Profilierung flüchtiger Verbindungen in schwarzen Johannisbeerfrüchten mittels Headspace-Festphasen-Mikroextraktion gekoppelt an Gaschromatographie-Massenspektrometrie

Die Verbesserung des Fruchtaromas ist eines der Hauptziele in Zuchtprogrammen. Dafür benötigen wir eine zuverlässige Technik, mit der wir flüchtige Bestandteile in Früchten messen können. Diese Technik ist schnell und halbautomatisch, so dass bis zu 22 Proben pro Tag gemessen werden können.

Darüber hinaus ist es relativ billig und erfordert eine minimale Probenverarbeitung. Diese Methode kann leicht auf alle Obstarten angewendet werden, wie z.B. wirtschaftlich wichtige Beerenkulturen. Darüber hinaus kann die Bibliotheksgröße der erkannten Verbindung leicht erhöht werden.

Um zu beginnen, geben Sie einen Milliliter Natriumchloridlösung in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen, das die wade gefrorene Probe enthält. Schütteln Sie das Röhrchen, bis die Probe vollständig aufgetaut und homogenisiert ist. Dann bei 5.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Schneiden Sie das Ende der 1.000 Mikroliter Pipettenspitze ab und verwenden Sie sie, um sie in den Überstand auf die Natriumchlorid enthaltende Headspace-Datei zu übertragen. Fügen Sie jeder Probe, die eine Headspace-Datei enthält, fünf Mikroliter des internen Standards hinzu. Legen Sie die geschlossene Headspace-Datei in einem GC-MS-Auto-Sampler bei Raumtemperatur für einen automatisierten HS-SPME/GC-MS-Lauf ab und stellen Sie sicher, dass biologische Replikate nicht an aufeinanderfolgenden Positionen im Auto-Sampler platziert werden.

Die Headspace-Dateien für 10 Minuten bei 52 Grad Celsius mit 17-maliger Bewegung vorinkubieren G.Legen Sie ein SPME-Gerät in die Durchstechflasche ein, um die Faser dem Headspace auszusetzen, und führen Sie die VOC-Extraktion für 30 Minuten bei 50 Grad Celsius mit 17-facher Bewegung durch G.Führen Sie die Faser für eine Minute bei 250 Grad Celsius im Splitless-Modus zur flüchtigen Desorption in den Injektionsanschluss ein. Anschließend reinigen Sie die Faser in einer SPME-Reinigungsstation fünf Minuten lang bei 250 Grad Celsius mit Stickstoff. Analysieren Sie VOCs mit einem Gaschromatographen, der an ein Ionenfallen-Massenspektrometer gekoppelt ist, wie im Detects-Manuskript beschrieben.

Öffnen Sie rohe GC-MS-Profildateien. Um Verbindungen zu identifizieren, vergleichen Sie die Retentionszeiten, Massenspektren und kovats linearen Retentionsindizes mit Retentionsindizes, die aus authentischen Standards stammen. Kommentieren Sie für jeden kommerziellen Standard die Retentionszeit in der am häufigsten vorkommenden Masse, um Ionen aufzuladen.

Berechnen Sie dann die Peakfläche jeder VOC relativ zu der des internen Standards, um instrumentelle Variation und Intensitätsdrift zu minimieren. Zur Korrektur des Batch-Effekts normalisieren Sie den VOC-Peakbereich jeder Probe auf den entsprechenden Peakbereich in der Kontrollprobe, die im selben Durchlauf analysiert wurde.

Ein von HS-SPME/GC-MS erhaltenes, von HS-SPME/GC-MS erhaltenes volatiles Gesamtionenchromatogrammprofil der schwarzen Johannisbeerfrucht identifizierte 63 VOCs, die zu Estern, Aldehyden, Alkoholen, Ketonen, Terpenen und Furanen gehören, basierend auf einer Bibliothek, die entwickelt wurde, um Beerenfruchtarten zu profilieren. Einige der am häufigsten beobachteten Peaks entsprechen zwei Monoterpenen, Linalool und Terpineol, und zwei C6-Verbindungen, 2-Hexenal und 3-Hexenal. Massenspektren, die aus Schwarzstromprofilen in ihrem Vergleich mit Spektren reiner kommerzieller Standards erhalten wurden, werden für 2-Hexenal und Terpineol gezeigt.

PCA der VOC-Profile von vier verschiedenen Schwarzstromsorten zeigte, dass die Umgebung den flüchtigen Gehalt stark beeinflusst, da PC1 Proben basierend auf ihrem Standort trennt. Der effektive Genotyp kann mit PC2 beobachtet werden, da Ben Tirran deutlich von den übrigen Sorten getrennt ist. Der relative Gehalt an Linalool und 2-Hexenal in den vier bewerteten Schwarzstromsorten bestätigt, dass der Linaloolgehalt in Polen im Allgemeinen höher war als in Schottland, während 2-Hexenal den gegenteiligen Trend zeigte.

Der Anteil von Linalool war in Ben Tirran Sorten am höchsten, in dem von 2-Hexenal war am höchsten in Ben Tron Sorten. Es ist wichtig, mit gefrorenem Material zu beginnen, das zu einem feinen Pulver gemahlen wird, um eine ordnungsgemäße flüchtige Extraktion zu gewährleisten. Nach der Extraktion sollte die Probe so schnell wie möglich in den Auto-Probenehmer gegeben werden.

Diese Methode kann mit anderen metabolischen Plattformen kombiniert werden, um andere wichtige metabolische, für den Geschmack oder den Nährwert von Lebensmitteln zu identifizieren, um Sorten mit verbesserten organoleptischen Eigenschaften zu züchten.