Neutronenkristallographie Datenerhebung und -verarbeitung zur Modellierung von Wasserstoffatomen in Proteinstrukturen

Die Neutronenkristallographie ist eine strukturelle Technik zur Bestimmung der Positionen von Wasserstoffatomen in biologischen Makromolekülen. Neutronenstrukturen zeigen Protonierungszustände und Orientierungen von Wassermolekülen, um Reaktionsmechanismen und Bindungswechselwirkungen aufzuklären. Im Gegensatz zur Röntgenbeugung hat die Neutronenbeugung den Vorteil, dass es sich um eine zerstörungsfreie Technik handelt.

Proteine mit lichtempfindlichen Gruppen oder Metallosensoren können untersucht werden, ohne Strahlenschäden zu erleiden. Um die Neutronenproteinkristallographie durchzuführen, werden große zerbrechliche Proteinkristalle in Quarzkapillaren montiert, um Daten bei Raumtemperatur zu sammeln. Die Einbettung von Kristallkapillaren wird nicht routinemäßig durchgeführt, so dass die Demonstration dieser Technik lehrreich ist.

Öffnen Sie für die Kristallernte die versiegelte Sandwich-Box, die die Proteinkristalle in einer silikonisierten Glasplatte mit neun Well und großem Volumen enthält, und übertragen Sie mit einer Mikropipette 10 bis 20 Mikroliter aus der Kristallisationsreservoirlösung auf einen Objektträger. Bewerten Sie die Kristalle mit einem Mikroskop. Verwenden Sie eine Mikroschleife in geeigneter Größe, um einen Kristall zu entnehmen, und legen Sie den Kristall in den Tropfen der Reservoirlösung.

Nehmen Sie für die Kristallmontage eine Quarzkapillare mit einem Durchmesser von zwei Millimetern und einer Länge von 50 Millimetern, saugen Sie den Reservoirpuffer mit einer Pipette ab und füllen Sie ein Ende der Kapillare mit Reservoirpuffer. Verwenden Sie eine Befestigungsschlaufe, um den Kristall vorsichtig in den Reservoirpuffer innerhalb der Quarzkapillare zu platzieren. Klopfen Sie auf das Röhrchen, um den Reservoirpuffer und den Kristall in der Kapillare nach unten zu bewegen, und verwenden Sie eine lange, dünne Pipette, um die Lösung um den Kristall herum abzusaugen.

Trocknen Sie den Kristall vorsichtig mit einem dünnen Papierdocht und trocknen Sie die Kapillarwände und geben Sie 20 bis 50 Mikroliter deuterierte Pufferlösung bis zum Ende der Kapillare. Schmelzen Sie mit einem Heizstab einen Teil des Bienenwachses und führen Sie die Kapillare vorsichtig in das geschmolzene Bienenwachs ein, bis sich ein luftdichter Verschluss gebildet hat. Ersetzen Sie den deuterierten Puffer an den Tagen zwei, sechs und 10 nach der Kristallmontage durch 20 bis 50 Mikroliter frischen deuterierten Puffer und verschließen Sie die Kapillare nach jedem Dampfaustausch wieder mit frischem geschmolzenem Bienenwachs, wie gezeigt.

Nach mindestens zwei Wochen Dampfaustausch befestigen Sie die Quarzkapillare mit Kitt auf dem IMAGINE Neutronendiffraktometer-Goniometer-Probenstab, der am Probentisch des Instruments befestigt wurde, und senken Sie die Probe ab und stecken Sie in den Neutronenstrahl- und Detektorbereich. Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm auf dem Beamline-Steuercomputer und klicken Sie auf die Registerkarte Setup, um die Datenerfassungsstrategie einzurichten und die Experimentparameter einschließlich des Gerätenamens und der Namen der zu erfassenden Bilder einzugeben. Klicken Sie auf die Registerkarte "Sammeln" und geben Sie die Parameter für die Datenerfassung ein, einschließlich der Belichtungszeit und der Anzahl der zu erfassenden Bilder.

Klicken Sie in der grafischen Benutzeroberfläche der Optik auf 2,78 für das Lambda-Minimum und 4,5 für das Lambda-Maximum, um den Quasi-Bereich für die Datenerfassung festzulegen. Klicken Sie auf Scan starten, um die Datenerfassung zu starten. Sammeln Sie nach der Neutronendatenerfassung einen entsprechenden Röntgendatensatz auf demselben Kristall bei derselben Temperatur.

Vor der Kryo-Datenerfassung die Reservoirlösung aus der Sandwich-Box nehmen und die Sandwich-Box mit deuterierter Reservoir-Pufferlösung füllen, eine Woche lang äquilibrieren lassen und dreimal wiederholen. Nach drei weiteren Runden des Austauschs der Reservoirlösung ernten Sie den Kristall mit einer Mikroschleife und tauchen Sie den Kristall zwei Stunden lang in eine Kryoprotektivlösung, bevor Sie den Kristall in eine Mikroschleife montieren, die an einer Kryokristallhalterung befestigt ist. Tauchen Sie den montierten Kristall und die Kryo-Montierung in flüssigen Stickstoff.

Wenn der Kristall eingefroren ist, montieren Sie den Kristall auf dem makromolekularen Neutronendiffraktometer-Probentisch, der mit einem Kryostrom ausgestattet ist. Vergewissern Sie sich, dass der Kristall für die Datenerfassung bereitgestellt und zentriert ist, geben Sie die Angebotsinformationen ein, klicken Sie auf das Ordnersymbol, um die Tabelle mit der Datenerfassungsstrategie zu laden, und klicken Sie dann auf Senden, um die Datenerfassung zu starten. Gebeugte Neutronen werden in Echtzeit sichtbar, wenn sie von den MaNDi-Flugzeitdetektoren detektiert werden.

Für die gemeinsame Verfeinerung von Röntgen- und Neutronendaten öffnen Sie zunächst CCP4 und wählen Sie Konvertieren, um das MTZ-Programm zu ändern, um das MTZ-Programm so zu erweitern, dass die freien R-Datenflags der Neutronendaten mit denen der Röntgendaten übereinstimmen. Importieren Sie die Neutronendatenreflexionsdatei im MTZ-Format. Wählen Sie Freie R-Daten aus einer anderen MTZ-Datei importieren und importieren Sie die Röntgen-MTZ-Datei.

Benennen Sie die neue übereinstimmende MTZ-Datei und klicken Sie auf Ausführen. Öffnen Sie als Nächstes das Phoenix-Softwarepaket und klicken Sie unter Verfeinerung auf Ready Set. Laden Sie die Proteinkoordinatendatei hoch, wählen Sie aus, ob Wasserstoffatome zum Modell hinzugefügt werden sollen, wenn sie nicht vorhanden sind, und wählen Sie HD an austauschbaren Stellen, H an anderer Stelle aus dem Dropdown-Menü.

Wählen Sie Deuterium zu Lösungsmittelmolekülen hinzufügen und klicken Sie auf Ausführen, um zu beginnen. Um die Struktur zu verfeinern, öffnen Sie auf der Registerkarte "Verfeinerung" den Phönix. Refine-Programm, um die Verfeinerung sowohl unter Verwendung der Röntgen- als auch der Neutronendaten einzurichten.

Geben Sie auf der Registerkarte "Konfigurieren" die PDB-Datei aus der gelösten Röntgenstruktur ein. Laden Sie die MTZ-Datei aus den Neutronendaten hoch. Weisen Sie die MTZ-Dateidaten als Neutronendaten in neutron R free zu.

Laden Sie die MTZ-Datei aus den Röntgendaten hoch und weisen Sie sie als Röntgendaten und Röntgen-R frei zu. Vergewissern Sie sich, dass unter Verfeinerungseinstellungen die Standardverfeinerungsstrategie ausgewählt ist, und erhöhen Sie die Anzahl der Zyklen auf fünf. Wählen Sie alle Parameter, erweitert und Wasserstoffatome aus.

Ändern Sie das Wasserstoffraffinationsmodell auf individuell und schalten Sie die Kraft aus, die ADP fährt, und suchen Sie dann nach Kernkraft. Wählen Sie die nuklearen Entfernungen von X-HD verwenden. Klicken Sie auf Ausführen, um die Verfeinerung zu starten.

Um Modelle in Phoenix zu erstellen, klicken Sie auf In Coot öffnen. Visualisieren Sie in Coot die Karten der Röntgenelektronendichte und der Neutronenstreulängendichte. Wählen Sie den Display-Manager aus und löschen Sie die Neutronen-2FOFC-Dichtekarte für die Neutronenstreulänge.

Wählen Sie MTZ öffnen und dann MTZ öffnen aus, und öffnen Sie die MTZ-Datei mit den Neutronendaten. Wählen Sie sowohl für die Amplituden- als auch für die Phasenoptionen no_fill_neutron Daten aus den Dropdown-Menüs aus, um die Dichtekarten für die ungefüllte Neutronenstreulängen-Dichte zu öffnen. Führen Sie eine visuelle Inspektion der Rückstände durch, um festzustellen, ob das Modell an die Daten angepasst ist, und analysieren Sie die Peaks der Differenzdichtekarte von Wasserstoff-Deuterium-austauschbaren Stellen, um die richtige Ausrichtung und Belegung zu bestimmen.

Richten Sie die Wassermoleküle entsprechend den Neutronen-SLD-Karten und Wasserstoffbrückenwechselwirkungen neu aus. Passen Sie den Protonierungszustand und die Ausrichtung der austauschbaren Wasserstoff-Deuterium-Stellen des Proteinrests gemäß den Neutronen-SLD-Karten an. Führen Sie weitere Runden der interaktiven Modellerstellung und -verfeinerung durch, um eine vollständige Struktur zu erhalten.

Hydrierte Proteinkristalle, die in wasserbasiertem Puffer gezüchtet werden, messen etwa 1.000 x 900 Mikrometer. Die Kristalle können drei Wochen lang in Quarzkapillaren montiert werden, um einen Dampfaustausch mit Puffer auf Deuteriumoxidbasis zu ermöglichen, bevor Neutronenbeugungsdaten gesammelt werden. Neutronenbeugungsdaten wurden über mehrere Tage mit einer Auflösung von 2,30 Angström gesammelt, und es wurde ein Röntgenbeugungsdatensatz am selben Kristall gesammelt.

Peaks in FO minus FC Neutronenstreulängendichtekarten liefern wertvolle Informationen über die Orientierung von Resten wie z.B. Sparagin und positive Peaks in FO minus FC Neutronenstreulängendichtekarten sind auch sehr informativ bei der Bestimmung der Protonierungszustände von Resten mit titrierbaren Gruppen wie Histidin. Kartenüberlagerungen von Elektronen- und Neutronenstreulängendichtekarten für Wassermoleküle deuten darauf hin, dass Wasserstoffbrückenwechselwirkungen zwar aus Röntgendaten abgeleitet werden können, Neutronen jedoch klare Informationen über die Positionen dieser Wasserstoffbrückenbrücken liefern. Neutronenstreulängen-Dichte-Omit-Maps können verwendet werden, um die Orientierung der funktionellen Gruppen von Wasserstoff-Deuterium-Seitenketten zu bestimmen.

Neutronenstreulängen-Dichtekarten, in denen nicht austauschbare Wasserstoffatome an Kohlenstoff gebunden sind, erscheinen im Vergleich zu ihren Gegenstücken in Elektronendichtekarten aufgrund der Dichteauslöschung unvollständig. Es ist daher vorzuziehen, eine gemeinsame Verfeinerung einer Probe sowohl mit Röntgen- als auch mit Neutronendaten durchzuführen, wobei die Röntgendaten zur Bestimmung der Position des Proteinrückgrats verwendet werden können. Für die Kristallographie von Neutronenproteinen werden große Kristalle benötigt.

Bei der Handhabung und Montage von Kristallen ist Vorsicht geboten, um eine Beschädigung der Kristalle zu vermeiden, die leicht reißen und die Datenqualität beeinträchtigen können. Die Neutronenproteinkristallographie gibt Einblick in den Reaktionsmechanismus von Proteinen und deckt möglicherweise katalytisch relevante Rückstände oder Wassermoleküle auf, deren Rolle durch Kinetik, Mutagenese oder Spektroskopie weiter untersucht werden kann.