Co-translationale Insertion von Membranproteinen in vorgeformte Nanoscheiben

Das Protokoll ist hocheffizient und vielseitig einsetzbar. Es kann auf fast jedes Membranprotein angewendet werden, und der gesamte Produktionsprozess ist innerhalb eines Tages abgeschlossen. Die synthetisierten Membranproteine können bereits co-translational durch zugeführte Liganden stabilisiert werden.

Der Kontakt mit Detergenzien wird vollständig vermieden, und die Proteine fügen sich direkt in bereitgestellte und maßgeschneiderte Membranumgebungen ein und falten sich. Strukturelle Ansätze, funktionelle Charakterisierung und Antikörpergenerierung sind die Hauptanwendungsgebiete. Die Technik ist darüber hinaus unkompliziert bei der Analyse von Lipideinflüssen auf die Faltung und Funktion von Membranproteinen.

Am dritten Tag der Kultur beimpfen Sie 10 Liter steriles YPTG-Medium mit einer Temperatur von 37 Grad Celsius in einem 15-Liter-Rührkessel mit 100 Millilitern Vorkultur. Und kultivieren Sie die Bakterien bei 37 Grad Celsius mit 500 Umdrehungen pro Minute bei hoher Belüftung. Um übermäßiges Schäumen zu vermeiden, fügen Sie steriles Antischaummittel hinzu.

Wenn die Zellen die Mid-Log-Phase erreichen, geben Sie 300 Milliliter Ethanol in die Kultur und inkubieren Sie die Zellen bei 42 Grad Celsius mit 500 Umdrehungen pro Minute bei hoher Belüftung für weitere 45 Minuten. Am Ende der Inkubation ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie einen Spatel und eine Pipette, um die Zellen vollständig in 300 Millilitern S30A-Puffer zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Bakterien zweimal und waschen Sie das Pellet mit 300 Millilitern frischem S30A pro Waschgang.

Nach der zweiten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in einem 1,1 Volumen S30B-Puffer. Laden Sie die Suspension in eine vorgekühlte French-Press-Druckzelle und brechen Sie die Zellen einmal mit 1.000 Pfund pro Quadratzoll Messgerät auf. Um instabile Bestandteile zu entfernen und die mRNA aus den Ribosomen freizusetzen, stellen Sie das Lysat auf 0,4 molare Natriumchloride ein und inkubieren Sie die Probe 45 Minuten lang in einem 42 Grad Celsius heißen Wasserbad.

Um die Membrangerüstprotein-Nanodiscs zusammenzusetzen, mischen Sie die MSP1E3D1 Lösung mit der Lipidlösung und fügen Sie DPC bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % hinzu. Passen Sie die Reaktion auf das entsprechende Endvolumen gemäß der Tabelle an und inkubieren Sie die Reaktionen eine Stunde lang bei 21 Grad Celsius unter sanftem Rühren. Am Ende der Inkubation befeuchten Sie die Membran einer Dialysekassette mit Bandscheibenbildungspuffer und laden Sie die Montagemischung mit einer Spritze in die Kassette. Anschließend wird die Reaktion gegen drei Fünf-Liter-Volumina Scheibenbildungspuffer für 10 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren dialysiert, bevor das Gemisch in Scheibenformationspuffer-äquilibrierte Zentrifugalfiltereinheiten mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10 Kilodalton überführt wird.

Konzentrieren Sie dann die Reaktion durch Zentrifugation mit einem UV-Vis-Reader auf mindestens 300 Mikromolar, um die Konzentration zu messen. Um eine zellfreie Reaktion mit kontinuierlichem Austausch von drei Millilitern herzustellen, äquilibriert man die Membran einer Drei-Milliliter-Dialysekassette in 100 Millimolar Tris-Acetat. Und verwenden Sie eine Spritze, um das Reaktionsgemisch in die Kassette zu übertragen.

Entfernen Sie mit einer Spritze überschüssige Luft aus dem Fach des Reaktionsgemisches und setzen Sie die Kassette in die Dialysekammer ein. Füllen Sie die Kammer mit 60 Millilitern Futtermischung und setzen Sie den Deckel auf die Kammer. Nachdem Sie den Deckel fixiert haben, inkubieren Sie die Kammer 12 bis 16 Stunden lang bei 30 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute.

Um einen zellfreien Reaktionsaufbau mit 60 Mikrolitern Zellaustausch für das Magnesiumionen-Screening herzustellen, geben Sie 60 Mikroliter unseres frisch zubereiteten 3X Master Mix in die Reaktionsmischung und 825 Mikroliter in die Fütterungsmischung. Und füllen Sie die Futtermischung mit Wasser. Geben Sie nach dem Vortexen 825 Mikroliter Fütterungsmischung in jede der drei Vertiefungen einer 24-Well-Mikroplatte.

Schneiden Sie regenerierte Cellulose-Dialyseröhrchen mit einem Molekulargewicht von 10 bis 14 Kilodalton in etwa 25 x 20 Millimeter große Stücke und lagern Sie die Stücke in Wasser, das mit 0,05 % Natriumazid versetzt ist. Verwenden Sie vor dem Zusammenbau des zellfreien Behälters für den Minizellaustausch ein Taschentuch, um überschüssiges Wasser von den Dialysemembranen zu entfernen, und legen Sie ein Membranstück auf jeden Behälter. Befestigen Sie die Membranen mit einem Polytetrafluorethylenring und geben Sie den Minibehälter in eine Vertiefung mit der Futtermischung.

Geben Sie die hochmolekularen Komponenten, wie in der Tabelle angegeben, in das Reaktionsgemisch und mischen Sie durch Pipettieren. Geben Sie 60 Mikroliter Reaktionsgemisch in den Reaktionsbehälter und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden. Und wickeln Sie zwei acht x 10 Zentimeter große Blätter einer versiegelnden thermoplastischen Folie um die 24-Well-Platte.

Fixieren Sie den Deckel der Well-Platte mit Klebeband und platzieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute unter Rühren für 12 bis 16 Stunden. Am nächsten Morgen wird mit einer Pipettenspitze die Dialysemembran am zellfreien Minizellaustauschbehälter durchstochen und das Reaktionsgemisch aspiriert. Das Reaktionsgemisch in neue Zentrifugenröhrchen überführen und zentrifugieren, um Ausfällungen zu entfernen.

Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen. Hier wird ein repräsentativer Einfluss der Feinabstimmung von Reaktionsverbindungen auf die endgültige Ausbeute oder Qualität der synthetisierten Membranproteine gezeigt. In dieser Analyse war die Gesamtsynthese und Nanodisc-Solubilisierung des adrenergen T-beta-on-Rezeptors unter allen analysierten Membranzusammensetzungen ähnlich.

Im Gegensatz dazu wurde eine viel höhere Variation in der Qualität des synthetisierten G-Protein-gekoppelten Rezeptors festgestellt, wobei die geringste Aktivität bei den DMPC- und POPC-Lipiden und die höchste bei der Anwendung von DOPG und POPG beobachtet wurde. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Ladung der Lipidkopfgruppe sowie die Flexibilität der Fettsäurekette wichtige Modulatoren für die Faltung und Aktivität dieses Zellmembranproteins sind. Auch die endgültige Nanodisc-Konzentration kann ein wichtiger Faktor für die Qualität von Membranproteinen sein.

Wenn beispielsweise die Nanodisc-Konzentration in einem Bereich von 3,75 bis 60 Mikromolaren gescreent wird, wird eine vollständige Solubilisierung des G-Protein-gekoppelten Rezeptors bei etwa 30 Mikromolaren Nanodiscs erreicht, was ein Verhältnis von eins zu drei Membranprotein-Nanodiscs ergibt. Im Gegensatz dazu kann eine vollständige Solubilisierung von Proteorhodopsin mit etwa 10 Mikromolaren Nanodiscs erreicht werden, was ein Proteorhodopsin-Nanodisc-Verhältnis von 10 zu eins ergibt. Präzises Pipettieren und hochwertige Komponenten sind selbstverständlich Pflicht.

Kritische Schritte für die Lysatvorbereitung sind die Ernte der Zellen in der Mid-Log-Phase und die Anwendung der Stufe mit hohem Salzgehalt. Die Technik reduziert die Komplexität der Membranproteinsynthese drastisch. Bisher schwierige Targets werden effizient synthetisiert und ermöglichen so die Bearbeitung molekularer Strukturen bisher unerforschter pharmazeutisch relevanter Proteine.