Mitomycin C und Doxorubicinol bei primären Brusttumoren geben. Es kann auch bei anderen Krebsarten angewendet werden, die mit ähnlichen Medikamenten behandelt werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eff

sample-extraction-simultaneous-chromatographic-quantitation

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

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Ein Beispiel für ein Medikament, das auf Nano Polymaleinsäure ist auf das rationale Design personalisierte Medizin, die für Krebs ist dargestellt. Es beschreibt die Synthese von Nano Medikament Her2-positiven menschlichen Brustkrebs in einer Nacktmaus zu behandeln.

Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

Wir beschreiben hier die Methode der faserbasierten konfokalen Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) Bildgebung, die einen innovativen Modus zum Verständnis physiologischer Phänomene auf zellulärer und subzellulärer Ebene bei tierischen Probanden bietet.

Chemotherapie-induzierte vaskuläre Toxizität - Echtzeit-<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von Vessel Impairment

Die heterogene intratumorale Akkumulation von Liposomen wurde mit einer abnormalen Tumormikroumgebung in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit werden Methoden zur Messung der Tumormikrozirkulation mittels Perfusionsbildgebung und erhöhtem interstitiellen Flüssigkeitsdruck (IFP) unter Verwendung eines bildgesteuerten Robotersystems vorgestellt. Die Messungen werden mit der intratumoralen Akkumulation von Liposomen verglichen, die mittels volumetrischer Mikro-CT-Bildgebung bestimmt wurde.

Räumliche Messungen der Perfusion, interstitielle Fluiddruck und Liposome Anreicherung in soliden Tumoren

Ein Protokoll für die Herstellung und Charakterisierung von lipophilen Doxorubicin Prodrug geladen 1,2-Distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [Amino (Polyethylenglykol) -2000] (DSPE-PEG) Micellen beschrieben.

Herstellung und Charakterisierung von Lipophile Doxorubicin Pro-drug Mizellen

Nanopartikel sind, sich als viel versprechende Wirkstoffabgabesysteme für ein breites Spektrum von Indikationen. Hier beschreiben wir eine einfache , aber leistungsfähige Methode Seide Nanopartikel mit Reverse Engineering Bombyx mori Seide herzustellen. Diese Seide Nanopartikel können leicht mit einem therapeutischen Nutzlast beladen werden und anschließend für Drug-Delivery-Anwendungen untersucht.

Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Das schlechte Verständnis der In-vivo-Leistung von Nanomedikamenten behindert ihre klinische Umsetzung. Verfahren zur Bewertung des in vivo-Verhaltens von Krebs-Nanoarzneimitteln auf systemischer, Gewebe-, Einzelzell- und subzellulärer Ebene bei tumortragenden immunkompetenten Mäusen werden hier beschrieben. Dieser Ansatz kann Forschern helfen, vielversprechende Krebs-Nanomedikamente für die klinische Umsetzung zu identifizieren.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance von Krebs Nanomedizin

In diesem Protokoll werden doxorubicin-geladene AS1411-g-PEI-g-PEG modifizierte Gold-Nanopartikel über dreistufige Amidreaktionen synthetisiert. Dann wird Doxorubicin geladen und an Zielkrebszellen für die Krebstherapie geliefert.

Synthese von Aptamer-PEI-g-PEG Modifizierte Gold-Nanopartikel, die mit Doxorubicin für die gezielte Arzneimittelabgabe geladen werden

Hier beschreiben wir das Protokoll für die in vivo Verabreichung von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln, die RNA-Oligomere tragen, an metastasierenden Brustkrebs in Tiermodellen und bieten damit einen klinisch praktikablen Ansatz für das therapeutische Silencing von onkogenen Nukleinsäuren.

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Erfahren Sie die simultane Extraktion und Quantifizierung von Doxorubicin, Mitomycin C und Doxorubicinol aus biologischen Matrizes mittels HPLC. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen für die Nanomedizin und Krebstherapieforschung.

Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen (Video) | JoVE Journal

Probengewinnung und gleichzeitige chromatographische Quantifizierung von Doxorubicin und Mitomycin C nach Kombination Medikamentenabgabe in Nanopartikel zur Tumor-tragenden Mäusen

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