Perlenladen von Proteinen und Nukleinsäuren in anhaftende menschliche Zellen

Die Perlenbeladung ist ein kostengünstiger Assay zum Laden von membran-, undurchlässigen Partikeln in lebende adhärente Zellen. Dieses Protokoll hat sich als äußerst nützlich erwiesen, um Sonden für Einzelzellen- oder Einzelmolekül- oder Fluoreszenzmikroskopieexperimente zu laden. Das Laden von Perlen ermöglicht es Forschern, schnell alle Arten von Molekülen zu laden, einschließlich Proteine, DNA, RNA, synthetische Partikel oder eine Kombination davon gleichzeitig in einzelne Zellen.

Bei der ersten Perlenbeladung ist es wichtig, die Abstichkraft zu testen. Zelllinien reagieren unterschiedlich auf das Laden von Perlen. Und so können Anzahl und Kraft der Wasserhähne für eine optimale Zellbelastung modifiziert werden, während die Zellfüllung minimiert wird.

Um das Verfahren zu demonstrieren, werden Matthew Saxton und ich von unseren Kollegen Dr. Amanda Cook und Gabriel Galindo begleitet. Beginnen Sie mit der Messung von etwa fünf Millilitern Glasperlen in einem konischen 50-Milliliter-Rohr. 25 Milliliter von zwei molaren Natriumhydroxid in das Röhrchen geben und zwei Stunden lang mit einem Shaker oder einem Rotor sanft mischen.

Drehen Sie das Perlenröhrchen kurz in einer Zentrifuge herunter, wenn die Perlen in Suspension sind, und dekantieren Sie dann das Natriumhydroxid, während So viele Perlen wie möglich erhalten bleiben. Waschen Sie die Perlen gründlich mit Zellkulturwasser, bis der pH-Wert neutral ist, und dekantieren Sie das Wasser jedes Mal. Verwenden Sie den pH-Teststreifen auf dem Abwasser, um einen neutralen pH-Wert zu bestätigen, und waschen Sie die Perlen dann zwei- bis dreimal gründlich mit 100% Ethanol.

Dekantieren des Ethanols jedes Mal. Trocknen Sie die Perlen und streuen Sie sie zu einer dünnen Schicht in einen sterilen Behälter. Lassen Sie den Behälter dann in einer Biosicherheitswerkbank offen, um die Perlen über Nacht an der Luft zu trocknen.

Klopfen oder schütteln Sie vorsichtig den Behälter und überprüfen Sie, ob die Perlen eine sandige Textur haben, ohne zu verklumpen oder abzublättern, um sicherzustellen, dass die Perlen vollständig trocken sind. Fügen Sie die Perlen der Vorrichtung hinzu und bedecken Sie die gesamte Öffnung der Perlenhaltekammer mit einem Polypropylengewebe oder einem gleichwertigen Material mit 105 Mikrometern Öffnungen, damit die Perlen durchgehen können. Klemmen Sie das Netz zwischen den männlichen und weiblichen Enden einer wiederverwendbaren Metall-Bildgebungskammer, verschließen Sie es dann fest mit dem wachsartigen Film und sterilisieren Sie das Gerät für 15 Minuten.

Mit dem Perlenladegerät können nun Hunderte von Belastungstests durchgeführt werden. Lagern Sie das Gerät in einem trockenen Behälter, der mit Kieselgel oder einem anderen Trockenmittel getrocknet ist, und verschließen Sie es. Wenn die Perlen abgeworfen werden, trocknen Sie gründlich ab und sterilisieren Sie den Perlenlader und ersetzen Sie ihn durch frische Perlen, wie bereits gezeigt.

Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und saugen Sie vorsichtig das gesamte Medium an den Rändern der Kammer an. Neigen Sie dann die Kammer in einem Winkel von etwa 45 Grad und entfernen Sie den verbleibenden Tropfen des Mediums in der mittleren Mikrobohrung. Pipetten Sie die Perlenladelösung vorsichtig auf die Glasmikrobohrung in der Mitte der Kammer.

Verwenden Sie die Perlenladevorrichtung, um eine Monoschicht aus Glasperlen vorsichtig auf den Zellen zu dispergieren. Stellen Sie sicher, dass die Perlen die Zellen vollständig bedecken. Kneifen Sie die Kammer mit zwei Fingern, heben Sie sie um zwei Zoll an und bringen Sie sie mit einer Kraft fest nach unten, die ungefähr dem Fallen der Schüssel aus dieser Höhe entspricht, fügen Sie das Medium vorsichtig wieder in die Kammer hinzu, indem Sie langsam auf die Kunststoffseite der Kammer pipettieren.

Saugen Sie alle schwimmenden Perlen an, ohne die Zellen zu stören, sollte der gesamte Perlenladevorgang relativ schnell durchgeführt werden. So trocknen die Zellen nicht aus, wenn sie ohne Medium sind. Anschließend werden die Zellen 4,5 bis zwei Stunden im Inkubator inkubiert.

Vor der Bildgebung waschen Sie die Zellen dreimal mit dem Medium, um Perlen und überschüssige Belastungskomponenten in der Ladelösung zu entfernen. Stellen Sie die Zellen sofort oder bei Bedarf des Experiments mit Anweisungen im Textmanuskript ab. Zellen, die erfolgreich per perlenbeladen waren, hatten fast immer Cy3-Pa57 und A488-H3K11ac die Proteine zusammen markiert.

Ein Mikrogramm Plasmid-DNA und kodierendes GFP und 0,5 Mikrogramm Cy3-markiertes Protein wurden ebenfalls über Perlenladung in die Zellen eingebracht, exprimiert und visualisiert. 40% der Zellen waren mit Fab-Protein beladen und 21% der perlenbeladenen Zellen exprimieren das kernbeladene Plasmid. Die mit Perlen beladenen Zellen exprimierten unterschiedliche Mengen an Plasmid.

Das Ergebnis dieses Fisher-Verhältnistests zeigte, dass, obwohl die Proteine eins und zwei ähnliche Intensitätsverteilungen aufwiesen, jedes Protein eine signifikant kleinere Verteilung als das Plasmid aufwies. Die Spiegel der mit Perlen beladenen Proteine hatten wenig Zell-zu-Zell-Varianz und die Spiegel von zwei gleichzeitig geladenen Proteinen waren stark miteinander korreliert. Die richtige Perlenbeladung hatte fast keinen merklichen Einfluss auf die Anzahl der menschlichen U2OS-Zellen oder ihre Morphologie, wenn sie direkt vor, direkt nach und 24 Stunden nach der Perlenbeladung abgebildet wurde.

Eine schlechte Perlenbeladung mit übermäßigen Perlen und Klopfkraft verursachte Zellverlust, schlechte Zellmorphologie und Cluster von Perlen, die auf dem Deckglas verblägen. obwohl angenommen wird, dass Zellen mechanische Schäden erleiden, während Perlenladezellen in der ordnungsgemäß perlenbeladenen Kammer wuchsen und sich vermehrten. Es wurde auch beobachtet, dass perlenbeladene Zellen einer Zellteilung unterzogen werden.

RPE1 und eine HeLa-Zelllinie wurden mit Fab beladen, um die Vielseitigkeit der Perlenladetechnik zu demonstrieren. U2OS-Zellen wurden auch mit einer Cy5-RNA 9-mer und Cy3-DNA 28-mer zusammen beladen. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, stellen Sie sicher, dass Sie den Zellen nur eine Monoschicht von Perlen hinzufügen, da zu viele Perlen dazu führen, dass sich die Zellen lösen.

So sind die Zellen nach einer kurzen 30-minütigen Erholung nach der Wulstaufnahme entweder sofort oder Stunden bis Tage später für die Bildgebung bereit, wenn das Verfahren weitere Schritte wie Färbung erfordert, die auch nach der Erholungsphase durchgeführt werden können.