Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten
25. August 2020
Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.
Diese Free-Floating-Technik kann verwendet werden, um eine verminderte Immunhistochemie an Gehirngewebeproben von Mäusen durchzuführen. Die Free-Floating-Technik bietet mehrere Vorteile. Die Aufnahme dickerer Gewebeschnitte, die Durchführung von groß angelegten Studien mit 30 bis 40 Scheiben pro Aliquot und die Langzeitlagerung von Proben.
Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, empfehlen wir Ihnen, das Montieren von Abschnitten zu üben, die für Ihr Experiment nicht entscheidend sind, um Erfahrungen mit der Methode zu sammeln. Akklimatisieren Sie die interessierenden Proben mindestens ein bis zwei Stunden vor dem Schnitt im Kryostaten bei der entsprechenden Gewebeschneidetemperatur. Wenn die Taschentücher fertig sind.
Verwenden Sie den Kryostaten, um 20 bis 50 Mikrometer dicke Schnitte zu entnehmen, und platzieren Sie die Schnitte in einzelnen Einsätzen in PBS-gefüllten Wells einer Sechs- oder 12-Well-Platte. Wenn alle Schnitte entnommen wurden, bedecken Sie die Proben mit etwa sechs Millilitern pro Waschgang für drei fünfminütige Waschgänge, bevor Sie jede Vertiefung der Schnitte in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die ein bis 1,5 Milliliter Aufbewahrungslösung pro Röhrchen enthalten. Lagern Sie die Proben dann bis zur Färbung bei minus 80 Grad Celsius.
Für die Färbung von Gewebeschnitten werden die Proben 10 bis 20 Minuten lang auf Raumtemperatur äquilibriert, bevor die Schnitte in einer neuen Sechs-Well-Platte in Einsätze umgefüllt werden. Wenn die gesamte Vorratslösung entleert ist, bringen Sie die Einsätze in neue Vertiefungen, die etwa sechs Milliliter TBS pro Vertiefung für drei Wäschen für fünf Minuten mit frischem TBS pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur enthalten. Geben Sie nach dem letzten Waschen sieben Milliliter frisch zubereitete blockierende permeabilisierende Lösung in jede Vertiefung für eine 30-minütige Inkubation auf dem Shaker bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation geben Sie einen Milliliter der primären Antikörperlösung von Interesse in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Einsatz und übertragen Sie alle Abschnitte in jedem Einsatz in das entsprechende Zwei-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie dann die Röhrchen auf einen rotierenden Mischer. Fügen Sie etwa sieben Umdrehungen pro Minute hinzu, um eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius
zu erhalten.Am nächsten Morgen werden die Abschnitte aus jedem Röhrchen in eine neue Sechs-Well-Platte in einzelne Well-Einsätze umgefüllt und die Abschnitte zweimal für 30 Sekunden pro Waschgang und einmal für 10 Minuten in frischem TBS pro Waschgang gewaschen. Nach dem letzten Waschen werden die Schnittgruppen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern überführt, die jeweils einen Milliliter der entsprechenden Sekundärantikörperlösung enthalten, und die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit und vor Licht geschützt inkubiert. Am Ende der Inkubation werden die Schnitte in einer neuen Sechs-Well-Platte in Einsätze umgefüllt und die Proben zweimal für 30 Sekunden und einmal für 15 Minuten in frischem TBS pro Waschgang lichtgeschützt gewaschen.
Nach dem letzten Waschen dekantieren Sie die Schnitte in eine rechteckige histologische Glaskammer, die zu drei Vierteln mit TBS gefüllt ist, und tauchen Sie einen Objektträger in den TBS. Mit einem feinen Pinsel und einer Lupenlampe, falls gewünscht, ziehen Sie die Schnitte vorsichtig in Richtung Objektträger und klopfen Sie vorsichtig einen Abschnitt auf den Objektträger, wobei Sie darauf achten, dass keine Falten oder Falten vorhanden sind. Wenn alle Schnitte auf einem Objektträger erfasst wurden, lassen Sie die Objektträger etwa 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt trocknen, bis die Schnitte undurchsichtig sind, und tragen Sie ein geeignetes wässriges Eindeckmedium auf die Schnitte auf.
Platzieren Sie mit einer Pinzette einen Deckglas auf dem Medium und drücken Sie mit einem Stück Filterpapier fest auf das Deckglas, um überschüssiges Medium zu entfernen. Die Schnitte können dann mit einem geeigneten Mikroskop abgebildet oder in einer dunklen Objektträgerbox bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden. Wie in diesen repräsentativen Bildern zu sehen ist, kann eine fluoreszierende immunhistochemische Analyse mit der Freefloating-Methode an Gewebeschnitten des Gehirns von Mäusen durchgeführt werden, um die Expression des sauren Proteins der Gliafibrilläre zu untersuchen.
Dieser Ansatz eignet sich auch für den Nachweis von Proteinen mit geringer Expression, wie z. B. GFP, in einer transgenen Maushirnprobe mit geringer Expression oder in nicht fluoreszierenden histochemischen Färbeprotokollen, wie z. B. Kresylviolett. Andere periphere Gewebe sind ebenfalls für die Anwendung dieser Technik zugänglich, ohne dass Modifikationen erforderlich sind, wie sie bei diesen GFP-exprimierenden Lebergewebeproben auf niedrigem Niveau beobachtet wurden. Das Wichtigste, was Sie bei der Free-Floating-Technik beachten sollten, ist, sanft mit den Schnitten umzugehen, insbesondere während des Transfers und wenn sich die Proben auf den Shakern oder Rotatoren befinden.
Neben einer Immunfluoreszenzfärbung kann diese Methode problemlos für andere histochemische Färbungen wie Hämatoxylin und Eosin und Kresylviolett oder für die Chromogen-Immunhistochemie modifiziert werden.
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Übersicht
Die Schwimmtechnik wird zur Durchführung der Immunhistochemie an fixierten Gewebeschnitten verwendet und ermöglicht die Visualisierung biologischer Strukturen, Zelltypen und Proteinausprägungen. Diese Methode eignet sich besonders zur Untersuchung verschiedener Gewebe wie Gehirn, Herz und Leber und bietet Vorteile wie dickere Gewebeschnitte sowie Eignung für großangelegte Studien.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Histologie
- Immunhistochemie
- Gewebeanalyse
Hintergrund
- Zu den Vorteilen der frei schwebenden Technik gehören eine einfachere Handhabung und die Möglichkeit der Langzeitlagerung von Proben.
- Diese Methode ist ohne Modifikationen auf verschiedene biologische Gewebe anwendbar.
- Sie verbessert die Detektion schwach exprimierter Proteine in verschiedenen Probentypen.
Verwendete Methoden
- Immunhistochemische Färbung
- Gewebeproben aus Maushirn
- Fluoreszenzmikroskopie
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht die Identifizierung der Expression des glialen fibrillären sauren Proteins.
- Sie zeigt Wirksamkeit in Kontexten mit geringer Proteinexpression, wie beispielsweise bei GFP-transgenen Mäuseproben.
- Andere Färbemethoden wie die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung können ebenfalls mit dieser Technik angewendet werden.
Schlussfolgerungen
- Die Studie unterstreicht die Vielseitigkeit der schwimmenden Technik für die Gewebefärbung und -analyse.
- Es ist für Forscher entscheidend, die Proben während der Experimente vorsichtig zu behandeln, um deren Integrität zu bewahren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die schwimmende Immunhistochemie-Technik ermöglicht eine effiziente Bearbeitung dicker Gewebeschnitte für groß angelegte Studien und unterstützt die Zielvalidierung sowie die mechanistische Risikominimierung in der Neurowissenschaft und der peripheren Gewebeforschung. Durch die verbesserte Penetration von Antikörpern und die Möglichkeit, 30–40 Schnitte pro Aliquot in Chargen zu bearbeiten, wird die Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung in Entdeckungsabläufen erhöht. Dieser Ansatz ist besonders wertvoll zur Untersuchung von Proteinexpressionsmustern in komplexen Geweben wie dem Gehirn, wo die 3D-Rekonstruktion neuronaler Projektionen zur Zielvertrauensbildung und Portfolio-Priorisierung beiträgt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Visualisierung der Proteinexpression und -lokalisation in dicken Gewebeschnitten und unterstützt dadurch die funktionelle Zielvalidierung und die Aufklärung von Signalwegen.
- Operativer Wert: Erleichtert die Handhabung einer großen Anzahl von Schnitten pro Aliquot und reduziert den Arbeitsaufwand bei groß angelegten Biomarker-Screening-Kampagnen.
- Prädiktiver Wert: Verbessert im Vergleich zu auf Objektträgern montierten Methoden die Penetration von Antikörpern, wodurch die Detektion seltener Zielstrukturen wie GFP in transgenen Modellen zuverlässiger wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Kompatibel mit mehreren histochemischen Färbungen, einschließlich Hämatoxylin und Eosin, Cresylviolett sowie chromogener Immunhistochemie, was flexible Assay-Entwicklung ermöglicht.
- Operativer Wert: Die Schnitte verbleiben während der Färbung in Suspension in der Lösung, wodurch eine gleichmäßige Reagenzienexposition gewährleistet und die Variabilität zwischen Wiederholungen minimiert wird.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Langzeitlagerung bei -80 °C und damit die Batch-Verarbeitung sowie retrospektive Analysen in Entdeckungspipelines.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Anwendbar auf zentrale und periphere Gewebe (z. B. Leber, Herz) ohne Modifikation des Protokolls, was die Validierung über verschiedene Zielstrukturen hinweg unterstützt.
- Mechanistische Ent风险minimierung: Ermöglicht die 3D-Rekonstruktion axonaler und dendritischer Projektionen und liefert damit einen strukturellen Kontext für die Analyse der Zielinteraktion und von Signalwegen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Erzeugt quantitative, räumlich aufgelöste Daten zur Proteinausprägung, die über Go/No-Go-Entscheidungen bei der präklinischen Targetauswahl informieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode mit freischwimmenden Zellen fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Hypothesenprüfung des Targets über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Validierung ein, insbesondere in der Neurowissenschaft und der Bewertung systemischer Toxizität.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die hypothesengeleitete Untersuchung von Proteinexpressionsmustern in fixierten Geweben und ermöglicht mechanistische Einblicke in die Biologie des Zielmoleküls.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare, quantitative fluoreszierende oder chromogene Signale, die für automatisierte Bildgebung und bildbasierte Screening-Plattformen geeignet sind.
- Analytik: Liefert räumlich aufgelöste Expressionsdaten, die quantifiziert und zwischen experimentellen Bedingungen verglichen werden können, um die Modulation des Zielmoleküls zu bewerten.
- Translationale Forschung: Gewährleistet Konsistenz zwischen Entdeckungs- und präklinischen Modellen, indem identische Färbeprotokolle über verschiedene Arten und Gewebetypen hinweg angewendet werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine standardisierte, anpassbare Plattform für die histologische Analyse dar, die in mehreren Projekten und therapeutischen Bereichen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Nachweisempfindlichkeit und -spezifität in der Immunhistochemie und verringert falsch-negative Ergebnisse bei Target-Validierungsstudien.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Gewebehandlung und Färbeprozeduren, verbessert die Reproduzierbarkeit zwischen Laboren und reduziert technische Variabilität.
- Strategischer Wert: Erhöht den Durchsatz bei histologiebasierten Screenings, senkt die Kosten pro Probe und beschleunigt die Target-Entscheidungszyklen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die datengestützte Priorisierung von Targets, indem zuverlässige, multiparametrische Gewebeauswertungen bereitgestellt werden, die zur Beurteilung der biologischen Plausibilität und Sicherheitsmargen beitragen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Histologie, Gewebeschnitten sowie immunfluoreszenten oder chromogenen Nachweismethoden.
- Setzt Zugang zu Kryostaten, Mikrotomen, Orbitalschüttlern, rotierenden Mischnern und Fluoreszenz- oder Hellfeldmikroskopen voraus.
- Benötigt standardisierte Blockier-, Permeabilisierungs- und Waschpuffer, um unspezifische Bindungen zu minimieren und eine konsistente Färbung sicherzustellen.
- Erfordert die Optimierung von Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten für jedes Zielantigen und Gewebetyp, insbesondere bei Proteinen mit geringer Abundanz.
- Verlangt sorgfältige und schonende Handhabung freischwimmender Schnitte, um mechanische Schäden während der Übertragung und Inkubationsschritte zu vermeiden.
