Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-Bewertung der MicroRNA-Expression in Niere und Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung
29. April 2022
Wir stellen eine Methode zur Bewertung der microRNA-Expression in Niere und Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion vor.
Diese qRT-PCR-Methode kann Fragen im Zusammenhang mit der Erstellung von microRNA-Expressionsprofilen im Serum von Mäusen unter Bedingungen wie altersabhängiger Nierenfunktionsstörung beantworten. Die Technik ermöglicht den Nachweis der microRNA-Expression mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit durch einen einfachen Prozess, der Zeit spart und technische Fehler verhindert. Um zu beginnen, schneiden Sie die Haut des Bauches mit Pinzette und chirurgischer Schere.
Schneiden Sie die Muskeln in der Peritonealmembran von der Blase bis zum unteren linken Rand der Rippen. Heben Sie die Peritonealmembran mit einer Pinzette an und machen Sie einen seitlichen Schnitt am oberen Rand mit einer chirurgischen Schere. Setzen Sie den Schnitt entlang der untersten Kante der Rippen fort.
Identifizieren Sie die untere Hohlvene mit zwei PBS-befeuchteten Wattestäbchen. Führen Sie eine 30-G-Nadel, die an einer 1-Milliliter-Spritze befestigt ist, in die Vena cava inferior ein und ziehen Sie die Spritze. Ziehen Sie die Nadel langsam heraus, um Hämolyse zu vermeiden.
Übertragen Sie das Blut in ein 1-Milliliter-Spitzröhrchen mit Heparin und mischen Sie es durch Invertieren. Zentrifugieren Sie das Spitzrohr für 10 Minuten bei 3000 mal G bei Raumtemperatur. Den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
Nehmen Sie 200 Mikroliter Serumprobe und fügen Sie 1.000 Mikroliter Phenol / Guanidin-basiertes Lysereagenz hinzu. Wirbeln Sie die Mischung für 5 Sekunden und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform hinzu und mischen Sie, indem Sie die Tube 15 Mal umdrehen.
Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 3 Minuten, gefolgt von der Zentrifugation. Ohne das Pellet zu stören, wird der Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Fügen Sie 450 Mikroliter 100% Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Röhre für 5 Sekunden.
Laden Sie dann 700 Mikroliter der Probe auf eine membranverankerte Spinsäule und zentrifugieren Sie sie. Verwerfen Sie den Durchfluss und fügen Sie 700 Mikroliter Waschpuffer 1 hinzu, der im Kit enthalten ist. Zentrifugieren Sie erneut, und verwerfen Sie den Durchfluss.
Wiederholen Sie das Waschen mit 500 Mikrolitern Wash Buffer 2, um Spurensalze zu entfernen. Fügen Sie 500 Mikroliter 80% Ethanol hinzu, zentrifugieren Sie und entsorgen Sie den Durchfluss aus dem Sammelrohr. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule erneut und geben Sie die Säule in ein frisches 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen.
Dann fügen Sie 14 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu und inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Säule erneut für 1 Minute bei 15000 mal G bei Raumtemperatur. Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung vor und fügen Sie 8 Mikroliter pro Vertiefung in ein 8-Well-Streifenrohr hinzu.
Fügen Sie 12 Mikroliter der extrahierten Gesamt-RNA in jedes Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen für 15 Sekunden bei 2000 mal G bei Raumtemperatur. Legen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und starten Sie die Inkubation, um die cDNA zu synthetisieren. Nach der Inkubation wird die cDNA in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
Verdünnen Sie die cDNA zehnfach mit destilliertem Wasser. Dann Wirbel, gefolgt von Zentrifugation für 5 Sekunden bei 2000 mal G bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen die Master-Mix-Lösung wie im Textprotokoll beschrieben vor und wirbeln Sie die Lösung durch.
Fügen Sie 22,5 Mikroliter Aliquots in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu, gefolgt von 2,5 Mikrolitern cDNA. Versiegeln Sie die Platte mit einem Klebefilm und zentrifugieren Sie die Platte 30 Sekunden lang mit dem 1000-fachen G.Legen Sie die Platte in das real-time PCR-System. Ändern Sie die Einstellungen, indem Sie einen Namen für das Experiment angeben.
Wählen Sie dann 96-well 0,2 Milliliter als Experimenttyp, vergleichende CT als Quantifizierungsmethode, Standard als Systemlaufmodus und SYBR Green-Reagenzien als Reagenzien zum Nachweis der Zielsequenz. Geben Sie Namen für die Probe und die Ziel-miRNA in jeder Vertiefung an. Weisen Sie doppelte Proben zu, wählen Sie eine Referenzprobe und eine endogene Kontrolle aus, und wählen Sie keine für den Farbstoff aus, der als passive Referenz verwendet werden soll.
Um eine Reagenzkreuzkontamination zu eliminieren, richten Sie eine negative Reverse-Transkriptase und eine Nicht-Template-Kontrolle für die miRNA-Expression ein. Als nächstes stellen Sie sicher, dass das Reaktionsvolumen auf 20 Mikroliter eingestellt wird und die PCR-Zyklusbedingungen für 15 Minuten auf 95 Grad Celsius eingestellt werden, dann 40 Denaturierungszyklen bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, Glühen bei 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und Verlängerung bei 70 Grad Celsius für 30 Sekunden. Nachdem der Vorgang abgeschlossen ist, klicken Sie auf Analysieren, um die qRT-PCR-Daten zu analysieren.
Vergewissern Sie sich, dass die vom Programm automatisch ausgewählte Schwellenwertlinie für jede Vertiefung geeignet ist. Überprüfen Sie den Schwellenwert-Zykluswert der endogenen Kontroll- und Ziel-miRNAs, die in jeder Probe analysiert wurden. Bestimmen Sie die CT-Werte durch den Schnittpunkt der Verstärkungskurve und der Schwellenwertlinie.
miRNA qRT-PCR-Daten für das altersabhängige Modell der Nierenfunktionsstörung zeigten, dass im Vergleich zu SAMR1-Kontrollmäusen der Nierenspiegel von miRNA-7219-5p bei SAMP1-Versuchsmäusen signifikant anstieg, während der Nierenspiegel von miRNA-7218-5p abnahm. Die Expressionsniveaus von miRNA-223-3p änderten sich in keinem der beiden Stämme. Die Serumspiegel von miRNA-7219-5p und miRNA-7218-5p waren in den SAMP1-Mäusen erheblich erhöht, während die Spiegel von miRNA-223-3p unverändert blieben.
Sie sollten die Nadel in die Vena cava inferior einführen und Blut entnehmen, ohne in das Gefäß einzudringen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im microRNA-Expressionsprofil in Mäuseserum für eine Vielzahl von pathologischen Zuständen zu beantworten.
Übersicht
Diese Studie stellt eine quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) zur Bewertung der Mikro-RNA-Expression in Niere und Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung vor. Die Methode ermöglicht eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit bei der Detektion der Mikro-RNA-Expression und fördert damit die Forschung auf diesem Gebiet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- MicroRNA-Forschung
Hintergrund
- Mikro-RNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Genregulation.
- Alterabhängige Nierenfunktionseinschränkungen beeinflussen die Expression von Mikro-RNAs.
- Das Verständnis von Mikro-RNA-Profilen kann Einblicke in Nierenerkrankungen liefern.
- Die qRT-PCR ist eine weit verbreitete Methode zur Analyse der RNA-Expression.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Mikro-RNA-Expression bei Mäusen mit Nierenfunktionsstörung.
- Entwicklung einer zuverlässigen qEchtzeit-PCR-Methode für Serum- und Nierengewebeproben.
- Identifizierung spezifischer Mikro-RNAs, die mit altersbedingten Nierenveränderungen assoziiert sind.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Serum- und Nierenproben von Mäusen.
- Extraktion der gesamten RNA unter Verwendung eines Phenol/Guanidin-basierten Lysepuffers.
- cDNA-Synthese gefolgt von qRT-PCR zur Quantifizierung von Mikro-RNAs.
- Analyse der qRT-PCR-Daten zur Bestimmung der Expressionslevel der Ziel-Mikro-RNAs.
Hauptergebnisse
- Bei SAMP1-Mäusen stiegen die Nierenspiegel von miRNA-7219-5p signifikant an.
- Die Nierenspiegel von miRNA-7218-5p nahmen bei SAMP1-Mäusen ab.
- Die Serumspiegel von miRNA-7219-5p und miRNA-7218-5p waren deutlich erhöht.
- Die Spiegel von miRNA-223-3p blieben in beiden Stämmen unverändert.
Schlussfolgerungen
- Die qRT-PCR-Methode ermöglicht eine effektive Profilierung der Mikro-RNA-Expression bei Nierenfunktionsstörungen.
- Bestimmte Mikro-RNAs sind mit altersabhängigen Nierenveränderungen assoziiert.
- Diese Methode kann zur Untersuchung verschiedener pathologischer Zustände angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Eine präzise Profilierung der Mikro-RNA-Expression in Niere und Serum ermöglicht den frühen Nachweis altersabhängiger Mechanismen der Nierenfunktionsstörung und unterstützt die Zielvalidierung in präklinischen Modellen. Diese qRT-PCR-Methode liefert quantitative und reproduzierbare Daten, die das Vorhersagevertrauen in Biomarker-Entdeckungspipelines erhöhen. Sie schließt eine wichtige Lücke bei der Standardisierung der miRNA-Analyse für translationale Nierenforschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung der Expressionsänderungen von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p in Niere und Serum.
- Operationaler Wert: Bietet eine zuverlässige Methode zur Extraktion und Bewertung von miRNA aus murinen biologischen Proben und reduziert so die technische Variabilität.
- Strategischer Wert: Unterstützt die biologische Entlastung von Nierenzielen, indem er die Muster der miRNA-Dysregulation in Modellen altersabhängiger Funktionsstörungen aufklärt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative CT-Werte aus der qRT-PCR und ermöglicht so die standardisierte Messung der miRNA-Expression über verschiedene Probenarten hinweg.
- Operativer Wert: Etabliert einen reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Gewinnung von miRNA aus Serum und Niere, die cDNA-Synthese sowie die Amplifikation.
- Strategischer Wert: Erleichtert die Bereitschaft des Assays für Screening-Kampagnen, die auf miRNA-vermittelte Signalwege in Modellen renaler Erkrankungen abzielen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Klärt den Zusammenhang zwischen Nieren- und Serum-miRNA-Spiegeln und unterstützt die Übertragung von Biomarkern vom Gewebe auf Körperflüssigkeiten.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Überwachung von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p in präklinischen Modellen der Nierenfunktionsstörung.
- Strategischer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem mechanistische Einblicke in altersbedingte Nierenveränderungen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung zum Ziel bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere für Nierenfibrose und altersbedingte Signalwege.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch den Nachweis signifikanter Veränderungen der miRNA-Expression zwischen Kontroll- und beeinträchtigten Mausstämmen.
- Screening: Liefert reproduzierbare quantitative Ergebnisse (CT-Werte), die den Vergleich von miRNA-Spiegeln unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Wendet die comparative-CT-Methode mit endogenen Kontrollen zur Normalisierung der Expressionsdaten an, um zuverlässige Vergleiche zwischen Proben sicherzustellen.
- Translationale Forschung: Verknüpft Veränderungen der Nieren-miRNA mit nachweisbaren Serumveränderungen und unterstützt so die Entwicklung nicht-invasiver Biomarker.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten Protokollablauf zur miRNA-Quantifizierung, der in mehreren Modellen für Nierenerkrankungen wiederverwendet werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung durch präzise und empfindliche Detektion von miRNA-Expressionsänderungen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung zwischen Laboren, indem klare Schritte für die RNA-Extraktion und die qRT-PCR definiert werden.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem mechanistische Entwicklungsrisikodaten zu miRNA-vermittelten renalen Wegen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikobasierte Priorisierung von Targets auf Grundlage konsistenter miRNA-Dysregulation in präklinischen Modellen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit RNA, der reversen Transkription und der qRT-PCR-Technik.
- Setzt den Zugang zu Phenol/Guanidin-Lysereagenzien, Säulenchromatographie (Spin-Säulen) und Echtzeit-PCR-Systemen mit SYBR-Green-Nachweis voraus.
- Erfordert die Standardisierung endogener Kontrollen und Referenzproben über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg für die vergleichende CT-Analyse.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf verschiedene Mausstämme oder Probenvolumina angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit einer sorgfältigen Blutentnahme zur Vermeidung von Hämolyse sowie korrekter Inkubationszeiten während der Extraktion.
