Name: Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Erfahren Sie die frei schwebende Technik zur Immunhistochemie an Maushirngewebe. Diese Methode ermöglicht dickere Schnitte, Langzeitlagerung und die Detektion niedrig exprimierter Proteine wie GFAP und GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken dem National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 bis JMR), dem George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), dem College of Pharmacy an der University of Rhode Island (EP, GC, JMR) und Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Wir danken der Doktorandin Rebecca Senft, die bei Professor Susan Dymecki, Department of Genetics, Harvard Medical School, trainiert hat, für die Einführung in die Free-Floating-Methode. Einige Bilder, die in Abbildung 1 verwendet werden, stammen aus Quellen, die "frei zu verwenden, zu teilen oder zu modifizieren, auch kommerziell" sind: Maus und Mikrozentrifugenröhrchen (Pixabay), Mausgehirn (Jonas Töle, Wikimedia Commons), Kryostat und Mausgehirn (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), Glasbehälter (OpenClipart, FreeSvg.org) und Mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Gewebevorbereitung für die Kryosektion
<ol><li>Fixiertes Gewebe in eine geeignete Einbettform einbetten (siehe Materialtabelle), um einen Probenblock mit einer geeigneten Probenmatrix zu erzeugen (siehe Materialtabelle) und auf Trockeneis einfrieren. Lagern Sie Probenblöcke bei -80 °C, bis sie zum Schneiden bereit sind. ANMERKUNG: Festsitzende Gewebe werden in der Regel durch Perfusionierung von erwachsenen (ca. 2,5 – 30 Monate alten) männlichen oder weiblichen Nagetieren (Maus oder Ratte)34 in Übereinstimmung mit der verfügbaren ethischen Erlaubnis mit einem geeigneten Fixiermittel (z. B. 10 % Formalin) hergestellt, gefolgt von nachfixierenden Geweben in demselben Fixiermittel für 12 h bei 4 °C, wobei das Gewebe dreimal mit 1x PBS gewaschen wird. und Gewebe in 15% und dann 30% Saccharose in 1x PBS über Nacht oder bis das Gewebe35 sinkt. Forscher können versuchen, dieses allgemeine Protokoll an verschiedene Entwicklungsstadien anzupassen.</li>
</ol>2. Kryosektion
<ol><li>Wenn Sie zum Schnitt bereit sind, akklimatisieren Sie die Proben vor dem Schneiden mindestens 1-2 h im Kryostaten, um ein Zerbrechen des Gewebes zu verhindern.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryostaten in Abschnitte (20-50 μm) und sammeln Sie es in 6- oder 12-Well-Einsätzen (siehe Materialtabelle), die mit 1x PBS-Lösung gefüllt sind. HINWEIS: Abhängig von der Dicke des Abschnitts, der Menge des zu sammelnden Gewebes und der Anzahl der verwendeten Vertiefungseinsätze enthält jede Vertiefung eine variable Anzahl von Abschnitten, die sich über etwa 10 bis 40 Schichten erstreckt. Wenn zum Beispiel ein ganzes Gehirn bei 40 μm geschnitten wird, werden in jeder Vertiefung etwa 18-24 Abschnitte mit 12-Well-Einsätzen gesammelt. Außerdem können 20-μm-Abschnitte etwas schwierig zu handhaben sein, daher werden 40 μm für die Bulk-Färbung empfohlen (siehe Diskussion).</li>
</ol>3. Speichern von Abschnitten
<ol><li>Nach dem Sammeln die Abschnitte mit frisch zubereitetem 1x PBS für 5 min waschen. Wiederholen Sie 3 mal.</li>
	<li>Die Schnitte werden in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, die mit 1-1,5 mL Aufbewahrungslösung gefüllt sind (für 250 ml 70 g Saccharose, 75 ml Ethylenglykol mischen und mit 0,1 M Phosphatpuffer zum Volumen bringen).</li>
	<li>Bei -80 °C bis zur Färbung lagern.</li>
</ol>4. Färbung Tag I
<ol><li>Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur (RT) für 10 - 20 min äquilibrieren.</li>
	<li>Gießen Sie Abschnitte in einen Brunneneinsatz in einer 6-Well-Platte, um die Speicherlösung von den Abschnitten zu trennen.</li>
	<li>Schieben Sie den Well-Einsatz in eine andere Vertiefung, die ca. 6 ml 1x TBS enthält. Waschen Sie 3 mal mit 1x TBS für jeweils 5 min auf einem Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit bei RT.</li>
	<li>Während der Schnitte gewaschen werden, bereiten Sie 7 ml (pro Probe) einer blockierenden permeabilisierenden Lösung vor, die aus 1x TBS mit 0,3% Triton X-100 und 3% normalem Serum (z. B. normalem Pferdeserum) besteht. Blockieren Sie Abschnitte für 30 Minuten bei RT auf Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit. HINWEIS: Die Blockierung mit Seren verhindert die unspezifische Bindung von Antikörpern an Gewebe oder unspezifische Fc-Rezeptoren – ein Serum, das der Spezies des sekundären Antikörpers entspricht, wird empfohlen, aber wenn nicht verfügbar, kann ein normales Serum von einer anderen Spezies als dem primären Antikörper-Wirtstier verwendet werden. Das Reinigungsmittel Triton X-100 ermöglicht eine bessere Penetration der Antikörper durch Permeabilisierung des Gewebes.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 ml pro Probe einer primären Antikörperlösung, bestehend aus ausgewählten Primärantikörpern (entsprechend verdünnt) in 1x TBS mit 0,3 % Triton X-100 und 1 % normalem Serum vor (siehe Hinweis zu Schritt 4.4). Transferschnitte aus dem Bohrloch in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das die primäre Antikörperlösung enthält, um an die interessierenden Antigene zu binden. HINWEIS: Es können mehrere primäre Antikörper verwendet werden (die in verschiedenen Wirtsspezies erzeugt werden).</li>
	<li>Das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnitten wird mit niedriger Drehzahl (z. B. Drehzahl 7 U/min) auf einen rotierenden Mischer gestellt und über Nacht für 12-16 h bei 4 °C inkubiert.</li>
</ol>5. Färbetag II
<ol><li>Gießen Sie am nächsten Tag Schnitte in eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte, um die Abschnitte von der primären Antikörperlösung zu trennen. HINWEIS: Antikörperlösung kann gesammelt und wiederverwendet werden; Fügen Sie 0,02% (w/v) Natriumazid hinzu, um das mikrobielle Wachstum zu hemmen.</li>
	<li>Sektionen 3 mal mit 1x TBS bei RT waschen (30 s für die ersten 2 Wäschen und 10 min für die Endwäsche).</li>
	<li>Bereiten Sie 1 ml pro Probe einer sekundären Antikörperlösung, bestehend aus geeigneten sekundären Antikörpern (entsprechend verdünnt) in 1x TBS mit 0,3% Triton X-100 und 1% normalem Serum (Lichtschutzlösung) vor. HINWEIS: Die indirekte Markierung mit einem konjugierten sekundären Antikörper verstärkt das Signal und ermöglicht eine kolorimetrische oder fluoreszierende Visualisierung des Proteinziels.</li>
	<li>Überführen Sie die Schnitte in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit sekundärer Antikörperlösung. Inkubieren Sie für 2 h bei RT auf einem Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit (Abschirmlösung vor Licht).</li>
	<li>Gießen Sie Schnitte in eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte, um Abschnitte von der sekundären Antikörperlösung zu trennen.</li>
	<li>Um die Proben weiterhin vor Licht zu schützen, waschen Sie 2 mal mit 1x TBS für 30 s bei RT. Anschließend 15 min in 1x TB waschen, nach Belieben DAPI (1-0,1 μg/ml) hinzufügen.</li>
</ol>6. Montage
<ol><li>Gießen Sie Schnitte in eine rechteckige histologische Glaskammer, die zu drei Vierteln mit 1x TBS gefüllt ist.</li>
	<li>Tauchen Sie einen Glasträger in den 1x TBS und verwenden Sie einen feinen Pinsel, um die Abschnitte in Richtung der Folie zu locken.</li>
	<li>Klopfen Sie die Abschnitte vorsichtig auf die Schiene und achten Sie darauf, dass keine Falten oder Falten vorhanden sind.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Abschnitte auf den Schienen montiert sind. ANMERKUNG: Wenn z.B. ein ganzes Gehirn bei 40 μm geschnitten wird, gesammelt in 12-Well-Inserts, wobei ein Aliquot 18-24 Abschnitte enthält; Slices werden in der Regel auf 1-2 Folien montiert, aber je nach Präferenz des Forschers können auch weniger Abschnitte pro Folie montiert werden.</li>
</ol>7. Coverslipping
<ol><li>Nachdem die Abschnitte auf den Objektträgern getrocknet sind, etwa 10-15 Minuten bei RT oder bis die Abschnitte undurchsichtig aussehen (denken Sie daran, die Objektträger vor Licht zu schützen), tragen Sie ein geeignetes wässriges Einbettmedium auf (aushärtend oder nicht aushärtend). Antifading wird bevorzugt, wenn ein fluoreszierender konjugierter sekundärer Antikörper verwendet wird. HINWEIS: Die Fluoreszenzqualität kann bei Verwendung eines aushärtenden Einbettmediums geringer sein, aber die Objektträger sollten länger halten.</li>
	<li>Legen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas auf das Medium. Decken Sie das Gerät mit Filterpapier ab und drücken Sie es fest an, um überschüssiges Befestigungsmedium zu entfernen. HINWEIS: Wenn Sie eine nicht aushärtende Halterung verwenden, streichen Sie die Kanten des Deckglas-Objektträgers mit klarem Nagellack zum Versiegeln.</li>
	<li>Bildausschnitte mit einem geeigneten Mikroskop. In einem dunklen Schieberkasten bei 4 °C lagern. HINWEIS: Schnitte können mit einer Vielzahl von Mikroskopen abgebildet werden, z. B. mit konfokaler und inverser Laserscanning- oder aufrechter Weitfeldfluoreszenz, bei Vergrößerungen (z. B. 10x, 20x, 40x), je nach den Bedürfnissen des Forschers.</li>
</ol>

<ol><li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV%3A+Techniques+in+Experimental+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies%3A+indispensable+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li>
<li>Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+SN+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22">The Quarterly Review of Biology</a>. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374(1999).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+NationalAcademy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Hermersdörfer, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermersd%C3%B6rfer%2C+H+%22Immunocytochemistry.+A+Practical+Approach%22">Immunocytochemistry. A Practical Approach</a>. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Review+of+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphoproliferative+Diseases%22%5BJournal%5D)">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li>
<li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+%26+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).</li>
<li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).</li>
<li>Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).</li>
<li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focus+on+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A focus on fixation.</a> Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li>
<li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fos%3A+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li>
<li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li>
<li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+ofClinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li>
<li>Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+%28ANIT%29+induced+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li>
<li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li>
<li>Lönnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li>
<li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+%28GnRH%29+and+Pro-GnRH%2C+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li>
<li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li>
<li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li>
<li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain%3A+a+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li>
<li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury%3A+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li>
<li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li>
<li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papel+da+imuno-histoqu%C3%ADmica+no+diagn%C3%B3stico+do+c%C3%A2ncer+de+pulm%C3%A3o%5BTitle%5D)+AND+%22Jornal+Brasileiro+de+Pneumologia%22%5BJournal%5D)">Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurry%2C+RW+%22Immunocytochemistry%22">Immunocytochemistry</a>. , 65-77 (2009).</li>
<li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120(2015).</li>
<li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarr%2C+WB+%22Neuroanatomical+Tract-Tracing+Methods%22">Neuroanatomical Tract-Tracing Methods</a>. , Springer. 207-262 (1981).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cresyl+violet%3A+A+red+fluorescent+Nissl+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li>
</ol>

Nichts zu verraten

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine vielseitige Technik, die für die Identifizierung der Proteinexpression und -lokalisation in Gewebeschnitten von entscheidender Bedeutung ist. Dieser Assay wird in der gesamten wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet, um die Eigenschaften von Gewebe über Stadien der normalen Funktion bis hin zu Krankheitszuständen besser zu verstehen. IHC wird in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt, von der klinischen Diagnose von Krankheiten wie Krebs bis hin zu ersten Entdeckungen in der präklin...

Die Immunfärbung ist eine populäre Forschungspraxis, die vor 130 Jahren mit der Entdeckung von Serumantikörpern im Jahr 1890 durch von Behring1 begann. Während des frühen 20. Jahrhunderts wurden Farbstoffe an Antigene und später an Antikörper gebunden, um Reaktionen zu quantifizieren und zu visualisieren1, und 1941 entwickelte Albert Coons die ersten fluoreszierenden Antikörpermarkierungen, eine Entdeckung, die die Lichtmikroskopie revolutionierte 2,3. Der Begriff "Immunfärbung" umfasst viele Techniken, die nach diesem Prinzip entwickelt wurden, einschließlich Western Blot, Durchflusszytometrie, ELISA, Immunzytochemie und Immunhistochemie 3,4. Western Blot weist das Vorhandensein bestimmter Proteine aus Gewebe- oder Zellextraktennach 5. Proteine werden mittels Gelelektrophorese nach Größe getrennt, auf eine Membran übertragen und mit Antikörpern untersucht. Diese Technik zeigt das Vorhandensein von Protein an und wie viel Protein vorhanden ist. Es gibt jedoch keine Informationen über die Lokalisation des Proteins in Zellen oder Geweben. Eine andere Methode, die Immunzytochemie (ICC), markiert Proteine in Zellen, typischerweise Zellen, die in vitro kultiviert werden. ICC zeigt sowohl die Proteinexpression als auch die Lokalisation innerhalb zellulärer Kompartimente6. Um ein spezifisches Protein auf Gewebeebene zu erkennen und sichtbar zu machen, wird die Immunhistochemie (IHC) eingesetzt.
IHC ist eine Methode, die Forscher verwenden, um spezifische Antigene im Gewebe zu bekämpfen und dabei die chemischen Eigenschaften des Immunsystems zu nutzen 7,8. Durch die Erzeugung spezifischer primärer und sekundärer Antikörper, die entweder an ein Enzym oder einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind, können interessante Antigene in den meisten Geweben markiert und nachgewiesen werden (wie in Mepham und Britten beschrieben)9. Der Begriff "Immunhistochemie" an sich spezifiziert nicht die Markierungsmethode, die verwendet wird, um das interessierende Antigen zu enthüllen; Daher wird diese Terminologie oft mit der Detektionstechnik kombiniert, um die Markierungsmethode klar abzugrenzen: chromogene Immunhistochemie (CIH), um anzuzeigen, wann der sekundäre Antikörper an ein Enzym wie Peroxidase konjugiert ist; oder fluoreszierende IHC, um anzuzeigen, wann der sekundäre Antikörper an ein Fluorophor wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Tetramethylrhodamin (TRITC) konjugiert ist. Die Selektivität der IHC ermöglicht es Klinikern und Forschern, die Proteinexpression und -verteilung in verschiedenen Geweben über verschiedene Gesundheits- und Krankheitszustände hinweg zu visualisieren10. Im klinischen Bereich wird IHC häufig zur Diagnose von Krebs sowie zur Bestimmung von Unterschieden bei verschiedenen Krebsarten eingesetzt. IHC wurde auch verwendet, um verschiedene Arten von mikrobiellen Infektionen im Körper zu bestätigen, wie Hepatitis B oder C11. In der biomedizinischen Forschung wird IHC häufig verwendet, um die Proteinexpression in Geweben abzubilden und ist wichtig für die Identifizierung abnormaler Proteine, die in Krankheitszuständen beobachtet werden. Zum Beispiel geht die Neurodegeneration oft mit einer Anhäufung abnormaler Proteine im Gehirn einher, wie z. B. Αβ-Plaques und neurofibrilläre Verwicklungen bei der Alzheimer-Krankheit. Tiermodelle werden dann oft entwickelt, um diese pathologischen Zustände nachzuahmen, und IHC ist eine Methode, die Forscher verwenden, um die interessierenden Proteine zu lokalisieren und zu quantifizieren10,12,13. Im Gegenzug können wir mehr über die Ursachen dieser Krankheiten und die Komplikationen, die mit ihnen auftreten, erfahren.
Es gibt viele Schritte, die bei der Durchführung von IHC erforderlich sind. Zuerst wird das interessierende Gewebe gesammelt und für die Färbung vorbereitet. Die meisten Forscher präparieren wohl fixierte Gewebeproben, wobei die Perfusion des Fixiermittels über das Kreislaufsystem optimal ist, da es die Morphologie bewahrt14,15. Eine nachträgliche Fixierung von Gewebeproben kann ebenfalls verwendet werden, kann jedoch zu weniger als idealen Ergebnissen führen16. Vernetzende Fixiermittel wie Formaldehyd wirken, indem sie chemische Bindungen zwischen Proteinen im Gewebeherstellen 17. Fixiertes Gewebe wird dann mit einem Mikrotom in sehr dünne Schichten oder Abschnitte geschnitten, wobei viele Forscher es vorziehen, gefrorene Abschnitte mit einem Kryostaten zu sammeln. Von dort wird das Gewebe gesammelt und entweder direkt auf einen Objektträger montiert (Slide-Mounted-Methode) oder in einer Lösung suspendiert (Free-Floating-Methode), wie z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)18. Die verwendete Erfassungsmethode wird auf der Grundlage der Bedürfnisse des Forschers festgelegt, wobei jede dieser beiden Methoden ihre eigenen Vor- und Nachteile aufweist.
Die Slide-Mounted-Methode ist mit Abstand die am weitesten verbreitete, mit einem wichtigen Vorteil, dass sehr dünne Schnitte (10-14 μm) hergestellt werden können, was z.B. wichtig ist, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Es gibt auch eine minimale Handhabung der Probe, was eine mögliche Schädigung der strukturellen Integrität des Gewebesverringert 19. Forscher verwenden diese Technik häufig mit frischem gefrorenem Gewebe (Gewebe, das sofort mit Trockeneis, Isopentan usw. eingefroren wird), das im Vergleich zu festem Gewebe sehr empfindlich ist und viel Sorgfalt walten lässt, um ein Auftauen der Probe zu verhindern. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von auf Objektträgern montierten Abschnitten besteht darin, dass in der Regel keine großen Mengen an Lösungen für die Färbung benötigt werden4. So können Forscher eine kleinere Menge teurer Antikörper oder anderer Chemikalien verwenden, um die Färbung zu vervollständigen. Darüber hinaus ist es möglich, Schnitte aus mehreren verschiedenen Versuchsgruppen auf demselben Dia zu montieren, was insbesondere bei der Bildaufnahme von Vorteil sein kann. Auf der anderen Seite gibt es einige Nachteile bei der Verwendung von Objektträgerschnitten, vor allem, dass der Gewebeschnitt auf dem Objektträger haftet, wodurch das Eindringen von Antikörpern auf eine Seite des Abschnitts beschränkt wird, was die Schnittdicke und die 3D-Darstellung des Gewebes begrenzt. Es kann auch vorkommen, dass sich beim Waschen die Ränder des Gewebes und ganze Abschnitte vom Objektträger lösen und das gesamte Experiment unbrauchbar machen. Darüber hinaus muss die IHC in der Regel relativ schnell durchgeführt werden, wenn der Objektträgeransatz verwendet wird, um einen Abbau des Antigenepitops 20,21 zu vermeiden, wobei unverarbeitete Objektträger typischerweise bei -20 oder -80 °C gelagert werden, oft abgedeckt und horizontal oder in Objektträgerkästen gelagert werden, was zu einem relativ großen Speicherbedarf führt. Schließlich kann die Slide-Mounted-Technik auch zeitaufwendig sein, wenn Forscher eine große Anzahl von Objektträgern handhaben müssen, um eine große Anzahl von Gewebeschnitten zu verarbeiten.
Aufgrund einiger dieser Herausforderungen bei der Verwendung der Slide-Mounted-Methode ist eine Modifikation, die als Free-Floating-Methode bezeichnet wird, zu einer beliebten Alternative geworden. Diese Technik kam in den 1960-70er Jahren in die Literatur 22,23,24 und gewann in den 1980er Jahren an Popularität 25,26,27,28,29 und ist heute eine etablierte Methode, bei der die Färbung auf den gesammelten Abschnitten in Suspension durchgeführt wird, anstatt an einem Objektträger zu haften 12,30,31 . Die Free-Floating-Methode wird nicht empfohlen, wenn die Gewebeschnitte kleiner als 20 μm sind. Unserer Erfahrung nach ist es jedoch der Ansatz der Wahl, wenn dickere (40-50 μm) Abschnitte gefärbt werden sollen. Ein deutlicher Vorteil besteht darin, dass Antikörper frei schwebende Abschnitte aus allen Winkeln durchdringen können und aufgrund eines effektiveren Waschens weniger Hintergrundfärbung erzeugen, was zu einer besseren Signalübertragung bei der Bildgebung führt. Darüber hinaus werden die Schnitte nach der Verarbeitung auf die Objektträger montiert, wodurch die Möglichkeit einer Gewebeablösung ausgeschlossen wird und die Verweildauer des Kryostaten verringert wird. Die Free-Floating-Methode kann auch viel weniger arbeitsintensiv sein, insbesondere für groß angelegte biomedizinische Studien. Zum Beispiel ist es möglich, viele (18-40) Schnitte aus derselben Probe zusammen in derselben Vertiefung zu färben, was Zeit bei der Durchführung der Wasch- und Antikörperinkubationsschritte spart. Da mit diesem Ansatz eine größere Anzahl (12-16) von Schnitten pro Folie montiert werden kann, ist es für den Forscher oft bequemer und schneller, Schnitte anzuzeigen und abzubilden. Insbesondere bei der Montage von Gewebeschnitten auf den Objektträgern können Abschnitte befestigt und abgenommen werden, bis die gewünschte Orientierung erreicht ist. Die Forscher verwenden auch oft etwas niedrigere Konzentrationen von Antikörpern mit der Free-Floating-Methode, und da die Inkubationen in Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden, können die Antikörper leicht gesammelt und mit Natriumazid für die Wiederverwendung konserviert werden (siehe Schritt 5.1). Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Schnitte direkt bei -80 °C in kleinen Mikrozentrifugenröhrchen mit kryoprotektiver Lösung32 gelagert werden können, wodurch der Lagerraum minimiert und die Langlebigkeit der Proben33 maximiert wird. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die Abschnitte viel gehandhabt werden und daher anfällig für Beschädigungen sind. Dies kann jedoch durch niedrige Schüttel- und Drehgeschwindigkeiten sowie durch eine angemessene Schulung der Forscher für den Transfer der Proben und die Montage der Abschnitte auf den Objektträgern gemildert werden.
Zusammengenommen ist IHC ein etabliertes, essentielles Werkzeug für die Visualisierung und Lokalisierung der Proteinexpression sowohl in der klinischen als auch in der biomedizinischen Forschung. Free-floating-IHC ist eine effiziente, flexible und wirtschaftliche Methode, insbesondere bei der Durchführung umfangreicher histologischer Studien. Hier stellen wir ein zuverlässiges, frei schwebendes fluoreszierendes IHC-Protokoll für die wissenschaftliche Gemeinschaft vor, das entsprechend für chromogene IHC- und andere Färbungen wie Hämatoxylin- und Eosin- oder Kresylviolettfärbung angepasst werden kann.

<table><tbody><tr><td>12-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Klarer Nagellack</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Einbettformen</td><td>Thermo Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum, hitzeinaktiviert</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerboxen</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>71370</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primärer Antikörper</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckige Deckgläser</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Rechteckige Färbeschale</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>70312</td><td></td></tr><tr><td>Runder Künstlerpinsel #2</td><td>Princeton Select Serie</td><td>3750R</td><td>Marke nicht wichtig</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Probenmatrix zum Einbetten</td><td>von OCT Tissue-Tek, Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Fleckenablage &ndash; Objektträger-Färbesystem</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen</td><td>71396-B</td><td>Verwendung mit dunklem Deckel</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Mikro-Objektträger</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Benutzerpräferenz</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade-Eindeckmedium</td><td>Vektor Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Nicht aushärtende Well-Einsätze</td></tr><tr><td>für 12-Well-Platten</td><td>Corning Netwells</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Well-Einsätze für 6-Well-Platten</td><td>Corning Netwells</td><td>3479</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filterpapier</td><td>Millapore-Sigma</td><td>WHA1440042</td><td></td></tr></tbody></table>

histologische färbungen mit frei schwebenden gewebeschnitten

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Die Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Visualisierung spezifischer Gewebestrukturen sowie der Proteinexpression und -lokalisation. Zwei alternative Ansätze werden häufig verwendet, um die Gewebeschnitte während des Färbeverfahrens zu handhaben, ein Ansatz besteht darin, die Abschnitte direkt auf Glasobjektträgern zu montieren, während ein zweiter Ansatz, der freischwebende Ansatz, es ermöglicht, feste Abschnitte zu erhalten und zu färben, während sie in Lösung suspendiert sind. Obwohl Slide-Mounted- und Free-Floating-Ansätze zu ähnlichen Ergebnissen führen können, ermöglicht die Free-Floating-Technik eine bessere Penetration von Antikörpern und sollte daher die Methode der Wahl sein, wenn dickere Schnitte für die 3D-Rekonstruktion des Gewebes verwendet werden sollen, zum Beispiel wenn der Fokus des Experiments darauf liegt, Informationen über dendritische und axonale Projektionen in Hirnregionen zu gewinnen. Da die Schnitte in Lösung gehalten werden, können in einem einzigen Aliquot problemlos 30 bis 40 Schnitte aufgenommen werden, deren Handhabung insbesondere bei groß angelegten biomedizinischen Studien weniger aufwendig ist. Hier zeigen wir, wie die Free-Floating-Methode auf die fluoreszierende immunhistochemische Färbung angewendet werden kann, wobei der Schwerpunkt auf Hirnschnitten liegt. Wir werden auch diskutieren, wie die Free-Floating-Technik leicht modifiziert werden kann, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden und an andere Gewebe sowie andere histochemische Färbungen wie Hämatoxylin, Eosin und Kresylviolett anzupassen, solange die Gewebeproben richtig fixiert werden, typischerweise mit Paraformaldehyd oder Formalin.

Das Gesamtschema der Verwendung der Free-Floating-Methode zur Durchführung eines fluoreszierenden immunhistochemischen Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Beispiel für eine fluoreszierende IHC unter Verwendung der Free-Floating-Methode im Gehirn von Mäusen, bei der die Expression des sauren Gliafibrillenproteins (GFAP) untersucht wird, ist in Abbildung 2 sowohl bei niedrigerer als auch bei höherer Vergrößerung dargestellt, um die Gesamtqua...

Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.

Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

Diese Free-Floating-Technik kann verwendet werden, um eine verminderte Immunhistochemie an Gehirngewebeproben von Mäusen durchzuführen. Die Free-Floating-Technik bietet mehrere Vorteile. Die Aufnahme dickerer Gewebeschnitte, die Durchführung von groß angelegten Studien mit 30 bis 40 Scheiben pro Aliquot und die Langzeitlagerung von Proben.Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, empfehlen wir Ihnen, das Montieren von Abschnitten zu üben, die für Ihr Experiment nicht entscheidend sind, um Erfahrungen mit der Methode zu sammeln. Akklimatisieren Sie die interessierenden Proben mindestens ein bis zwei Stunden vor dem Schnitt im Kryostaten bei der entsprechenden Gewebeschneidetemperatur. Wenn die Taschentücher fertig sind.Verwenden Sie den Kryostaten, um 20 bis 50 Mikrometer dicke Schnitte zu entnehmen, und platzieren Sie die Schnitte in einzelnen Einsätzen in PBS-gefüllten Wells einer Sechs- oder 12-Well-Platte. Wenn alle Schnitte entnommen wurden, bedecken Sie die Proben mit etwa sechs Millilitern pro Waschgang für drei fünfminütige Waschgänge, bevor Sie jede Vertiefung der Schnitte in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die ein bis 1,5 Milliliter Aufbewahrungslösung pro Röhrchen enthalten. Lagern Sie die Proben dann bis zur Färbung bei minus 80 Grad Celsius.Für die Färbung von Gewebeschnitten werden die Proben 10 bis 20 Minuten lang auf Raumtemperatur äquilibriert, bevor die Schnitte in einer neuen Sechs-Well-Platte in Einsätze umgefüllt werden. Wenn die gesamte Vorratslösung entleert ist, bringen Sie die Einsätze in neue Vertiefungen, die etwa sechs Milliliter TBS pro Vertiefung für drei Wäschen für fünf Minuten mit frischem TBS pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur enthalten. Geben Sie nach dem letzten Waschen sieben Milliliter frisch zubereitete blockierende permeabilisierende Lösung in jede Vertiefung für eine 30-minütige Inkubation auf dem Shaker bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation geben Sie einen Milliliter der primären Antikörperlösung von Interesse in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Einsatz und übertragen Sie alle Abschnitte in jedem Einsatz in das entsprechende Zwei-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie dann die Röhrchen auf einen rotierenden Mischer. Fügen Sie etwa sieben Umdrehungen pro Minute hinzu, um eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius zu erhalten.Am nächsten Morgen werden die Abschnitte aus jedem Röhrchen in eine neue Sechs-Well-Platte in einzelne Well-Einsätze umgefüllt und die Abschnitte zweimal für 30 Sekunden pro Waschgang und einmal für 10 Minuten in frischem TBS pro Waschgang gewaschen. Nach dem letzten Waschen werden die Schnittgruppen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern überführt, die jeweils einen Milliliter der entsprechenden Sekundärantikörperlösung enthalten, und die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit und vor Licht geschützt inkubiert. Am Ende der Inkubation werden die Schnitte in einer neuen Sechs-Well-Platte in Einsätze umgefüllt und die Proben zweimal für 30 Sekunden und einmal für 15 Minuten in frischem TBS pro Waschgang lichtgeschützt gewaschen.Nach dem letzten Waschen dekantieren Sie die Schnitte in eine rechteckige histologische Glaskammer, die zu drei Vierteln mit TBS gefüllt ist, und tauchen Sie einen Objektträger in den TBS. Mit einem feinen Pinsel und einer Lupenlampe, falls gewünscht, ziehen Sie die Schnitte vorsichtig in Richtung Objektträger und klopfen Sie vorsichtig einen Abschnitt auf den Objektträger, wobei Sie darauf achten, dass keine Falten oder Falten vorhanden sind. Wenn alle Schnitte auf einem Objektträger erfasst wurden, lassen Sie die Objektträger etwa 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt trocknen, bis die Schnitte undurchsichtig sind, und tragen Sie ein geeignetes wässriges Eindeckmedium auf die Schnitte auf.Platzieren Sie mit einer Pinzette einen Deckglas auf dem Medium und drücken Sie mit einem Stück Filterpapier fest auf das Deckglas, um überschüssiges Medium zu entfernen. Die Schnitte können dann mit einem geeigneten Mikroskop abgebildet oder in einer dunklen Objektträgerbox bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden. Wie in diesen repräsentativen Bildern zu sehen ist, kann eine fluoreszierende immunhistochemische Analyse mit der Freefloating-Methode an Gewebeschnitten des Gehirns von Mäusen durchgeführt werden, um die Expression des sauren Proteins der Gliafibrilläre zu untersuchen.Dieser Ansatz eignet sich auch für den Nachweis von Proteinen mit geringer Expression, wie z. B. GFP, in einer transgenen Maushirnprobe mit geringer Expression oder in nicht fluoreszierenden histochemischen Färbeprotokollen, wie z. B. Kresylviolett. Andere periphere Gewebe sind ebenfalls für die Anwendung dieser Technik zugänglich, ohne dass Modifikationen erforderlich sind, wie sie bei diesen GFP-exprimierenden Lebergewebeproben auf niedrigem Niveau beobachtet wurden. Das Wichtigste, was Sie bei der Free-Floating-Technik beachten sollten, ist, sanft mit den Schnitten umzugehen, insbesondere während des Transfers und wenn sich die Proben auf den Shakern oder Rotatoren befinden.Neben einer Immunfluoreszenzfärbung kann diese Methode problemlos für andere histochemische Färbungen wie Hämatoxylin und Eosin und Kresylviolett oder für die Chromogen-Immunhistochemie modifiziert werden.

histological-based-stainings-using-free-floating-tissue-sections

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das folgende Video beschreibt, wie die Morphologie eines Gewebes durch Formalinfixierung und Paraffineinbettung erhalten werden kann.

Konservierung von formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE): Eine Methode zur Untersuchung der Gewebemorphologie

Hier demonstrieren wir die effizientesten Methoden zum Einfrieren, Einbetten, Kryoschneiden und Färben von Muskelbiopsien, um das Einfrieren von Artefakten zu vermeiden.

Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse

Ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn wird vorgestellt. Das Protokoll ist eine Variation der weit verbreiteten Slice-Kultur-Methode mit Membraneinsätzen. Es ist einfach, kostengünstig und wird für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren.

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Hier stellen wir detaillierte, robuste und komplementäre Protokolle zur Verfügung, um Färbung und subzelluläre Bildgebung von fixierten dreidimensionalen Zellkulturmodellen im Bereich von 100 μm bis zu mehreren Millimetern durchzuführen und so die Visualisierung ihrer Morphologie, Zelltypzusammensetzung und Wechselwirkungen zu ermöglichen.

Färbung und hochauflösende Bildgebung von dreidimensionalen Organoid- und Sphäroidmodellen

Dieses Protokoll beschreibt einen effizienten und reproduzierbaren Ansatz für histologische Studien des Mausgehirns, einschließlich Perfusion, Hirnschnitt, frei schwebende Immunfärbung, Gewebemontage und Bildgebung.

Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

Die elektronische präresonanzstimulierte Raman-Streuung (epr-SRS) Bildgebung von regenbogenartigen Raman-Farbstoffen ist eine neue Plattform für die hochgradig gemultiplexte Epitop-basierte Proteinbildgebung. Hier stellen wir einen praktischen Leitfaden vor, der die Antikörpervorbereitung, die Gewebeprobenfärbung, die SRS-Mikroskopmontage und die EPR-SRS-Gewebebildgebung umfasst.

Highly-Multiplexed Tissue Imaging mit Raman-Farbstoffen

Immunhistochemie: Paraffin Schnitte mit der Vectastain ABC Kit von Vector Labs

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Immunolokalisation in der Epidermis sowohl für gefrorene und Paraffinschnitte, die wir verwenden sehr routinemäßig in unserem Labor modifiziert.

Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

Die vollständige Genotypisierung von einer Maus Schwanz Probe, einschließlich Gewebe Verdauung und PCR-Anzeige ist in eineinhalb Stunden mit Sigma SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit durchgeführt.

Schnelle Genotypisierung von Maus Tissue Mit Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Erfahren Sie die frei schwebende Technik zur Immunhistochemie an Maushirngewebe. Diese Methode ermöglicht dickere Schnitte, Langzeitlagerung und die Detektion niedrig exprimierter Proteine wie GFAP und GFP.

Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Weitere Videos entdecken