Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten

Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zum genauen Vergleich der relativen Wirksamkeit von flüchtigen und nichtflüchtigen antimykotischen Verbindungen in verschiedenen Wachstumsstadien von Pilzen. Diese Methode eignet sich gut zur Bewertung der antimykotischen Aktivität von pflanzlichen Produkten, die in getrockneter oder flüssiger Form verwendet werden und eine große Vielfalt an Molekülen enthalten. Diese Methode kann wertvolle Informationen über die Anwendungsweise von pflanzlichen Produkten liefern und eignet sich besonders gut im Bereich der biologischen Schädlingsbekämpfung.

Das Verfahren wird von Valentina Gligorijevic, einer technischen Assistentin des Sup'Biotech-Labors, vorgeführt. Für die Entnahme von Konidien schichten Sie drei Milliliter 0,05 %Tween 20 auf eine Trichoderma-Myzelkultur und verwenden Sie einen Rechen, um die Konidien von den Konidiophoren zu lösen, wobei Sie darauf achten, dass Sie nicht auf das Myzel drücken, um zu verhindern, dass die Hyphen weggerissen werden. Wenn alle Konidien freigesetzt wurden, verwenden Sie eine Mikropipette, um sie schnell zu erholen, und geben Sie die Konidienlösung zur Zählung in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Um Pilzplatten vorzubereiten, geben Sie 100 Mikroliter Sporen in einer Konzentration von dreimal 10 bis sechs Sporen pro Milliliter auf eine neun Zentimeter große Petrischale, die PDA-Medium enthält, und geben Sie mit einem sterilen Spatel 10 Gramm Glasperlen mit einem Durchmesser von zwei Millimetern auf die Platte. Schütteln Sie dann die Platte vorsichtig nach vorne und hinten und drehen und drehen Sie die Platte in 90-Grad-Segmenten, bis sie vollständig gedreht ist, um die Sporen gleichmäßig über die Oberfläche des Agars zu verteilen. Dann inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius bis zur Analyse der Wachstumshemmung.

Um einen Kontakt-Inhibitions-Assay mit Knoblauchpulver durchzuführen, verwenden Sie einen sterilen Spatel, um die gewünschte Knoblauchpulvermenge in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen zu wiegen. Um Konzentrationen zu erhalten, die im Allgemeinen zwischen 0,25 und 16 Milligramm pro Milliliter liegen. Geben Sie 10 Milliliter PDA mit etwa 45 Grad Celsius in jedes Röhrchen und drehen Sie jedes Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um das Pulver gleichmäßig im Agar zu verteilen.

Gießen Sie die homogenisierten Suspensionen schnell in Petrischalen mit einem Durchmesser von fünf Zentimetern und lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur erstarren. Um einen Kontakt-Inhibitions-Assay durchzuführen, verwenden Sie ein steriles Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, um einen Kreis in der Mitte des Agars in den mit Kontroll- und antimykotischen Verbindungen behandelten Schalen zu zeichnen, und verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um die Agarzylinder zu entsorgen. Verwenden Sie als Nächstes ein neues Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, um 15 bis 20 Kreise nach dem Zufallsprinzip in die Pilzplatten zu plotten, und verwenden Sie sterile Zahnstocher, um die mit Sporen, Hyphen oder Myzel bedeckten Zylinder vorsichtig in die leeren Bereiche der PDA-Platten zu übertragen.

Geben Sie die Platten dann wieder in den 30 Grad Celsius heißen Inkubator. Um eine Platte für einen antimykotischen Inhibitionsassay in der Dampfphase vorzubereiten, gießen Sie 10 Milliliter PDA-Medium in den Deckel einer Petrischale mit einem Durchmesser von fünf Zentimetern, die 10 Milliliter PDA-Medium enthält, das antimykotische Verbindungen oder PDA-Medium enthält, und lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur erstarren. Machen Sie mit einem 50-Milliliter-Zentrifröhrchen als Kalibrierwerkzeug einen PDA-Kreis in der Mitte des Agars und verwenden Sie einen sterilen Spatel, um den Agar um den Kreis herum zu entfernen.

Verwenden Sie ein steriles Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, um einen Kreis in der Mitte des Mediums im Deckel zu zeichnen, und verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um den Schneckenzylinder zu entsorgen. Verwenden Sie dann ein steriles Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, um nach dem Zufallsprinzip Pfropfen in die vorbereiteten Pilzplatten zu setzen, und verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um mit Sporen, Hyphen oder Myzel beschichtete Pfropfen vorsichtig in die Deckel der Assay-Platten zu übertragen. In dieser Analyse wurde die Wachstumshemmung der Trichoderma-Spezies SBT 10-2018, die durch drei antimykotische Verbindungen ausgelöst wurde, unter Verwendung von Kontakt- und Dampfphasen-Inhibitionsassays untersucht, wie für jedes Pilzstadium gezeigt.

Eine höhere Sporenempfindlichkeit gegenüber Carbendazim wurde im Vergleich zu frühen Hyphen und Myzelnetzwerken beobachtet, wenn Trichoderma und Antimykotika in Kontakt kamen. Im Gegensatz dazu hatte Carbendozim keine antimykotische Wirkung auf die Trichoderma, wenn der Pilz entsprechend der geringen Flüchtigkeit dieser Substanz in einem Abstand zum Fungizid platziert wurde. Wenn ätherisches Thymus vulgaris-Öl als antimykotische Verbindung verwendet wurde, wurde eine höhere Empfindlichkeit für Sporen und frühe Hyphen im Vergleich zur Hemmung des Myzelwachstums bei 0,025% ätherischem Öl beobachtet.

Wie erwartet, zeigte das ätherische Öl des Thymus vulgaris unabhängig von der Entfernung zwischen dem Pilz und dem Öl eine identische antimykotische Wirkung. Bei der Verwendung von Knoblauchpulver wurde eine höhere Wirksamkeit gegen die Sporenkeimung und die frühe Hyphenverlängerung beobachtet als bei Mycelliumwachstum. Bei der Vorbereitung der Pilzplatte muss besonders darauf geachtet werden, dass die Sporen gleichmäßig auf der Oberfläche der Agarplatte verteilt sind, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen.