Name: Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Plug-Transfer-Technik zur Bewertung antimykotischer Aktivität flüchtiger und nichtflüchtiger Verbindungen an verschiedenen Pilzentwicklungsstadien. Diese Methode ermöglicht präzise Vergleiche für Biocontrol-Produkte.

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Wir sind Frank Yates sehr dankbar für seinen wertvollen Rat. Diese Arbeit wurde von Sup'Biotech unterstützt.

1. Inocula-Vorbereitung
<ol><li>Vor dem Experiment lagen 5 L Trichoderma spp. SBT10-2018 Sporen bei 4 °C auf Kartoffeldextrose Agar Medium (PDA) gelagert und inkubieren für 4 Tage bei 30°C mit regelmäßiger Lichtexposition zur Förderung der Konidienbildung42 (Abbildung 1, Panel A). HINWEIS: Trichoderma spp. SBT10-2018 wurde aus Holz isoliert und wird als Modell in dieser Studie für sein schnelles Wachstum und die einfache Erholung der Sporen verwendet. Diese Sorte wird von unserem Labor konserviert.</li>
	<li>Conidia wiederherstellen (Abbildung 1, Panel A)<ol>
<li>Legen Sie 3 ml von 0.05% Tween-20 auf das Trichoderma Myzel.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Rechen, um Conidia von Conidiophoren zu lösen; vermeiden Sie es, auf das Myzel zu drücken, um zu verhindern, dass Hyphen weggerissen werden.</li>
		<li>Stellen Sie die Lösung schnell mit einer Mikropipette wieder her, um zu vermeiden, dass sie vom Agarmedium absorbiert wird, und übertragen Sie sie in ein 15 ml-Rohr.</li>
		<li>Zählen Sie die Gesamtzahl der Sporen mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine Lösung mit 3 x 106 Sporen/ml vor. HINWEIS: Dieser Schritt muss sorgfältig ausgeführt werden, um zu verhindern, dass Hyphen extrahiert werden. Die Sporenpräparation wird dann unter dem Mikroskop überprüft. Schließlich kann bei Stämmen, die hochantennes und flauschiges Myzel darstellen, ein Schritt der Filtration mit einem 40-M-Siebfilter hinzugefügt werden, um das Restmyzelfragment zu beseitigen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PilzplattenVorbereitung (Abbildung 1, Tafel B)
<ol><li>Legen Sie 100 l von 3 x 106 Sporen/ml mit einer Mikropipette auf einer Petrischale mit PDA-Medium mit 9 cm Durchmesser ab, um 4.800 Sporen/cm2 zu erhalten, was 925 Sporen/5 mm Durchmesser-Agar-Stecker entspricht.</li>
	<li>Fügen Sie 10 g Glasperlen mit 2 mm Durchmesser mit einem sterilen Spachtel hinzu und führen Sie Vorwärts- und Rückwärtsbewegungen parallel und senkrecht zum Arm des Bedieners aus, um die Sporen auf der Oberfläche des Agars gleichmäßig zu verteilen.</li>
	<li>Drehen Sie die Platte um 90° und wiederholen Sie die rotierenden Bewegungen (wie in Abschnitt 2.2); wiederholen Sie diese Schritte, bis die Platte vollständig gedreht wurde.</li>
	<li>Verwenden Sie die Platte sofort, um Experimente zu beginnen, die Sporen erfordern, oder bebrüten Sie die Platten bei 30 °C für 17 h bzw. 24 h, wenn frühe Shyphen bzw. Myzel benötigt werden. ANMERKUNG: Um die antimykotische Aktivität zu vergleichen, die nach mycelium plug-transfer und Mycelium Disk-Transfer gemessen wird, verwenden Sie sterile Pinzette und legen Sterile 5 mm Cellulosescheiben nach dem Sporenstreunen zufällig auf die Oberfläche der Agarplatte.</li>
</ol>3. Antimykotika-Herstellung
<ol><li>Pflanzliche Produktzubereitung: Knoblauch-Pulver-Zubereitung<ol>
<li>Die Nelken von frischem Knoblauch schälen und die Nelken mit einer Skalpellklinge in 2-3 mm breite Scheiben schneiden.</li>
		<li>Die Scheiben 2 Tage bei 40 °C lufttrocknen.</li>
		<li>Schleifen Sie die Scheiben für 3 x 15 Sekunden mit einer Messermühle, um ein feines Pulver zu erhalten.</li>
		<li>Das Knoblauchpulver vor Gebrauch bei 4 °C in 50 ml-Röhrchen lagern. HINWEIS: Da Knoblauch nicht autoklaviert ist (um den Abbau temperaturempfindlicher Antimykotika zu verhindern), reinigen Sie den Schleifer, das Skalpell und den Lufttrockner vor Gebrauch mit 70 % Ethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ätherische Ölzubereitung<ol>
<li>Bereiten Sie 0,5%, 1%, 2,5%, 5% und 20% Thymus vulgaris ätherische Öllösungen in 0,5% Tween-80 vor.</li>
		<li>Gut mischen, um eine Emulsion zu bilden, bevor sie in das PDA-Medium einfügt (siehe Abschnitt 4.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Carbendazim Vorbereitung<ol>
<li>Wiegen Sie Carbendazim, um eine 200 mg/L Ethanollösung vorzubereiten (Carbendazim ist schlecht in Wasser löslich).</li>
		<li>Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur auf, bevor Sie sie in das PDA-Medium einfügt (siehe Abschnitt 4.2). VORSICHT: Carbendazim stellt eine Gesundheits- und Umweltgefährdung dar. Tragen Sie Handschuhe und Maske, wenn Sie mit diesem Produkt umgehen. Bewahren Sie es in einem belüfteten Raum auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kontaktinhibitionstest
<ol><li>Zubereitung von Agarplatten mit Knoblauchpulver<ol>
<li>Vorbereiten und Autoklav PDA Medium.</li>
		<li>Wiegen Sie die gewünschte Knoblauchpulvermenge mit einem sterilen Spachtel in ein 50 ml-Rohr, um Konzentrationen von 0,25 mg/ml bis 16 mg/ml zu erhalten.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml PDA hinzu, nachdem Sie die Temperatur des Mediums auf der Innenseite des Handgelenks überprüft haben. Die Temperatur muss so niedrig wie möglich sein, um den Abbau empfindlicher Moleküle zu verhindern. Idealerweise sollte diese Temperatur 45 °C betragen.</li>
		<li>Homogenisieren Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr auf den Kopf stellen, um das Pulver gleichmäßig in das PDA-Medium zu verteilen. Gießen Sie schnell 10 ml in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 5 cm(Abbildung 1, Tafel C).</li>
		<li>Mit der Petrischale bei Raumtemperatur platziert, warten, bis der Agar erstarrt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Agarplatten mit ätherischem Öl oder Carbendazim<ol>
<li>10 ml PDA in ein 50 ml Rohr einführen. Überprüfen Sie die Temperatur wie für Abschnitt 4.1.3.</li>
		<li>Fügen Sie 100 l der verschiedenen Lösungen von Thymus vulgaris ätherischem Öl in PDA hinzu, um 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% und 0,2% Lösungen zu erhalten (siehe Abschnitt 3.2.1).</li>
		<li>Fügen Sie das erforderliche Volumen von Carbendazim aus der 200 mg/L-Lösung hinzu, um Lösungen von 0,0625-2 mg/L zu erhalten (siehe Abschnitt 3.3.1).</li>
		<li>Homogenisieren Sie sorgfältig, indem Sie das Rohr auf den Kopf stellen, gießen Sie schnell 10 ml in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 5 cm(Abbildung 1, Tafel C).</li>
		<li>Mit der Petrischale bei Raumtemperatur platziert, warten, bis der Agar erstarrt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kontakthemmungstest (Abbildung 1)<ol>
<li>Mit einem sterilen Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von 5 mm zeichnen Sie einen Kreis in der Mitte von Petrischalen, die entweder PDA oder PDA einschließlich antimykotischer Verbindungen enthalten. Entsorgen Sie den Agarzylinder mit einem sterilen Zahnstocher (Panel C).</li>
		<li>Mit einem sterilen Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von 5 mm kreist das Plot zufällig in die Pilzplatten aus Abschnitt 2. Plotten Sie zwischen 15-20 Kreisen pro Platte (Panel B).</li>
		<li>Ziehen Sie die von Sporen, frühen Hyphen oder Myzel bedeckten Agar-Zylinder vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher ab und legen Sie die Stecker in den leeren Raum von Petri-Gerichten, die entweder PDA oder PDA mit antimykotischen Verbindungen (Panel C) enthalten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platten mit Sporen für 48 h bei 30 °C, 31 h für die Platten mit frühem Hyphen und 24 h für die mit Myzel bedeckten Platten (Tafel C).</li>
		<li>Messen Sie den Durchmesser des radialen Wachstums und berechnen Sie den Prozentsatz der Pilzwachstumshemmung über die Kontrolle mit der Formel (Panel D) % Pilzwachstumshemmung = (C - A/C)* 100 wobei C der Durchmesser des radialen Wachstums in PDA medium und A der Durchmesser des radialen Wachstums in PDA-Medium ist, das die antimykotischen Verbindungen enthält. ANMERKUNG: Um die antimykotische Aktivität zu vergleichen, die nach myzelischem Plug-Transfer und Myzelscheibentransfer gemessen wurde, mit steriler Pinzette, eine Scheibe mit einem Durchmesser von 5 mm, die zuvor auf die Oberfläche der Pilzplatten (Abschnitt 2 Hinweis) in der Mitte von Petrischalen mit PDA oder PDA mit Antimykotika abgelagert wurde, und genau wie bei der Agar-Plug-Übertragung vorzugehen</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vapor-Phase Inhibitionstest
<ol><li>Zubereitung von Agarplatten mit Knoblauchpulver<ol>
<li>Fahren Sie wie in Abschnitt 3.1 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Agarplatten mit ätherischem Öl oder Carbendazim<ol>
<li>Fahren Sie wie in Abschnitt 3.2 und 3.3 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Pilzplatten<ol>
<li>Fahren Sie wie in Abschnitt 2 fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dampfphasen-Antimykotika-Hemmungstest (Abbildung 1)<ol>
<li>Gießen Sie 10 ml PDA-Medium in den Deckel der Petrischalen mit einem Durchmesser von 5 cm, die entweder 10 ml PDA-Medium oder 10 ml PDA-Medium enthalten, das antimykotische Verbindungen enthält, in den Boden der Gerichte. Warten Sie, bis die vollständige Erstarrung des Agars bei Raumtemperatur (Panel C) abgeschlossen ist.</li>
		<li>Verwenden Sie ein 50 ml Zentrifugalrohr als Kalibrierwerkzeug, um einen Kreis von PDA in der Mitte des Deckels zu erhalten; den PDA um den Kreis herum mit einem sterilen Spachtel (Panel C) zu entfernen.</li>
		<li>Zeichnen Sie einen Kreis in der Mitte des PDA-Mediums in den Deckel mit einem 5 mm Durchmesser sterilen Edelstahlrohr platziert. Entsorgen Sie den Agar-Zylinder mit einem sterilen Zahnstocher (Panel C).</li>
		<li>Formstecker mit einem sterilen Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von 5 mm nach dem Zufallsprinzip in die Pilzplatten wie in Abschnitt 4.3.2 (Tafel B).</li>
		<li>Übertragen Sie die stecker, die entweder mit Sporen, frühem Hyphen oder Myzel von Pilzplatten bedeckt sind, vorsichtig in die Deckel der Assayplatten (Panel C).</li>
		<li>Bei 30 °C wie in Abschnitt 4.3.4 (Panel C) inkubieren.</li>
		<li>Messen Sie den Durchmesser des radialen Wachstums und berechnen Sie den Prozentsatz der Pilzwachstumshemmung mit der Formel in Abschnitt 4.3.5 (Panel D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht die Bewertung der antimykotischen Eigenschaften von minimal verarbeiteten pflanzlichen Produkten. In diesem Protokoll wird eine homogene Verteilung der Sporen auf der Agaroberfläche mit 2 mm Glasperlen erreicht. Dieser Schritt erfordert Handhabung fähigkeiten, um richtig die Perlen zu verteilen und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, letztlich ermöglicht den Vergleich von antimykotischen Wirkungen in verschiedenen Stadien des Pilzwachstums. Wir fanden heraus, dass 5 mm Glasperl...

Globale Verluste von Obst und Gemüse können bis zu 50% der Produktion1 erreichen und resultieren vor allem durch Lebensmittelzerfall durch Pilzverderb auf dem Feld oder während der Lagerung nach der Ernte2,3, trotz der umfangreichen Beschäftigung von synthetischen Fungiziden seit der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts4. Die Verwendung dieser Stoffe wird überdacht, da sie ernste Umwelt- und Gesundheitsgefahren darstellt. Da die schädlichen Folgen ihrer Verwendung in allen Ökosystemen auftauchen und sich Hinweise auf mögliche gesundheitliche Auswirkungen angesammelt haben5,6, werden neue Alternativen zu alten prophylaktischen Strategien für Behandlungen vor und nach der Ernte entwickelt7,8,9. Daher ist die Herausforderung, vor der wir stehen, zweifach. Neuartige fungizide Strategien müssen erstens das Niveau der Wirksamkeit des Lebensmittelschutzes gegen Phytopathogene aufrechterhalten und gleichzeitig dazu beitragen, den ökologischen Fußabdruck landwirtschaftlicher Praktiken drastisch zu verringern. Um dieses ehrgeizige Ziel zu erreichen, werden Strategien vorgeschlagen, die von den natürlichen Abwehrmaßnahmen inspiriert sind, die in Pflanzen entwickelt wurden, da mehr als 1000 Pflanzenarten für ihre antimikrobiellen Eigenschaften hervorgehoben wurden8. Zum Beispiel sind Pflanzen, die natürliche Fungizide zur Bekämpfung von Phytopathogenen entwickelt haben, eine neue Ressource bei der Erforschung der Entwicklung neuer Biokontrollprodukte2. Ätherische Öle sind Flaggschiff-Moleküle dieser Art. Zum Beispiel schützt Ätherisches Origanum Tomatenpflanzen vor grauer Schimmelin in den Gewächshäusern 10 und Solidago canadensis L. und Cassia ätherische Öle haben gezeigt, dass sie nachgeernteten Erdbeeren vor grauer Schimmelbildung bewahren11,12. Diese Beispiele veranschaulichen, dass Biokontrolle und insbesondere pflanzliche Produkte eine Lösung darstellen, die biologische Wirksamkeit und ökologische Nachhaltigkeit verbindet.
Pflanzen sind daher eine wichtige Ressource von Molekülen, die für die Pflanzenschutzindustrie von potenziellem Interesse sind. Es wurde jedoch nur eine Handvoll pflanzlicher Produkte vorgeschlagen, die als Biokontrollprodukte verwendet werden sollen, obwohl sie allgemein als sicher, nicht phytotoxisch und umweltfreundlich anerkannt sind2. Es wurden einige Schwierigkeiten bei der Umsetzung vom Labor auf das Feld beobachtet, wie z. B. die Wirksamkeit, die nach anwendung in vivo2,9abnimmt. Daher wird es wichtig, die Fähigkeit von Labortests zu verbessern, um die Feldwirksamkeit besser vorherzusagen. In diesem Zusammenhang sind antimykotische Prüfmethoden für pflanzliche Produkte sowohl zur Bewertung ihrer antimykotischen Wirksamkeit als auch zur Definition ihrer optimalen Einsatzbedingungen erforderlich. Insbesondere sind Biokontrollprodukte im Allgemeinen weniger effizient als chemische Fungizide, daher ist ein besseres Verständnis ihrer Wirkungsweise wichtig, um geeignete Formulierungen vorzuschlagen, die Art der Anwendung in Bereichen zu ermitteln und zu definieren, welches Entwicklungsstadium des Erregers anfällig für das Gegenprodukt ist.
Zu den aktuellen Ansätzen, die sich mit antibakteriellen und antimykotischen Aktivitäten befassen, gehören Diffusionsmethoden wie Agar-Disk-Diffusion, Verdünnung, Bioautographie und Durchflusszytometrie.13. Die meisten dieser Techniken, genauer gesagt, die Standard-Antimykotika-Anfälligkeitstests - Agar-Disk-Diffusion und Verdünnungstests - sind gut für die Bewertung der antimikrobiellen Aktivität von löslichen Verbindungen auf bakteriellen und Pilzsporen in flüssigen Suspensionen geeignet.14. Diese Methoden eignen sich jedoch im Allgemeinen nicht zur Prüfung fester Verbindungen wie getrocknetes Pflanzenpulver oder zur Quantifizierung der antimykotischen Aktivität während des Myzelwachstums, da sie eine Sporenverdünnung oder Sporenausbreitung auf Agarplatten und/oder Verdünnung von Antimykotika erfordern.13. Bei der lebensmittelvergifteten Methode werden Agarplatten, die das Antimykotika enthalten, mit einer Scheibe mit einem Durchmesser von 5-7 mm aus einer 7-Tage alten Pilzkultur geimpft, ohne die genaue Menge des beginnenden Myzels zu berücksichtigen. Nach der Inkubation wird die antimykotische Aktivität als Prozent der radialen Wachstumshemmung bestimmt17,18,19. Mit diesem Ansatz können wir die antimykotische Aktivität auf mycelial Wachstum bewerten. Im Gegensatz dazu wird das Agar-Verdünnungsverfahren durchgeführt, um die antimykotische Aktivität auf Sporen zu bestimmen, die direkt auf der Oberfläche der Agarplatte geimpft werden, die die antimykotischen Verbindungen enthält.13,20,21. Diese beiden Ansätze liefern ergänzende Ergebnisse zur antimykotischen Aktivität. Dies sind jedoch zwei unabhängige Techniken, die parallel verwendet werden und keinen genauen Vergleich der relativen Wirksamkeit von Antimykotika auf Sporen und Myzel ermöglichen.17,20,22 da sich die Menge des Beginnenden Pilzmaterials in den beiden Ansätzen unterscheidet. Darüber hinaus resultiert die antimykotische Aktivität eines pflanzlichen Produkts oft aus der Kombination von antimykotischen Molekülen, die von Pflanzen synthetisiert werden, um Krankheitserregern zu begegnen. Diese Moleküle umfassen Proteine, Peptide23,24, und Metaboliten mit großer chemischer Vielfalt und Zugehörigkeit zu verschiedenen Klassen von Molekülen wie Polyphenole, Terpene, Alcalo-ds25, Glucosinolate8, und Organosulfur Verbindungen26. Einige dieser Moleküle sind flüchtig oder werden während des Erregerangriffs flüchtig27. Bei diesen Wirkstoffen handelt es sich meist um schlecht wasserlösliche und hochdampfbelastete Verbindungen, die durch Wasserdestillation als ätherische Öle zurückgewonnen werden müssen.28. Vapor-Phase vermittelte Anfälligkeits-Assays wurden entwickelt, um die antimikrobielle Aktivität flüchtiger Verbindungen nach Verdampfung und Migration über die Dampfphase zu messen29. Diese Methoden basieren auf der Einführung antimykotischer Verbindungen in einer Entfernung von der mikrobiellen29,30,31,32,33. Im häufig verwendeten Dampfphasen-Agar-Assay werden ätherische Öle auf einer Papierscheibe abgelagert und in der Mitte der Abdeckung der Petrischale in der Entfernung von der bakteriellen oder Pilzsporensuspension platziert, die auf Agarmedium verteilt wird. Der Durchmesser der Wachstumshemmungszone wird dann auf die gleiche Weise gemessen wie bei der Agar-Disk-Diffusionsmethode20,24. Es wurden weitere Ansätze entwickelt, um die quantitative Messung der Antimykotika-Empfindlichkeit von ätherischen Ölen in der Dampfphase zu ermöglichen, die aus der Brüroth-Verdünnungsmethode abgeleitet wurde, aus der eine hemmende, dampfphasenvermittelte antimikrobielle Aktivität berechnet wurde.32, oder abgeleitet von Agar-Disk Diffusions-Assays31. Diese Methoden sind im Allgemeinen spezifisch für Dampfphasenaktivitätsstudien und nicht geeignet für Kontaktinhibitionstests. Dies schließt die Bestimmung des relativen Beitrags flüchtiger und nichtflüchtiger Wirkstoffe zur antimykotischen Aktivität eines komplexen bioaktiven Gemischs aus.
Die von uns entwickelte quantitative Methode zielt darauf ab, die antimykotische Wirkung von getrocknetem Pflanzenpulver auf kontrollierte Sporenmengen und angebautes Myzel, das auf der Oberfläche eines Agarmediums abgelagert wird, zu messen, um das Luftwachstum von Phytopathogenen während der Infektion der Pflanzen15 sowie eines miteinander verbundenen Myzelnetzes16zu reproduzieren. Der Ansatz ist ein modifiziertes Versuchsgebild, das auf den Agar-Verdünnungs- und Lebensmittel-vergifteten Methoden basiert, die auch im gleichen Versuchsaufbau eine nebeneinander-bezogene Quantifizierung des Beitrags sowohl flüchtiger als auch nichtflüchtiger antimykogaler Metaboliten ermöglicht. In dieser Studie wurde die Methode mit der Aktivität von drei gut charakterisierten Antimykotika gemessen.

<table><tbody><tr><td>Autoklav-Vakuumklaven 24B+</td><td>Melag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbendazim</td><td>Sigma </td><td>378674-100G</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Falcons Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>547254</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Edelstahlrohr mit fünf Millimetern Durchmesser</td><td>Einzelhandelsgeschäft</td><td></td><td>/</td></tr><tr><td>Dörrautomat</td><td>Sancusto</td><td></td><td>sechs Tabletts</td></tr><tr><td>Knoblauchpulver</td><td>Bioladen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>CLOUP</td><td>65020&lt;</td><td>img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png"/&gt; 2 mm</td></tr><tr><td>Hämozytometer Zellzählung</td><td>Jeulin</td><td>713442</td><td>/</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td>  UM400</td><td>30 &gt; C</td></tr><tr><td>Messermühle</td><td>Bosch</td><td>TSM6A013B</td><td></td></tr><tr><td>Manueller Zellzähler</td><td>Labbox</td><td>HCNT-001-001/</td><td></td></tr><tr><td>Messlineal</td><td>Einzelhandelsgeschäft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiologische Sicherheitswerkbänke</td><td>FASTER</td><td></td><td>FASTER BHA36, TYP II, Cat 2</td></tr><tr><td>Mikropipette</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014407</td><td>100 - 1000 µ L</td></tr><tr><td>Mikropipette</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014411</td><td>20 - 200 &amp;Mikro; L</td></tr><tr><td>Mikropipette</td><td>Mettler-Toledo</td><td>17014412</td><td>2 - 20 &amp; Mikro; L</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Sarstedt</td><td>82-1194500</td><td><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/61798/61798eq1.png"> 55 mm</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Sarstedt</td><td>82-1473 </td><td><img alt="Gleichung 1" src="/Dateien/ftp_upload/61798/61798eq1.png"> 90 mm</td></tr><tr><td>Pipettensteuerung-EASY 60</td><td>Labbox</td><td>EASY-P60-001</td><td>/</td></tr><tr><td>Kartoffel-Dextrose-Agar</td><td>Sigma </td><td>70139-500G</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionswaage-RADWAG</td><td>Grosseron</td><td>B126698</td><td>AS220. R2-ML 220 g / 0,1 mg / nbsp;</td></tr><tr><td>Rake</td><td>Sarstedt</td><td>86-1569001</td><td>/</td></tr><tr><td>Rückmikroskop AE31E Trinokular</td><td>Grosseron</td><td>M097917</td><td>/</td></tr><tr><td>Sterile Graduiertpipette</td><td>Sarstedt</td><td>1254001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Thymus ätherisches Öl</td><td>Drogerie</td><td></td><td>Ätherisches Öl 100%</td></tr><tr><td>Spitzen 1000 µ L </td><td>Sarstedt</td><td>70.762010</td><td></td></tr><tr><td>Spitzen 20 &amp; Mikro; L </td><td>Sarstedt</td><td>70.760012</td><td></td></tr><tr><td>Spitzen 200 &amp; Mikro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.760002</td><td></td></tr><tr><td>Zahnstocher</td><td>Einzelhandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma spp Stamm</td><td></td><td></td><td>von LRPIA Labor</td></tr><tr><td>Tween-20 </td><td>Sigma </td><td>P1379-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma </td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Labbox</td><td>FORS-001-002</td><td>/</td></tr></tbody></table>

messung der flüchtigen und nichtflüchtigen antimykotika-aktivität von biocontrol-produkten

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

Das beschriebene Protokoll basiert auf einer Plug-Transfer-Technik, die eine genaue Bestimmung der Mikroorganismenmengen und deren Entwicklungsstadien ermöglicht. Eine bestimmte Anzahl von Sporen wird auf einer Agarplatte verteilt. Diese Agarplatte wird für einen definierten Zeitraum inkubiert, damit die Pilze das erwartete Entwicklungsstadium erreichen können, mit Ausnahme von Sporen, bei denen keine Inkubation erforderlich ist. Agar-Stecker, die von Sporen, Hyphen oder Myzel bedeckt sind, werden als nächstes zurückgezogen und auf Agar-Medien übertragen, die die antimykotische Verbindung enthalten, die entweder in einem Abstand von den Pilzen oder in Kontakt gebracht werden soll. Dieses Verfahren ist sowohl für die Prüfung von flüssigen Extrakten als auch für feste Proben (Pulver) anwendbar. Es eignet sich besonders gut zur Quantifizierung der relativen Beiträge flüchtiger und nichtflüchtiger Wirkstoffe in bioaktiven Mischungen und zur Bestimmung ihrer Auswirkungen, insbesondere auf Sporen, frühe Hyphen und Myzel.
Das Verfahren ist für die Charakterisierung der antimykotischen Aktivität von Biokontrollprodukten, insbesondere pflanzlichen Produkten, von großer Bedeutung. Für die Pflanzenbehandlung können die Ergebnisse tatsächlich verwendet werden, um die Wahl der Art der Anwendung zu steuern und die Auslöseschwellen festzulegen.

Um die Fähigkeit der quantitativen Methode zu bewerten, die Wirkungsweise verschiedener Arten von Antimykotika zu unterscheiden, haben wir die Wirksamkeit von drei bekannten Antimykotika verglichen. Carbendazim ist ein nichtflüchtiges synthetisches Fungizid, das weit verbreitet ist, um eine breite Palette von Pilzerkrankungen in Pflanzen zu kontrollieren39,40. Thymus vulgaris ätherisches Öl wurde weitgehend für seine antibakterielle und antimykotische Ak...

Wir beschreiben eine modifizierte Agar-basierte Methode zur Quantifizierung der antimykotischen Wirkung pflanzlicher Produkte. Sowohl flüchtige als auch nichtflüchtige Beiträge zur Antimykotika-Aktivität können durch dieses Protokoll bewertet werden. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit gegen Pilze in wichtigen Entwicklungsstadien in einem einzigen Versuchsaufbau gemessen werden.

Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zum genauen Vergleich der relativen Wirksamkeit von flüchtigen und nichtflüchtigen antimykotischen Verbindungen in verschiedenen Wachstumsstadien von Pilzen. Diese Methode eignet sich gut zur Bewertung der antimykotischen Aktivität von pflanzlichen Produkten, die in getrockneter oder flüssiger Form verwendet werden und eine große Vielfalt an Molekülen enthalten. Diese Methode kann wertvolle Informationen über die Anwendungsweise von pflanzlichen Produkten liefern und eignet sich besonders gut im Bereich der biologischen Schädlingsbekämpfung.Das Verfahren wird von Valentina Gligorijevic, einer technischen Assistentin des Sup'Biotech-Labors, vorgeführt. Für die Entnahme von Konidien schichten Sie drei Milliliter 0,05 %Tween 20 auf eine Trichoderma-Myzelkultur und verwenden Sie einen Rechen, um die Konidien von den Konidiophoren zu lösen, wobei Sie darauf achten, dass Sie nicht auf das Myzel drücken, um zu verhindern, dass die Hyphen weggerissen werden. Wenn alle Konidien freigesetzt wurden, verwenden Sie eine Mikropipette, um sie schnell zu erholen, und geben Sie die Konidienlösung zur Zählung in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Um Pilzplatten vorzubereiten, geben Sie 100 Mikroliter Sporen in einer Konzentration von dreimal 10 bis sechs Sporen pro Milliliter auf eine neun Zentimeter große Petrischale, die PDA-Medium enthält, und geben Sie mit einem sterilen Spatel 10 Gramm Glasperlen mit einem Durchmesser von zwei Millimetern auf die Platte. Schütteln Sie dann die Platte vorsichtig nach vorne und hinten und drehen und drehen Sie die Platte in 90-Grad-Segmenten, bis sie vollständig gedreht ist, um die Sporen gleichmäßig über die Oberfläche des Agars zu verteilen. Dann inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius bis zur Analyse der Wachstumshemmung.Um einen Kontakt-Inhibitions-Assay mit Knoblauchpulver durchzuführen, verwenden Sie einen sterilen Spatel, um die gewünschte Knoblauchpulvermenge in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen zu wiegen. Um Konzentrationen zu erhalten, die im Allgemeinen zwischen 0,25 und 16 Milligramm pro Milliliter liegen. Geben Sie 10 Milliliter PDA mit etwa 45 Grad Celsius in jedes Röhrchen und drehen Sie jedes Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um das Pulver gleichmäßig im Agar zu verteilen.Gießen Sie die homogenisierten Suspensionen schnell in Petrischalen mit einem Durchmesser von fünf Zentimetern und lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur erstarren. Um einen Kontakt-Inhibitions-Assay durchzuführen, verwenden Sie ein steriles Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, um einen Kreis in der Mitte des Agars in den mit Kontroll- und antimykotischen Verbindungen behandelten Schalen zu zeichnen, und verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um die Agarzylinder zu entsorgen. Verwenden Sie als Nächstes ein neues Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, um 15 bis 20 Kreise nach dem Zufallsprinzip in die Pilzplatten zu plotten, und verwenden Sie sterile Zahnstocher, um die mit Sporen, Hyphen oder Myzel bedeckten Zylinder vorsichtig in die leeren Bereiche der PDA-Platten zu übertragen.Geben Sie die Platten dann wieder in den 30 Grad Celsius heißen Inkubator. Um eine Platte für einen antimykotischen Inhibitionsassay in der Dampfphase vorzubereiten, gießen Sie 10 Milliliter PDA-Medium in den Deckel einer Petrischale mit einem Durchmesser von fünf Zentimetern, die 10 Milliliter PDA-Medium enthält, das antimykotische Verbindungen oder PDA-Medium enthält, und lassen Sie den Agar bei Raumtemperatur erstarren. Machen Sie mit einem 50-Milliliter-Zentrifröhrchen als Kalibrierwerkzeug einen PDA-Kreis in der Mitte des Agars und verwenden Sie einen sterilen Spatel, um den Agar um den Kreis herum zu entfernen.Verwenden Sie ein steriles Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, um einen Kreis in der Mitte des Mediums im Deckel zu zeichnen, und verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um den Schneckenzylinder zu entsorgen. Verwenden Sie dann ein steriles Edelstahlrohr mit einem Durchmesser von fünf Millimetern, um nach dem Zufallsprinzip Pfropfen in die vorbereiteten Pilzplatten zu setzen, und verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um mit Sporen, Hyphen oder Myzel beschichtete Pfropfen vorsichtig in die Deckel der Assay-Platten zu übertragen. In dieser Analyse wurde die Wachstumshemmung der Trichoderma-Spezies SBT 10-2018, die durch drei antimykotische Verbindungen ausgelöst wurde, unter Verwendung von Kontakt- und Dampfphasen-Inhibitionsassays untersucht, wie für jedes Pilzstadium gezeigt.Eine höhere Sporenempfindlichkeit gegenüber Carbendazim wurde im Vergleich zu frühen Hyphen und Myzelnetzwerken beobachtet, wenn Trichoderma und Antimykotika in Kontakt kamen. Im Gegensatz dazu hatte Carbendozim keine antimykotische Wirkung auf die Trichoderma, wenn der Pilz entsprechend der geringen Flüchtigkeit dieser Substanz in einem Abstand zum Fungizid platziert wurde. Wenn ätherisches Thymus vulgaris-Öl als antimykotische Verbindung verwendet wurde, wurde eine höhere Empfindlichkeit für Sporen und frühe Hyphen im Vergleich zur Hemmung des Myzelwachstums bei 0,025% ätherischem Öl beobachtet.Wie erwartet, zeigte das ätherische Öl des Thymus vulgaris unabhängig von der Entfernung zwischen dem Pilz und dem Öl eine identische antimykotische Wirkung. Bei der Verwendung von Knoblauchpulver wurde eine höhere Wirksamkeit gegen die Sporenkeimung und die frühe Hyphenverlängerung beobachtet als bei Mycelliumwachstum. Bei der Vorbereitung der Pilzplatte muss besonders darauf geachtet werden, dass die Sporen gleichmäßig auf der Oberfläche der Agarplatte verteilt sind, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen.

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Forschung

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.

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Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung quantitativer Daten über die antimykotische Aktivität von Peptiden und anderen Verbindungen, wie z. B. niedermolekularen Antimykotika, gegen Candida albicans. Die Verwendung der optischen Dichte anstelle der Zählung koloniebildender Einheiten zur Quantifizierung der Wachstumshemmung spart Zeit und Ressourcen.

Quantifizierung der antimykotischen Aktivität von Peptiden gegen Candida albicans

Wir beschreiben den Einsatz der Dünnschichtchromatographie, des direkten Bioautographie-Assays und der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie zur Identifizierung von mikrobiellen Naturstoffen, die einen Antagonismus gegenüber pilzlichen Krankheitserregern aufweisen, wobei der Erreger Sclerotinia sclerotiorum und biopestizide Bacillus-Isolate als Modellsystem verwendet werden.

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Das Ziel dieses Protokolls ist die Quantifizierung der Violaceinproduktion durch Chromobacterium violaceum ATCC 12472 als Proxy für die Beurteilung der Quorum-Sensing-Hemmung durch bioaktive Verbindungen.

Quantifizierung von Violacein in Chromobacterium violaceum und seine Hemmung durch bioaktive Verbindungen

Erfahren Sie die Plug-Transfer-Technik zur Bewertung antimykotischer Aktivität flüchtiger und nichtflüchtiger Verbindungen an verschiedenen Pilzentwicklungsstadien. Diese Methode ermöglicht präzise Vergleiche für Biocontrol-Produkte.

Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten

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