Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila
14. Juni 2021
Der Microplate-Feeder-Assay bietet eine wirtschaftliche Methode mit hohem Durchsatz zur Quantifizierung des Verbrauchs flüssiger Lebensmittel in Drosophila. Ein 3D-gedrucktes Gerät verbindet eine 96-Well-Mikroplatte, in der Fliegen untergebracht sind, mit einer 1536-Well-Mikroplatte, von der Fliegen eine Fütterungslösung mit einem Tracerfarbstoff verbrauchen. Der Volumenrückgang der Lösung wird spektralphotometrisch gemessen.
Der Mikroplatten-Feeder-Assay bietet eine einfache, wirtschaftliche Methode mit hohem Durchsatz zur Messung des Fütterungsverhaltens von Drosophila und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen, ausgefeilteren Methoden. Die Quantifizierung des Verbrauchs durch Messung der Absorption mit einem Plattenleser eliminiert manuelle Messungen und macht die manuelle Dateneingabe überflüssig. Daten sind auch für die programmatische Extraktion und Verarbeitung nutzbar.
Mit diesem Hochdurchsatz-Assay können wir den Verbrauch von wasserlöslichen Nährstoffen, Medikamenten, Pharmazeutika oder Toxinen quantifizieren und das System für Anwendungen bei einer Vielzahl von Insektenarten modifiziert werden. Beginnen Sie, indem Sie die geschmolzene Agarose in einen Reagenztrog gießen und 80 Mikroliter geschmolzene Agarose mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Well-Mikroplatte dosieren. Kühlen Sie die übrig gebliebene Agarose bis zu einer Woche in einem versiegelten Beutel und schmelzen Sie sie für die Herstellung zusätzlicher Teller wieder ein.
Wenn die Barrierestreifen zu locker sind, wickeln Sie sie um den Finger, um ihnen eine Krümmung zu geben, um sie in den Kanälen zu halten. Setzen Sie die Barrierestreifen in die Barrierestreifenkanäle ein, um die Kupplungen vorzubereiten. Befestigen Sie die Kupplung an einer Hungerplatte und stellen Sie sicher, dass Sie die Kupplung nicht verwenden, um die Platte zu manipulieren, da die Kupplung abrutschen kann.
Stellen Sie sicher, dass die abgewinkelte Ecke des Kopplers mit der abgewinkelten Ecke der Mikroplatte übereinstimmt, um die korrekte Ausrichtung beizubehalten. Sortieren Sie unter CO2-Betäubung drei bis fünf Tage alte Fliegen. Laden Sie einzelne Fliegen per Säule in die Hungerplatte.
Schließen Sie jede Spalte, während sie sich füllt, indem Sie ihren Barrierestreifen an die geschlossene Position anpassen. Zeichnen Sie das Probenlayout innerhalb der Mikroplatte sorgfältig auf. Sobald die Hungerplatte gefüllt ist, lassen Sie die Fliegen sich nach dem Entfernen des CO2 spontan erholen und verhungern Sie sie sechs Stunden lang ab ihrer anfänglichen Betäubungszeit.
Bereiten Sie 10 Milliliter flüssige Lebensmittel in einem 15 Milliliter konischen Röhrchen vor, indem Sie 0,4 Gramm Saccharose und 0,1 Gramm Hefeextrakt in 10 Milliliter destilliertem Wasser auflösen. Wirbeln Sie das Rohr vor, bis sich die Feststoffe vollständig auflösen. Fügen Sie 40 Mikroliter Farbstofflösung hinzu und geben Sie das flüssige Lebensmittel in eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einem 0,45-Mikrometer-Filter bestückt ist.
Filtern Sie jeweils etwa 1,5 Milliliter der Lösung in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie die Spritze mit der Lösung beiseite und filtern Sie die zusätzliche Lösung nach Bedarf während der Zubereitung der Zuführplatte. Bereiten Sie eine Zuführplatte vor, indem Sie den Boden einer 1536-Well-Mikroplatte mit einer Dichtfolie versiegeln.
Verwenden Sie ein Dichtungspaddel, um gründlich an der Folie zu haften. Schneiden Sie dann überschüssigen Film mit einer Rasierklinge vom linken und rechten Rand ab. Dosieren Sie 10 Mikroliter der gefilterten flüssigen Nahrung säulenweise in den oberen linken Brunnen für jeden Cluster von vier Vertiefungen der 1536-Well-Mikroplatte.
Sobald alle Vertiefungen gefüllt sind, tragen Sie eine Siegelfolie auf die Oberseite der Platte auf und befolgen Sie die gleichen Schritte, die zum Versiegeln des Bodens der Mikroplatte verwendet wurden. Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl von Platten. Zentrifugieren Sie die Platten bei 200 mal G für 10 Sekunden, um die Flüssigkeit abzulegen.
Lassen Sie die Platte nicht kühlen, da sich dadurch Kondensation in den Vertiefungen ansammeln und die Absorptionswerte verdecken kann. Perforieren Sie die Vertiefungen auf der Oberseite der Platte mit dem Nadelsondenwerkzeug, das mit einer Nadel mit einem Durchmesser von 0,25 Millimetern ausgestattet ist, und verwenden Sie die gleiche Reihenfolge zum Perforieren, die beim Dosieren der Lösungen verwendet wurde. Wischen Sie die Nadel zwischen den Lösungen ab, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Drehen Sie die Platte um und perforieren Sie die Vertiefungen auf der Unterseite. Lesen Sie die Absorption der Platte bei 630 Nanometern ohne Deckel ab. Legen Sie einen internen Deckel auf die obere Dichtungsfolie, um sicherzustellen, dass die Kondensationsringe die perforierten Vertiefungen umgeben, und legen Sie dann den externen Deckel auf die Platte.
Legen Sie die Zuführplatte mit der Vorderseite nach oben auf die Kupplung, so dass die Führungen die entsprechenden Löcher der Zuführplatte und der Hungerplatte ausrichten. Stellen Sie sicher, dass die Kupplung und die Platten richtig ausgerichtet sind. Sobald alle Zuführplatten auf die Kupplungen geladen sind, öffnen Sie die Vertiefungen für die Platten, indem Sie die Barrierestreifen an der Kupplung einstellen.
Legen Sie die Kupplungs- und Plattenbaugruppen in den Sekundärbehälter. Legen Sie die untere Hälfte einer Pipettenbox mit eingeweichten Papiertüchern in jeden sekundären Behälter, um Feuchtigkeit zu liefern. Schließen Sie den Deckel des Sekundärbehälters und geben Sie ihn in eine kontrollierte Umgebung.
Lassen Sie die Fliegen 22 Stunden lang verbrauchen. Überprüfen Sie nach den 22 Stunden der Belichtung jede Platte auf tote Fliegen und aktualisieren Sie das Plattenlayout entsprechend. Nachdem alle Platten überprüft wurden, betäuben Sie die Fliegen massenhaft, indem Sie CO2 in den Sekundärbehälter pumpen.
Stellen Sie nach etwa 60 Sekunden sicher, dass alle Fliegen immobilisiert sind. Klopfen Sie die Fliegen vorsichtig in die Hungerplatte und ersetzen Sie die Kunststoffbarrierestreifen. Entfernen Sie die Zuführungsplatten zum Lesen.
Lesen Sie die Absorption der Platte bei 630 Nanometern erneut. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Platten gelesen wurden. Die Verdunstung wurde für jede Bohrung quantifiziert und es wurde festgestellt, dass Korrelationen zwischen den Vertiefungen einzelner Platten bestehen.
Pearson-Korrelationskoeffizienten für Verdunstung versus Zeilen und Verdampfung versus Spalten wurden berechnet, um Trends zwischen Verdunstungs- und Bohrstandorten zu bewerten. Der Verbrauch für drei bis fünf Tage alte Canton-SB-Fliegen wurde quantifiziert, um die Gültigkeit des Protokolls festzustellen. Fliegen hatten die Wahl zwischen einer 4% igen Saccharoselösung mit 1% Hefeextrakt und einer 4% igen Saccharoselösung, ergänzt mit 15% Ethanol und 1% Hefeextrakt.
Sowohl Männchen als auch Weibchen zeigten eine überwältigende Präferenz für die Lösung mit Ethanol und Hefeextrakt. Es ist wichtig, bei der Konstruktion der Feederplatten die Konsistenz zu wahren und sicherzustellen, dass jeder Fliege ein identisches Verzehrszenario in Bezug auf Nahrungsvolumen, Verdunstung und Zugang präsentiert wird. Diese Technik wird es Forschern im Drosophila-Bereich ermöglichen, Hochdurchsatz-Assays für Verbrauchs- und Präferenzverhalten mit höherem Durchsatz und zu niedrigeren Kosten im Vergleich zu herkömmlichen Methoden durchzuführen.
Übersicht
Der Mikroplatten-Fütterungs-Assay bietet eine Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung des Fressverhaltens von Drosophila. Dieser kostengünstige Ansatz nutzt eine 3D-gedruckte Vorrichtung, um Mikroplatten zu verbinden, wodurch eine effiziente Messung des flüssigen Nahrungskonsums ermöglicht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Entomologie
Hintergrund
- Die Messung des Fressverhaltens bei Drosophila ist entscheidend für das Verständnis von Ernährungspräferenzen.
- Herkömmliche Methoden können arbeitsintensiv und weniger effizient sein.
- Der Mikroplatten-Futter-Assay vereinfacht diesen Prozess.
- Er nutzt spektrophotometrische Messungen zur Datenerfassung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Hochdurchsatzmethode zur Beurteilung der Nahrungsaufnahme bei Drosophila.
- Vereinfachung der Quantifizierung verschiedener Nährstoffe und Substanzen.
- Verbesserung der Effizienz von Studien zum Fressverhalten.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Agarose und Mikroplatten für Fütterungsassays.
- Sortierung und Anästhesierung von Fliegen für kontrollierte Fütterungsexperimente.
- Messung der Absorption zur Quantifizierung des Nahrungsverzehrs.
- Analyse der Daten auf Trends im Fressverhalten und in Futterpräferenzen.
Hauptergebnisse
- Fliegen zeigten eine Präferenz für Nahrung, die Ethanol und Hefeextrakt enthielt.
- Die Datensammlung wurde durch automatisierte Absorptionsmessungen vereinfacht.
- Verdunstungsraten wurden quantifiziert und auf Korrelationen analysiert.
- Der Test erwies sich als effektiv für Hochdurchsatz-Studien zur Nahrungsaufnahme.
Schlussfolgerungen
- Der Mikroplatten-Futtersuchtest ist ein wertvolles Werkzeug für die Drosophila-Forschung.
- Er ermöglicht eine effiziente und genaue Messung des Fressverhaltens.
- Diese Methode kann für verschiedene Insektenarten und Anwendungen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme in Modellorganismen unterstützt die Zielvalidierung und das phänotypische Screening in der frühen Forschung. Der Mikroplatten-Futter-Assay ermöglicht die hochdurchsatzfähige Messung der flüssigen Nahrungsaufnahme bei Drosophila und liefert quantitative Daten zur mechanistischen Risikominimierung bei ernährungsphysiologischen, toxikologischen oder pharmakologischen Interventionen. Dieser Ansatz verbessert die Vorhersagegenauigkeit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem die Konsummetriken über große Stichproben hinweg standardisiert werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem der Verbrauch von Nährstoffen, Toxinen oder Arzneimitteln in einem genetisch zugänglichen Modell quantifiziert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch standardisierte, absorbanzbasierte Messung der Flüssignahrungsaufnahme.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem reproduzierbare Konsumdaten für die Wirkstoffscreening generiert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem der individuelle Konsum von Fliegen in Mehrmuldenformaten isoliert wird.
- Operativer Wert: Löst Probleme der Assay-Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch versiegelte Mikroplatten und kontrollierte Korrektur der Verdunstung.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Eignung für Screenings und die Wiederverwendbarkeit der Plattform mithilfe von 3D-gedruckten Kupplungen, die 96- und 1536-Mulden-Mikroplatten synchronisieren.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem Dosis-Wirkungs-Analysen von verbrauchbaren Verbindungen ermöglicht werden.
- Mechanistische Entwederung: Konzentriert sich auf den prädiktiven Wert bei der Bewertung von Verhaltensreaktionen auf Substanzen wie Ethanol oder Hefeextrakt.
- Krankheitsrelevante Systeme: Unterstützt Studien zu konsumassoziierten Merkmalen unter Berücksichtigung umweltbedingter und pharmakologischer Variablen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen und unterstützt die quantitative Verhaltensphänotypisierung.
- Entdeckungsbiologie: Erklärt, wie die Methode Hypothesenprüfungen, die Aufklärung von Wegen oder die biologische Risikominimierung durch quantifizierte flüssige Nahrungsaufnahme unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays, die Reproduzierbarkeit oder quantitative Ausgaben, sofern diese durch den Artikel mittels Absorptionsmessungen vor und nach dem Verzehr belegt werden.
- Analytik: Hebt Messungen, Ausleseergebnisse oder statistische Ausgaben hervor, die Teams bei der Vergleichbarkeit von Bedingungen unterstützen, einschließlich der Korrektur für Verdunstung und der Pearson-Korrelationsanalyse.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit präklinischer Kontinuität oder der Abstimmung von Biomarkern, nur wenn dies durch den Quelltext mittels Präferenztests zwischen Saccharose- und Ethanol-supplementierten Lösungen belegt ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, anstatt als Einmalverfahren, durch 3D-gedruckte Kupplungen und Dichtprotokolle.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei konsumbezogenen Phänotypen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch mikroplattenbasierte Absorptionsmessungen und Barrierestrip-Kontrollen.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und geringeres biologisches Risiko in späteren Entwicklungsstadien durch Hochdurchsatz-Präferenz- und Konsumtests.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf quantitativen Aufnahmedaten über Verbindungsbibliotheken hinweg.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Expertise in der Handhabung von Drosophila, der Vorbereitung von Mikroplatten und der Spektrophotometrie.
- Zu den Anforderungen an Instrumente und analytische Infrastruktur gehören Plattenlesegeräte mit der Fähigkeit, bei 630 nm Absorption zu messen, sowie 3D-gedruckte Kupplungssysteme.
- Standardisierungsanforderungen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bezüglich Versiegelung, Perforation und Umweltkontrolle, um Kondensations- und Verdunstungsartefakte zu minimieren.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, wobei ein Potenzial für die Übertragung auf andere Insektenarten mit modifizierten Nahrungsformulierungen besteht.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: Verdunstung muss quantifiziert und korrigiert werden; das Kühlen von Platten verursacht Kondensation, die die Messungen beeinträchtigt; eine konsistente Ausrichtung von Kupplung und Mikroplatten ist für den korrekten Zugriff auf die Vertiefungen erforderlich.
