Hochdurchsatzmethode zur Messung der Alkoholsedationszeit einzelner Drosophila melanogaster

Drosophila bietet ein ausgezeichnetes Modell, um die genetischen Grundlagen der Alkoholempfindlichkeit zu untersuchen, da man die Alkoholempfindlichkeit genau unter kontrollierten genetischen Hintergründen und Umweltbedingungen quantifizieren kann. Aktuelle Methoden zur Messung der Alkoholempfindlichkeit in Drosophila-Testgruppen von Fliegen. Wir präsentieren eine einfache, kostengünstige, hochdurchsatzhohe Methode zur Beurteilung der Alkoholempfindlichkeit bei einer großen Anzahl von Einzelfliegen.

Variation der Alkoholempfindlichkeit bei Drosophila kann in ähnliche Phänotypen beim Menschen übersetzt werden, da Fliegen etwa 75% ihrer Gene mit menschlichen Orthologs teilen. Der von uns entwickelte Test kann auch angewendet werden, um die Auswirkungen der akuten Toxizität von flüchtigen Stoffen auf andere Insekten, einschließlich anderer Fliegenarten oder Krankheitsvektoren, zu messen. Beginnen Sie mit dem Erstellen einer Pappvorlage einer 24-Well-Zellkulturplatte.

Verfolgen Sie die Platte und schneiden Sie den ausgewiesenen Bereich aus. Verwenden Sie dann die Kartonschablone, um ein Stück kleines Insektensiebe-Netz in der Größe der Platte zu erstellen. Legen Sie eine kleine Linie von Heißkleber um den Umfang einer 24-Well-Kulturplatte, und befestigen Sie das Siebgitter auf den Brunnen.

Dann verwenden Sie die Heißklebepistole, um einen hölzernen Bastelstab an drei Seiten der Kulturplatte zu sichern. Bereiten Sie so viele Platten vor, wie in den Filmraum passen können. Um die Filmkammer zu erstellen, schneiden Sie ein Loch von der Größe der Videokameralinse auf einer Seite einer Polystyrol-Box und einen zusätzlichen Schlitz auf der Größe des Beleuchtungspads auf der gegenüberliegenden Seite.

Setzen Sie das Beleuchtungspad in den Schlitz ein, und positionieren Sie die Kamera im Linsenloch über dem Beleuchtungspad. Platzieren Sie alle Prüfmaterialien in einer kontrollierten Umgebung, vorzugsweise in einer Verhaltenskammer mit ca. 30 % Luftfeuchtigkeit, 25 Grad Celsius Temperatur, gleichmäßigem Luftstrom und Geräuschpegeln unter 65 Dezibel. Verwenden Sie die zuvor hergestellte Kartonschablone, um zwei Stücke Käsetuch zu schneiden.

Dann pipette einen Milliliter 100%Ethanol durch das Siebgitter in jeden Brunnen. Trocknen Sie das Netz, und legen Sie die beiden Stücke Käsetuch auf der Oberseite. Schneiden Sie ein kleines Stück dünnes, flexibles Kunststoff-Schneidebrett, indem Sie die Pappschablone als Leitfaden für die Erweiterung des Bereichs um ein bis zwei Zentimeter auf einer der kurzen Seiten verwenden.

Achten Sie nach dem Schneiden darauf, dass der Kunststoff noch zwischen die drei hölzernen Bastelstäbe am Prüfgerät passt, aber an einem Ende hängt. Bereiten Sie einen Aspirator nach Manuskriptanweisungen vor und übertragen Sie damit eine Fliege pro Brunnen in eine 24-Well-Zellkulturplatte, die alle Brunnen mit zuvor angesaugten Fliegen mit dem flexiblen Kunststoff bedeckt. Zeichnen Sie die Brunnenposition und alle relevanten Genotyp- oder Phänotypinformationen jeder Fliege auf.

Halten Sie den flexiblen Kunststoff bündig mit der Oberseite der Zellkulturplatte, die die Fliegen enthält, und invertieren Sie die Platte auf die Oberseite der modifizierten Zellkulturplatte mit dem Ethanol. Verwenden Sie die Craft-Sticks, um die invertierte Zellkulturplatte auszurichten, um sicherzustellen, dass jeder Brunnen mit Ethanol mit jedem Brunnen ausgerichtet ist, der eine Fliege enthält. Stellen Sie sicher, dass das Beleuchtungspad bei voller Helligkeit leuchtet, und starten Sie die Aufnahme mit der Videokamera.

Setzen Sie die Fliegen dem Ethanol aus, indem Sie den Kunststoff zwischen den beiden Platten sorgfältig entfernen, um sicherzustellen, dass das Käsetuch nicht verdrängt wird. Wenn der Verdacht besteht, dass alle Fliegen die Haltungskontrolle verloren haben, tippen Sie fest in die Mitte der Platte. Wenn Bewegung vorhanden ist, fahren Sie mit der Aufzeichnung fort, und tippen Sie alle ein bis zwei Minuten, bis keine Bewegung auftritt.

Beenden Sie die Aufzeichnung, sobald keine Bewegung vorhanden ist. Um die Fliegen zu bergen, entfernen Sie die obere Platte aus dem Prüfgerät und aspirieren Sie die einzelnen Fliegen in ausgewählte Behälter. Ersetzen Sie das Ethanol in den modifizierten Zellkulturplatten mindestens einmal pro Stunde, um eine konsistente Ethanol-Exposition während des gesamten Testes zu erhalten, und wiederholen Sie das Experiment für so viele Proben wie gewünscht.

Sehen Sie sich die Videoaufzeichnung an, um die Fliegensedationszeit zu bestimmen, die als der Moment definiert ist, in dem eine Fliege die Haltungskontrolle und die Bewegungsfähigkeit verliert. Um die Genauigkeit zu gewährleisten, sehen Sie sich den Film umgekehrt an und zeichnen Sie die Zeit auf, in der sich die Fliege zu bewegen beginnt. Diese Methode kann verwendet werden, um Daten auf einer großen Anzahl von Fliegen innerhalb von 10 Minuten zu generieren.

Zwei 24-Well-Platten wurden verwendet, um gleichzeitig Ethanol-Sedierungszeiten für 48 Einzelfliegen von zwei DGRP-Linien mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten gegenüber Alkohol zu messen. Große Probengrößen erhöhen die Genauigkeit und reduzieren Fehler auf Umgebungsschwankungen. RAL_555 Fliegen waren weniger empfindlich als RAL-177-Fliegen.

Männchen und Frauen von RAL_177 zeigten keine sexuell dimorphe Wirkung, während die Weibchen der RAL_555 weniger empfindlich auf Ethanol-Exposition reagierten als die Männchen. Beim Versuch dieses Protokolls ist es entscheidend, das Streben von Fliegen und die Umkehrung der Zellkulturplatte präzise durchzuführen, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen. Da die Fähigkeit, einzelne Fliegen zu bewerten, verwirrende Effekte aufgrund von Gruppeninteraktionen vermeidet, verbessert dieser Test den Nutzen des Drosophila-Modells für Hochdurchsatzstudien über akute Auswirkungen der Alkoholexposition.