Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Diese Free-Floating-Technik kann verwendet werden, um eine verminderte Immunhistochemie an Gehirngewebeproben von Mäusen durchzuführen. Die Free-Floating-Technik bietet mehrere Vorteile. Die Aufnahme dickerer Gewebeschnitte, die Durchführung von groß angelegten Studien mit 30 bis 40 Scheiben pro Aliquot und die Langzeitlagerung von Proben.

Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, empfehlen wir Ihnen, das Montieren von Abschnitten zu üben, die für Ihr Experiment nicht entscheidend sind, um Erfahrungen mit der Methode zu sammeln. Akklimatisieren Sie die interessierenden Proben mindestens ein bis zwei Stunden vor dem Schnitt im Kryostaten bei der entsprechenden Gewebeschneidetemperatur. Wenn die Taschentücher fertig sind.

Verwenden Sie den Kryostaten, um 20 bis 50 Mikrometer dicke Schnitte zu entnehmen, und platzieren Sie die Schnitte in einzelnen Einsätzen in PBS-gefüllten Wells einer Sechs- oder 12-Well-Platte. Wenn alle Schnitte entnommen wurden, bedecken Sie die Proben mit etwa sechs Millilitern pro Waschgang für drei fünfminütige Waschgänge, bevor Sie jede Vertiefung der Schnitte in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die ein bis 1,5 Milliliter Aufbewahrungslösung pro Röhrchen enthalten. Lagern Sie die Proben dann bis zur Färbung bei minus 80 Grad Celsius.

Für die Färbung von Gewebeschnitten werden die Proben 10 bis 20 Minuten lang auf Raumtemperatur äquilibriert, bevor die Schnitte in einer neuen Sechs-Well-Platte in Einsätze umgefüllt werden. Wenn die gesamte Vorratslösung entleert ist, bringen Sie die Einsätze in neue Vertiefungen, die etwa sechs Milliliter TBS pro Vertiefung für drei Wäschen für fünf Minuten mit frischem TBS pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur enthalten. Geben Sie nach dem letzten Waschen sieben Milliliter frisch zubereitete blockierende permeabilisierende Lösung in jede Vertiefung für eine 30-minütige Inkubation auf dem Shaker bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation geben Sie einen Milliliter der primären Antikörperlösung von Interesse in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Einsatz und übertragen Sie alle Abschnitte in jedem Einsatz in das entsprechende Zwei-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie dann die Röhrchen auf einen rotierenden Mischer. Fügen Sie etwa sieben Umdrehungen pro Minute hinzu, um eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius

Am nächsten Morgen werden die Abschnitte aus jedem Röhrchen in eine neue Sechs-Well-Platte in einzelne Well-Einsätze umgefüllt und die Abschnitte zweimal für 30 Sekunden pro Waschgang und einmal für 10 Minuten in frischem TBS pro Waschgang gewaschen. Nach dem letzten Waschen werden die Schnittgruppen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern überführt, die jeweils einen Milliliter der entsprechenden Sekundärantikörperlösung enthalten, und die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit und vor Licht geschützt inkubiert. Am Ende der Inkubation werden die Schnitte in einer neuen Sechs-Well-Platte in Einsätze umgefüllt und die Proben zweimal für 30 Sekunden und einmal für 15 Minuten in frischem TBS pro Waschgang lichtgeschützt gewaschen.

Nach dem letzten Waschen dekantieren Sie die Schnitte in eine rechteckige histologische Glaskammer, die zu drei Vierteln mit TBS gefüllt ist, und tauchen Sie einen Objektträger in den TBS. Mit einem feinen Pinsel und einer Lupenlampe, falls gewünscht, ziehen Sie die Schnitte vorsichtig in Richtung Objektträger und klopfen Sie vorsichtig einen Abschnitt auf den Objektträger, wobei Sie darauf achten, dass keine Falten oder Falten vorhanden sind. Wenn alle Schnitte auf einem Objektträger erfasst wurden, lassen Sie die Objektträger etwa 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt trocknen, bis die Schnitte undurchsichtig sind, und tragen Sie ein geeignetes wässriges Eindeckmedium auf die Schnitte auf.

Platzieren Sie mit einer Pinzette einen Deckglas auf dem Medium und drücken Sie mit einem Stück Filterpapier fest auf das Deckglas, um überschüssiges Medium zu entfernen. Die Schnitte können dann mit einem geeigneten Mikroskop abgebildet oder in einer dunklen Objektträgerbox bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden. Wie in diesen repräsentativen Bildern zu sehen ist, kann eine fluoreszierende immunhistochemische Analyse mit der Freefloating-Methode an Gewebeschnitten des Gehirns von Mäusen durchgeführt werden, um die Expression des sauren Proteins der Gliafibrilläre zu untersuchen.

Dieser Ansatz eignet sich auch für den Nachweis von Proteinen mit geringer Expression, wie z. B. GFP, in einer transgenen Maushirnprobe mit geringer Expression oder in nicht fluoreszierenden histochemischen Färbeprotokollen, wie z. B. Kresylviolett. Andere periphere Gewebe sind ebenfalls für die Anwendung dieser Technik zugänglich, ohne dass Modifikationen erforderlich sind, wie sie bei diesen GFP-exprimierenden Lebergewebeproben auf niedrigem Niveau beobachtet wurden. Das Wichtigste, was Sie bei der Free-Floating-Technik beachten sollten, ist, sanft mit den Schnitten umzugehen, insbesondere während des Transfers und wenn sich die Proben auf den Shakern oder Rotatoren befinden.

Neben einer Immunfluoreszenzfärbung kann diese Methode problemlos für andere histochemische Färbungen wie Hämatoxylin und Eosin und Kresylviolett oder für die Chromogen-Immunhistochemie modifiziert werden.