Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Das Ziel unserer Forschung ist es, eine kostengünstige und ethisch günstige Methode für das Screening neurotoxischer Verbindungen zu entwickeln. Traditionelle Methoden toxikologischer Tests stützen sich oft auf virtuelle Tarifmodelle, die teuer, zeitaufwändig und ansonsten ethisch bedenklich sind, wie wir wissen. Wir wollten untersuchen, ob wir frühe Anzeichen von Neurotoxizität mit einem alternativen Modell wie Drosophila melanogaster erkennen können, das sowohl sensitiv als auch skalierbar ist. Dieses Protokoll hilft uns, Verhaltensphänotypen wie Veränderungen von Bewegungsmustern und Hiperaktivität, aber auch progressiven motorischen Verfall oder Sicherheitsstörungen zu erkennen, und die breite Präferenz wird ebenfalls getestet.

Der Vorteil unseres Protokolls besteht darin, dass es den klassischen Kletterassay mit einer Echtzeit-Überwachungstechnologie kombiniert und es uns ermöglicht, subtile motorische Beeinträchtigungen zu erfassen, die möglicherweise übersehen werden. Durch traditionelle Methoden, die eine höhere Empfindlichkeit und präzisere Verhaltensdaten liefern.

[Erzähler] Zu Beginn füllst du die Fliegen vorsichtig in eine leere Flasche. Lege die Flasche mit den Fliegen in eine mit Eis gefüllte Schachtel und achte darauf, dass die gesamte Flasche bedeckt ist. Klopfen Sie nach einer Minute vorsichtig auf die Flasche, um sicherzustellen, dass alle Fliegen betäubt sind. Bereiten Sie einen kleineren Behälter vor, der mit Eis gefüllt ist. Legen Sie eine Petrischale oder eine flache, saubere Oberfläche auf das Eis, um eine gekühlte Plattform zu schaffen. Drehen Sie nun das Röhrchen über die gekühlte Petrischale und klopfen Sie vorsichtig ab, um die Fliegen auf die kalte Oberfläche zu entlassen. Füllen Sie die Fliegen vorsichtig in leere Fläschchen um. Lassen Sie die Fliegen sich 30 Minuten lang in einer kontrollierten Umgebung bei 25 Grad Celsius mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und 50 % Luftfeuchtigkeit von der Narkose erholen. Verwenden Sie anschließend für die Zubereitung der Mikrokapillarzuführung eine Pipette, um 10 Mikroliter der Testlösung manuell in jedes Mikrokapillarröhrchen zu laden, um ein gleichmäßiges Volumen über alle Proben hinweg zu gewährleisten. Geben Sie drei bis fünf Mikroliter Mineralöl in das offene Ende jedes Mikrokapillarröhrchens, um Verdunstung und Leckagen während des Experiments zu verhindern. Führen Sie die vorgefüllten Mikrokapillaren durch die Löcher in den Stopfen des Baumwollfläschchens ein, um einen sicheren Sitz zu gewährleisten. Legen Sie die Fläschchen mit den Fliegen in einen auf 25 Grad Celsius eingestellten Inkubator mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und lassen Sie die Fläschchen für die Dauer des Experiments im Inkubator. Füllen Sie die Fliegen alle 12 Stunden in ein sauberes, leeres Fläschchen, um ihre Bewegungsaktivität zu beurteilen. Messen und markieren Sie die Linie sieben Zentimeter vom Boden des Fläschchens entfernt mit einem Permanentmarker. Diese Markierung dient als Kletterziel. Positioniere eine Kamera oder ein Telefon an einem stabilen Ort, um das Kletterverhalten aufzuzeichnen. Sorgen Sie für die richtige Beleuchtung und einen transparenten Hintergrund, um eine klare Sichtbarkeit und Analyse zu ermöglichen. Vergewissern Sie sich, dass der Versuchsaufbau mit dem Sichtfeld der Kamera kompatibel ist, und starten Sie die Aufnahme. Überprüfen Sie die Videoaufnahmen und messen Sie die Zeit, die jede Fliege benötigt, um die Sieben-Zentimeter-Marke zu erreichen. Bereiten Sie die Zuführmikrokapillaren mit der Proben- und Mineralöldichtung wie zuvor gezeigt vor. Bereiten Sie dann die einzelnen Fortbewegungskammern mit durchsichtigen Plastikstrohhalmen vor, die auf eine Länge von etwa sechs Zentimetern geschnitten sind. Verschließen Sie ein Ende jedes Strohhalms mit einer transparenten Folie, um einen luftdichten Verschluss zu erzielen. Erstellen Sie in der Nähe des versiegelten Endes des Halms ein kleines Loch, um die Mikrokapillare einzuführen, um sicherzustellen, dass sie eng anliegt und während des Assays nicht ausläuft oder sich bewegt. Nachdem Sie die Fliegen wie zuvor gezeigt betäubt und getrennt haben, legen Sie mit einem feinen Pinsel vorsichtig eine betäubte Fliege in jedes Röhrchen. Versiegeln Sie das offene Ende jedes Schlauchs entweder mit einer transparenten Folie oder einem Wattestopfen, um einen Luftstrom zu ermöglichen und gleichzeitig ein Entweichen zu verhindern. Führen Sie nun in jede vorbereitete Kammer eine vorgefüllte Mikrokapillare durch das dafür vorgesehene Loch ein. Legen Sie die zusammengesetzten Röhrchen in die Assay-Arena und stellen Sie sicher, dass die Mikrokapillaren für den täglichen Austausch zugänglich bleiben. Platzieren Sie das gesamte Setup in einer Kammer, die bei 25 Grad Celsius mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und 50 % Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Verbinden Sie das Gerät mit dem lokalen Tracking-System oder Netzwerk. Greifen Sie auf die Softwareplattform zu, und suchen Sie das Gerät, das dem Experiment zugewiesen ist. Stellen Sie sicher, dass das System jede Fliege anhand visueller Marker korrekt verfolgt. Geben Sie alle experimentellen Metadaten ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Assays. Die Steigfähigkeit, die mit dem negativen Geotaxis-Assay nach 24 und 48 Stunden beurteilt wurde, zeigt eine ähnliche Leistung zwischen der Kontroll- und der Behandlungsgruppe nach 24 Stunden, was auf keine unmittelbaren motorischen Defizite hinweist. Nach 48 Stunden brauchen die behandelten Fliegen fast doppelt so lange zum Klettern im Vergleich zu Kontrollen, was auf eine signifikante motorische Beeinträchtigung hinweist. Die kontinuierliche Aktivitätsverfolgung zeigt, dass behandelte Fliegen zunächst eine erhöhte Bewegung zeigen, ihre Aktivität jedoch nach 12 Stunden stark abnimmt, was auf eine frühe Übererregbarkeit gefolgt von einer verminderten motorischen Funktion hindeutet. Nach 24 bis 40 Stunden zeigen die behandelten Fliegen im Vergleich zu den Kontrollen eine reduzierte Bewegung. Insgesamt haben die behandelten Fliegen über einen Zeitraum von 40 Stunden eine um etwa 20 % reduzierte Aktivität. Die behandelten Fliegen reagierten zunächst mit einer Verzögerung auf die Lichtsignale, gefolgt von einer vorübergehenden zirkadianen Ausrichtung, verloren aber nach und nach um 48 Stunden an Rhythmizität, wahrscheinlich als Folge eines Lokomotivdefizits. Behandelte Fliegen bevorzugen Lichtzonen mehr als Bekämpfungsmittel.