Name: Analyse der Wechselwirkung fluoreszierend markierter Proteine mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Protein-Lipid-Wechselwirkungen mit quantitativer Durchflusszytometrie charakterisieren können. Diese Methode ermöglicht die Berechnung kinetischer und Gleichgewichtskonstanten für Grundlagenforschung.

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Die Autoren wurden durch ein Stipendium der Russian Science Foundation 20-74-00133 unterstützt.

1. Markierung fluoreszierender Proteine
<ol><li>Materialaufbereitung<ol>
<li>Bereiten Sie 1 M Natriumbicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,0 vor, lagern Sie ihn bei 4 °C und verwenden Sie ihn innerhalb einer Woche.</li>
		<li>Bereiten Sie 1,5 m Hydroxylaminhydrochloridpuffer, pH 8,5, unmittelbar vor Gebrauch vor.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 10 mg / ml Lösung mit Fluoreszenzfarbstoff (siehe Materialtabelle) in Dimethylsulfoxid vor. HINWEIS: Diese Lösung kann einen Monat lang bei -20 °C im Dunkeln gelagert werden.</li>
		<li>Bereiten Sie Lösungen von gereinigten Antikörpern oder anderen Proteinen bei 1-10 mg / ml vor. HINWEIS: Vermeiden Sie Puffer, die Ammoniumionen oder primäre Amine enthalten. Ersetzen Sie die Puffer, die Tris oder Glycerin enthalten, durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Dialyse. Weder Natriumazid (≤3 mM) noch Thimerosal (≤1 mM) beeinflussen die Konjugationsreaktion signifikant.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Gelfiltrationsmedium (siehe Materialtabelle) zur Proteinreinigung in PBS über Nacht bei Raumtemperatur oder für 2 h bei 60 °C. Tragen Sie das Gelfiltrationsmedium auf Spinsäulen mit 0,2 μm-Membranen auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie die Menge an reaktivem Farbstoff, die für jede Reaktion verwendet werden soll, entsprechend der Konzentration des zu markierenden Proteins unter Verwendung von Eq (1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq1v4.jpg"> wobeiV-Farbstoff das Volumen der Farbstoffmateriallösung ist; C pr, V pr und MWpr ist die Konzentration, das Volumen und das Molgewicht des Proteins; MW-Farbstoff ist das molare Gewicht des Farbstoffs; 100 ist ein Umrechnungsfaktor für Einheiten; MR ist das molare Verhältnis von Farbstoff zu Protein in der Reaktionsmischung. HINWEIS: Die folgenden MRs werden für IgG-Markierungsreaktionen empfohlen: MR = 40, wenn der Antikörper bei 1-3 mg/ml liegt oder MR = 30, wenn der Antikörper bei 4-10 mg/ml liegt. Für Gerinnungsfaktoren wird in der Regel MR = 5 verwendet.</li>
	<li>Konjugationsreaktion<ol>
<li>Mischen Sie in einem Reaktionsrohr die Proteinlösung mit einem 10x geringeren Volumen von 1 M Bicarbonatlösung.</li>
		<li>Die erforderliche Menge an fluoreszierendem Farbstoff (siehe Schritt 1.2) wird unter kontinuierlichem Rühren zugegeben.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für ca. 1 h, lichtgeschützt und unter kontinuierlichem Rühren.</li>
		<li>Für jeweils 200 μL Proteinlösung werden 5 μL 1,5 M Hydroxylaminhydrochlorid zugegeben.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur ca. 30 min lichtgeschützt und unter kontinuierlichem Rühren inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die Spinspalte vor.<ol>
<li>Geben Sie 500 μL Gelfiltrationsmedium zur Proteinreinigung zu einer Säule. Zentrifen Sie die Säule für 3 min bei 1.000 × g.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Puffer aus dem Auffangrohr. Wenn die Säule nicht voll ist, fügen Sie mehr Gelfiltrationsmedium hinzu und zentrifieren Sie die Säule für 3 Minuten bei 1.000 × g. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Spalte voll ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung<ol>
<li>Das Reaktionsgemisch (aus Schritt 1.3.5) wird 5 min lang bei 17.000 × g zentrifugiert und der Niederschlag entfernt.</li>
		<li>Überstand mit Gelfiltrationsmedium auf die Schleuderkolonne übertragen. Lassen Sie die Lösung in das Gelbett einziehen.</li>
		<li>Verwenden Sie ein leeres Auffangrohr für die Schleudersäule und zentrifen Sie es für 5 min bei 1.000 × g. Nach der Zentrifugation das markierte Protein aus dem Auffangröhrchen entnehmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestimmung des Kennzeichnungsgrades<ol>
<li>Korrekt für den Beitrag des Farbstoffs zur Absorption bei A 280 durch Messung der Absorption von freiem Farbstoff bei 280 nm (A280) und der λ max für den Farbstoff (Amax) (siehe Eq (2)). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq02.jpg">(2)</li>
		<li>Messen Sie die Absorption des Protein-Farbstoff-Konjugats bei 280 nm (A 280) und dem λ max für den Farbstoff (Amax) und berechnen Sie die Proteinkonzetration mit Eq (3). <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq3v2.jpg">(3) wobei εM der molare Extinktionskoeffizient des Proteins bei 280 nm ist; d ist die optische Weglänge während der Messung der Absorption; CF ist der Beitrag des Farbstoffs zur Absorption bei A280 (Schritt 1.6.1).</li>
		<li>Berechnen Sie den Grad der Beschriftung (DOL) mit Eq (4). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq4v2.jpg">(4) wobei ε M-Farbstoff der molare Extinktionskoeffizient des Farbstoffs bei λmax nm ist; d ist die optische Weglänge während der Messung der Absorption; C-Protein ist die Konzentration des Proteins (Schritt 1.6.2).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Herstellung von Phospholipid-Vesikeln
<ol><li>Aufbereitung und Speicherung der Lipidmischung<ol>
<li>Kombinieren Sie die Lipide im entsprechenden Verhältnis (Phosphatidylserin/Phosphatidylcholin im Verhältnis 20 Mol-% zu 80 Mol-%).</li>
		<li>Trocknen Sie die Lipidmischung nach der Lyophilisation oder Verdampfung und lagern Sie sie unter einer inerten Atmosphäre in Glasampullen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Lipidfolien<ol>
<li>Öffnen Sie die Ampulle und resuspendieren Sie die Lipidmischung in einer kleinen Menge (~ 100 μL) Chloroform. HINWEIS: Verwenden Sie nicht zu viel Chloroform, da es nicht vollständig verdunstet.</li>
		<li>DiIC16(3) in Ethanol bei 0,2 mol% zugeben. Die Lipidmischung in einen runden Bodenkolben geben. Verteilen Sie die Mischung dünn über die Seiten des Kolbens, indem Sie sie drehen. Trocknen Sie die Lipidmischung 30 min unter einem Argonstrom.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hydratation der Lipidmischung<ol>
<li>Einen entsprechend warmen (~55 °C) wässrigen Puffer (HEPES 20 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4) in einem der erwarteten Lipidkonzentration entsprechenden Volumen in den Kolben mit dem Lipidfilm geben. Inkubieren Sie die Mischung mit Vortexing bei 55 ° C für 30 min für eine vollständige Hydratation.</li>
		<li>Legen Sie das Probenröhrchen in einen Gefrierschrank oder warmen Thermostat, damit die Lipidsuspension 3-5 Frost-Tau-Zyklen durchläuft.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildung von Lipidvesikeln durch Extrusion<ol>
<li>Bereiten Sie den Extruder gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Alle Extruderkomponenten auf die Phasenübergangstemperatur des Lipidgemisches erwärmen.</li>
		<li>Füllen Sie eine der Extruderspritzen mit der hydratisierten Lipidmischung. Warten Sie 5-10 Minuten, bis sich die Temperatur der Lipidsuspension mit der Temperatur des Extruders ausgeglichen hat.</li>
		<li>Extrudieren Sie die Lipidmischung mindestens 10 Mal durch die Membran. Für die endgültige Extrusion legen Sie die Lipidsuspension in die alternative Spritze und achten Sie auf eine Veränderung des Aussehens von einer leicht nebulösen zu einer klaren Lösung.</li>
		<li>Lagern Sie die resultierende Mischung von Lipidvesikeln bei 4 °C, vorzugsweise in einer inerten Atmosphäre aus Argon oder Stickstoff, für 3-4 Tage. Nicht einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolierung von Blutplättchen aus Vollblut
<ol><li>Sammeln Sie Vollblut von gesunden Spendern in Tuben, die 3,2% Natriumcitrat enthalten.</li>
	<li>Prostaglandin E1 (PGE1) (1 μM) und Apyrase (0,1 U/ml) in das Blut geben, gefolgt von einer Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 100 × g für 8 min.</li>
	<li>Nach der Zentrifugation nehmen Sie das plättchenreiche Plasma und fügen Sie Natriumcitratlösung (106 mM, pH 5,5) zu einem Plasma/Citrat-Verhältnis von 3:1 hinzu. Das Plasma bei Raumtemperatur bei 400 × g für 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 300 μL Tyrodes Puffer ohne BSA (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mMMgCl 2, 0,4 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM Glukose, pH7,4). Reinigen Sie die Blutplättchen von Plasmaproteinen durch Gelchromatographie auf dem Gelfiltrationsmedium zur Thrombozytenreinigung (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>4. Nachweis von Protein-Lipid-Wechselwirkung durch Durchflusszytometrie
<ol><li>Kinetische Bindungsexperimente<ol>
<li>Verdünnte Phospholipidvesikel (ab Schritt 2.4.4) im Tyrode-Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0,4 mM NaH 2 PO 4, 2,5 mM CaCl2, 5 mMGlukose, 0,5% BSA, pH7,4) auf eine Konzentration von 1 μM und ein Gesamtvolumen von 250 μL.</li>
		<li>Fluoreszenzmarkierter Gerinnungsfaktor X (fX-fd) aus Schritt 1 bei einer Konzentration von 500 nM mit den Phospholipidvesikeln aus Schritt 4.1.1 im Verhältnis 1:1 (Endvesikelkonzentration 0,5 μM, fX-fd-Konzentration beträgt 250 nM fX) auf ein Gesamtvolumen von 500 μL mischen.</li>
		<li>Injizieren Sie sofort die 500 μL der gemischten Suspension (~ 20 min für die Analyse mit einer niedrigen Fließrate) in das Durchflusszytometer. Verwenden Sie eine niedrige Durchflussrate und stellen Sie sicher, dass der Schwellenwert für Kanal FL2 (Ex-488 nm, Emissionsfilter 585/42 nm) als Wert 200 beträgt. Messen Sie die mittlere Fluoreszenz im Kanal FL4 (exсitation 633 nm, Emissionsfilter 660/20) für den Fluoreszenzfarbstoff aus der Materialtabelle. HINWEIS: Wählen Sie ein Zytometer ohne Autosampler. Dies beschleunigt den Prozess der Injektion der Probe in die Messzelle.</li>
		<li>Wenn eine Sättigung der Bindung erreicht ist (kein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz innerhalb von 5 min), verdünnen Sie die Probe schnell 20-fach mit dem Puffer von Tyrode und überwachen Sie die Dissoziation, bis die Basisfluoreszenz erreicht ist (vollständige Dissoziation) oder bis ein Plateau erreicht ist (keine signifikante Abnahme der Fluoreszenz innerhalb von 5 min). HINWEIS: Fügen Sie als Kontrolle 10 μM EDTA hinzu und überwachen Sie die vollständige Dissoziation für 5 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gleichgewichtsbindungsexperimente HINWEIS: Verwenden Sie die kinetische Bindungskurve, um die Zeit bis zum Erreichen der Sättigung zu bestimmen. die Sättigungszeit für fX-fd und künstliche Vesikel beträgt 20 min.<ol>
<li>Inkubieren Sie künstliche Phospholipidvesikel (5 μM) für den Bindungsassay mit unterschiedlichen Konzentrationen von fX-fd (von 0 bis 1.000 nM) im Tyrode-Puffer für 20 min.</li>
		<li>Verdünnen Sie jede Probe von Schritt 4.2.1 um das 20-fache auf ein Endvolumen von 200 μL mit dem Puffer von Tyrode. Analysieren Sie die verdünnte Probe sofort durch Durchflusszytometrie innerhalb von 30 s. Verwenden Sie die Einstellungen aus Schritt 4.1.3. HINWEIS: Verwenden Sie als Kontrolle für unspezifische Bindungen ähnliche Proben mit EDTA (10 μM) und inkubieren Sie sie für 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse von Durchflusszytometriedaten
<ol><li>Exportieren Sie Experimente im FSC-Format aus der Zytometrie-Datenerfassungssoftware zur Datenanalyse in die Zytometer-Software (siehe Materialtabelle). Wählen Sie Datei | | exportieren FCS-Dateien. Öffnen Sie FSC-Dateien in der Zytometersoftware zur Datenanalyse, indem Sie die Dateien auf dem Computer auswählen und in den Arbeitsbereich des Programms ziehen.</li>
	<li>Für das Gating der Mikrovesikel identifizieren Sie den Bereich der Mikrovesikel durch die Fluoreszenz des lipophilen Farbstoffs DiIC16 (3). Verwenden Sie Menübefehle oder die Schaltfläche "Plot" im Arbeitsblatt, um Punktplot-SSC aus FL2 (Farbstoff DilC16(3)) in Protokollkoordinaten zu erstellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Tor, um einen Gating-Bereich zu zeichnen, sodass Ereignisse aus einer Probe ohne Vesikel nicht in diesen Bereich einbezogen werden (Abbildung 1B,C).</li>
	<li>Analysieren Sie die kinetischen Experimente.<ol>
<li>Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit den Koordinaten der Fluoreszenz (FL4) im Laufe der Zeit für den Bereich der Vesikel (Doppelklicken Sie in Schritt 5.2 auf den Bereich der Vesikel)</li>
		<li>Exportieren Sie die Daten über die Änderung der Fluoreszenz im Laufe der Zeit im CSV-Format. Wählen Sie Beispiel| Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf | | exportieren Wählen Sie FL4 und Zeit in Parameter | Verzeichnis zum Speichern | auswählen CSV-Format | auswählen Ausfuhr.</li>
		<li>Öffnen Sie die CSV-Datei in einer beliebigen Statistiksoftware (siehe Materialtabelle). Berechnen Sie einen einfachen gleitenden Durchschnitt der Fluoreszenz und Zeit für jeweils 1.000 Ereignisse.</li>
		<li>Nähern Sie sich einem Diagramm der Abhängigkeit der einfachen gleitenden durchschnittlichen Fluoreszenz von der Zeit unter der Annahme der exponentiellen Abhängigkeit (Analysis &gt; Fitting &gt;Nonlinear Curve Fit) und verwenden Sie dieses, um die kinetische Assoziationskonstante mit Eq (5) zu berechnen. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq05v2.jpg">(5) wobei [XB] die gebundene Faktorkonzentration zu jedem Zeitpunkt (benutzerdefinierte Einheiten) gemäß dem einfachen gleitenden Durchschnitt aus Schritt 5.3.3 ist; [X] ist die addierte Faktorkonzentration; [X]max ist die maximale gebundene Faktorkonzentration; k ist die Assoziationskonstante; t ist die Zeit.</li>
		<li>Wiederholen Sie die gleichen Aktionen (5.3.1-5.3.4), um die kinetische Dissoziationskonstante mit Eq (6) zu berechnen. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq06v2.jpg">(6) wobei [XB] die gebundene Faktorkonzentration zu jedem Zeitpunkt ist; [X]0 ist die gebundene Faktorkonzentration im Anfangsmoment der Zeit; k ist die Dissoziationskonstante; t ist die Zeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gleichgewichtsbindungs-Assay<ol>
<li>Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenz von fX-fd im Bereich der Vesikel für jede ausgewählte Konzentration von fX-fd.</li>
		<li>Nähert sich der Abhängigkeit der gebundenen Faktorfluoreszenz von der Konzentration des hinzugefügten Faktors unter der Annahme einer einfachen Einzelplatzbindung an. Berechnen Sie die durchschnittlichen Bindungsparameter mit Eq (7) aus mindestens drei unabhängigen Wiederholungen. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq07v2.jpg">(7) wobei [XB] die gebundene Faktorkonzentration ist; [X] ist die addierte Faktorkonzentration; nx ist die scheinbare Anzahl der Bindungsstellen pro Vesikel; Kd ist die scheinbare Dissoziationskonstante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Umrechnung der Fluoreszenzintensität in die mittlere Anzahl der Bindungsstellen
<ol><li>Bereiten Sie kalibrierte Perlen vor.<ol>
<li>Inkubieren Sie gelfiltrierte Blutplättchen (siehe Schritt 3.3) mit A23187 (10 μM) in Gegenwart von CaCl 2 (2,5 mM) für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zu den aktivierten Blutplättchen kommen die verschiedenen Konzentrationen von fX-fd (0 bis 1.000 nM). 2% v/v Formaldehyd hinzufügen und 1 h inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Blutplättchen mit 3 M Glycin und 5% BSA für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Reinigen Sie die Mischung von dem nicht umgesetzten Farbstoff. Zentrifugieren Sie die Blutplättchen für 5 min bei 400 × g, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet im Puffer von Tyrode (mit 0,5% BSA). HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 6.1.3 dreimal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie den Fluoreszenzpegel der Kalibrierkügelchen in jeder Probe zuerst mit einem Spektrofluorometer (für Fluoreszenzfarbstoff aus der Materialtabelle, Anregung 633 nm, Emission 670 nm) und dann mit dem Durchflusszytometer (in Kanal FL4: Anregung 633 nm, Emissionsfilter 660/20). Bestimmen Sie mithilfe eines Zellzählers die Anzahl der Perlen in jeder Probe.</li>
	<li>Wandeln Sie die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Perlenprobe mit einem Spektrofluorometer in die Konzentration des löslichen Fluoreszenzfarbstoffs um. Berechnen Sie die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration für die Anzahl der Fluorophormoleküle mit Eq (8) neu. <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq08.jpg">(8) wobei Nx die Anzahl der Fluorophormoleküle ist; C ist die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration; NA ist die Avogadro-Konstante; NA = 6,02214076×1023 mol -1.</li>
	<li>Erstellen Sie ein Abhängigkeitsdiagramm der durchschnittlichen Fluoreszenz der Kügelchen in einem Durchflusszytometer (Schritt 6.2) über die Anzahl der Fluorophormoleküle (siehe Schritt 6.3) für jede Probe mit einer beliebigen statistischen Software (siehe Materialtabelle). Approximieren Sie diese Abhängigkeit durch die Linienproportionalität (Analyse | Anpassung | Linear anpassen). Berechnen Sie aus der Näherung in Eq (9) den Umrechnungsfaktor der mittleren Fluoreszenz zu Bindungsstellen. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq09.jpg">(9) wobei MF die mittlere Fluoreszenz von Perlen durch Durchflusszytometrie ist; Nx ist die Anzahl der Fluorophormoleküle pro Perle; CF stellt den Umrechnungsfaktor der mittleren Fluoreszenz zu Bindungsstellen dar. CF und b werden aus den Ergebnissen der Anpassung des Graphen durch lineare Proportionalität erhalten.</li>
	<li>Berechnen Sie die scheinbare Anzahl der Bindungsstellen pro Zinsvesikel mit Eq (10). <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63459/63459eq10.jpg">(10) wobei nx die scheinbare Anzahl der Bindungsstellen pro Vesikel von Interesse ist; MF ist die mittlere Fluoreszenz der interessierenden Vesikel durch Durchflusszytometrie; CF und b sind Umrechnungsfaktoren aus dem Eq (8).</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+model+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">A cell-based model of hemostasis.</a> Thrombosis and haemostasis. 85 (6), 958-965 (2001).</li>
<li>Roberts, H. R., Hoffman, M., Monroe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+model+of+thrombin+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">A cell-based model of thrombin generation.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 32, Suppl 1 32-38 (2006).</li>
<li>Panteleev, M. A., Dashkevich, N. M., Ataullakhanov, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemostasis+and+thrombosis+beyond+biochemistry%3A+roles+of+geometry%2C+flow+and+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion.</a> Thrombosis Research. 136 (4), 699-711 (2015).</li>
<li>Podoplelova, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hysteresis-like+binding+of+coagulation+factors+X%2FXa+to+procoagulant+activated+platelets+and+phospholipids+results+from+multistep+association+and+membrane-dependent+multimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Hysteresis-like binding of coagulation factors X/Xa to procoagulant activated platelets and phospholipids results from multistep association and membrane-dependent multimerization.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Panteleev, M. A., Ananyeva, N. M., Greco, N. J., Ataullakhanov, F. I., Saenko, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+subpopulations+of+thrombin-activated+platelets+differ+in+their+binding+of+the+components+of+the+intrinsic+factor+X-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 3 (11), 2545-2553 (2005).</li>
<li>Kotova, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+coagulation+factor+XIII+zymogen+to+activated+platelet+subpopulations%3A+roles+of+integrin+%CE%B1IIb%CE%B23+and+fibrinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Binding of coagulation factor XIII zymogen to activated platelet subpopulations: roles of integrin αIIbβ3 and fibrinogen.</a> Thrombosis and Haemostasis. 119 (6), 906-915 (2019).</li>
<li>Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+the+assembly+of+ligand%2C+receptor%2C+and+G+protein+by+quantitative+fluorescence+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry.</a> Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (2002).</li>
<li>Nolan, J. P., Shen, B., Park, M. S., Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+human+flap+endonuclease-1+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of human flap endonuclease-1 by flow cytometry.</a> Biochemistry. 35 (36), 11668-11676 (1996).</li>
<li>Sarvazyan, N. A., Lim, W. K., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+analysis+of+receptor%E2%88%92G+protein+interactions+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence analysis of receptor−G protein interactions in cell membranes.</a> Biochemistry. 41 (42), 12858-12867 (2002).</li>
<li>Sarvazyan, N. A., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+assemblies+by+flow+cytometry%3A+determinants+of+Gi1+and+by+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optical+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular assemblies by flow cytometry: determinants of Gi1 and by binding.</a> Advances in Optical Biophysics. 3256, 122-131 (1998).</li>
<li>De Franceschi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProLIF+-+Quantitative+integrin+protein-protein+interactions+and+synergistic+membrane+effects+on+proteoliposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">ProLIF - Quantitative integrin protein-protein interactions and synergistic membrane effects on proteoliposomes.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die vorgeschlagene Methode kann für eine grobe Charakterisierung der Wechselwirkung von Proteinen mit Phospholipidmembranen aus verschiedenen Quellen und Zusammensetzungen angepasst werden. Die hier beschriebene quantitative Durchflusszytometrie räumt der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) in mehreren Parametern zu. Insbesondere hat es eine geringere Empfindlichkeit und Zeitauflösung und erfordert eine fluoreszierende Markierung von Proteinen. Die fluoreszierende Markierung kann bei vielen Proteinen zu einer Veränderung ...

Biomembranen trennen den inneren Inhalt tierischer Zellen und des extrazellulären Raums. Beachten Sie, dass Membranen auch Mikrovesikel umgeben, die während des Lebenszyklus der Zelle gebildet wurden, und Organellen. Die Zellmembran besteht überwiegend aus Lipiden und Proteinen. Membranproteine übernehmen Signal-, Struktur-, Transport- und Klebefunktionen. Die Lipiddoppelschicht ist aber auch essentiell für die Wechselbeziehung der tierischen Zelle mit dem extrazellulären Raum. Diese Arbeit schlägt eine Methode vor, um die periphere Wechselwirkung externer Proteine mit der Lipidmembran zu untersuchen.
Das auffälligste Beispiel für Reaktionen, die auf der äußeren Membranschicht einer tierischen Zelle auftreten, ist die Blutgerinnungsreaktion. Ein wichtiges Merkmal der Blutgerinnung ist, dass alle Hauptreaktionen auf den Phospholipidmembranen von Zellen und Mikrovesikeln ablaufen, die aus diesen Zellen entstehen, und nicht im Plasma 1,2,3. Membranabhängige Reaktionen umfassen den Prozess des Startens der Koagulation (auf den Zellmembranen des Subendothels, des entzündeten Endothels oder der aktivierten Immunzellen, unter Beteiligung eines Gewebefaktors), alle Reaktionen der Hauptkaskadenaktivierung der Faktoren IX, X, Prothrombin; Aktivierung von Faktor XI durch Thrombin (auf den Membranen von aktivierten Blutplättchen, Erythrozyten, Lipoproteinen und Mikrovesikeln); Reaktionen des Protein-C-Signalwegs; Inaktivierung von Gerinnungsenzymen (auf den Membranen von Endothelzellen unter Beteiligung von Thrombomodulin-Cofaktoren, Endothelprotein-C-Rezeptor, Heparansulfat); und Kontaktwegreaktionen (auf Membranen von Blutplättchen und einigen Mikrovesikeln unter Beteiligung unbekannter Cofaktoren). Daher ist es unmöglich, die Blutgerinnung zu untersuchen, ohne die Wechselwirkung verschiedener Plasmaproteine mit der Membran von Blutzellen zu untersuchen.
Dieser Beitrag beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Lipidmembranen von Zellen oder Mikrovesikeln. Dieser Ansatz wurde ursprünglich vorgeschlagen, um die Wechselwirkung von Blutplasma mit Blutplättchen und künstlichen Phospholipidvesikeln zu untersuchen. Darüber hinaus interagieren die meisten der untersuchten Proteine direkt mit negativ geladenen Membranphospholipiden, insbesondere mit Phosphatidylserin 4,5. Hinzu kommen Proteine, deren Interaktion mit der Membran durch spezielle Rezeptoren vermitteltwird 6.
Eine wichtige Fähigkeit der Durchflusszytometrie ist die Unterscheidung zwischen freien und gebundenen Liganden ohne zusätzliche Trennung. Diese Eigenschaft der Zytometrie ermöglicht die Untersuchung der Ligandengleichgewichtsbindung am Endpunkt und hilft bei der Durchführung kontinuierlicher kinetischer Messungen. Die Technik ist unausgereift und erfordert keine komplexe Probenvorbereitung. Die Durchflusszytometrie wird aktiv eingesetzt, um die Dynamik der Wechselwirkung zwischen fluoreszierenden Peptiden, Rezeptoren und G-Proteinen in intakten und waschmitteldurchlässigen Neutrophilenquantitativ zu untersuchen 7. Dieser Ansatz eignet sich auch für die Erforschung von Protein-DNA-Interaktionen und der Kinetik der Endonukleaseaktivitätin Echtzeit 8. Im Laufe der Zeit wurde diese Methode verwendet, um hochaffine Protein-Protein-Interaktionen mit gereinigten Lipidvesikeln9 oder, allgemeiner, mit Membranproteinen, die in einem hocheffizienten Sf9-Zellexpressionssystem10 exprimiert werden, quantitativ zu untersuchen. Quantitative Methoden wurden auch zur Charakterisierung von Protein-Liposom-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie für Transmembranproteinebeschrieben 11.
Diese Technik verwendet selbst hergestellte Kalibrierperlen, um die Verwendung von kommerziell erhältlichen Perlenzu vermeiden 7. Die zuvorverwendeten Kalibrierperlen 7 sollten mit Fluorescein arbeiten, was das Sortiment an zugänglichen fluoreszierenden Liganden auf den Proteinen erheblich einschränkte. Darüber hinaus bietet dieses Dokument eine neue Möglichkeit, kinetische Daten für eine angemessene Zeitauflösung zu erfassen und zu analysieren. Obwohl diese Methode für künstliche Phospholipidvesikel beschrieben wird, gibt es keine offensichtlichen Einschränkungen für ihre Anpassungsfähigkeit an Zellen, natürliche Vesikel oder künstliche Phospholipidvesikel mit einer anderen Lipidzusammensetzung. Das hierin beschriebene Verfahren ermöglicht die Abschätzung der Parameter Wechselwirkung (kon, koff) und Gleichgewicht (Kd) und erleichtert die quantitative Charakterisierung der Anzahl der Proteinbindungsstellen auf der Membran. Beachten Sie, dass diese Technik eine ungefähre Schätzung der Anzahl der Bindungsstellen liefert. Die Vorteile der Methode sind ihre relative Einfachheit, Zugänglichkeit und Anpassungsfähigkeit an native Zellen und natürliche und künstliche Mikrovesikel.

<table><tbody><tr><td>A23187</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7522-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidylester)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37573</td><td>Fluoreszenzfarbstoff</td></tr><tr><td>Apyrase aus Kartoffeln</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2230</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCantoII</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>VWR Life Science AMRESCO</td><td>Am-O332-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid, wasserfrei, Pulver &ge; 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse Fluoreszenzspektrometer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D384</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz</td><td>VWR Life Science AMRESCO</td><td>Am-O105B-0.1</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Zytometrie-Datenerfassungssoftware</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Zytometer-Software für die Datenanalyse</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Human Factor X</td><td>Enzymforschung</td><td>HFX 1010</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylaminhydrochlorid</td><td>Panreac</td><td>141914.1209</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylcholin (Gehirn, Schwein)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840053P</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylserin (Gehirn, Schwein) (Natriumsalz)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840032P</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>610020-1EA</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 SR4 v8.0951</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>Statistische Software</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten, Biotechnologie VWR</td><td>Life Science AMRESCO</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E1</td><td>Cayman Chemical</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0033-01</td><td>Gel-Filtrationsmedium für die Proteinreinigung</td></tr><tr><td>Sepharose CL-2B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL2B300-500ML</td><td>Gel-Filtrationsmedium für die Thrombozytenreinigung</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Corning</td><td>61-065-RO</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3139-250G</td><td></td></tr><tr><td>Spin-Säulen mit Membran 0,2 &Mikro; m</td><td>Sartorius</td><td>VS0171</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat-Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der wechselwirkung fluoreszierend markierter proteine mit künstlichen phospholipid-mikrovesikeln mittels quantitativer durchflusszytometrie

Analyzing the Interaction of Fluorescent-Labeled Proteins with Artificial Phospholipid Microvesicles using Quantitative Flow Cytometry

Im menschlichen Körper verlaufen die meisten der wichtigsten physiologischen Reaktionen, die an der Immunantwort und der Blutgerinnung beteiligt sind, auf den Membranen der Zellen. Ein wichtiger erster Schritt in jeder membranabhängigen Reaktion ist die Bindung von Protein an die Phospholipidmembran. Ein Ansatz zur Untersuchung der Proteinwechselwirkung mit Lipidmembranen wurde unter Verwendung fluoreszierend markierter Proteine und Durchflusszytometrie entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Membran-Interaktionen mit lebenden Zellen und natürlichen oder künstlichen Phospholipid-Vesikeln. Der Vorteil dieser Methode ist die Einfachheit und Verfügbarkeit von Reagenzien und Geräten. Bei dieser Methode werden Proteine mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Es können jedoch sowohl selbst hergestellte als auch kommerziell erhältliche, fluoreszierend markierte Proteine verwendet werden. Nach der Konjugation mit einem fluoreszierenden Farbstoff werden die Proteine mit einer Quelle der Phospholipidmembran (Mikrovesikel oder Zellen) inkubiert und die Proben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die erhaltenen Daten können zur Berechnung der kinetischen Konstanten und des Gleichgewichts Kd verwendet werden. Darüber hinaus ist es möglich, die ungefähre Anzahl der Proteinbindungsstellen auf der Phospholipidmembran mit speziellen Kalibrierperlen abzuschätzen.

Das hierin beschriebene Durchflusszytometrieverfahren wird verwendet, um die Bindung von Plasmagerinnungsproteinen an aktivierte Blutplättchen zu charakterisieren. Zusätzlich wurden Phospholipidvesikel PS:PC 20:80 als Modellsystem eingesetzt. Diese Arbeit konzentriert sich hauptsächlich auf künstliche Phospholipidvesikel als Beispiel. Die Parameter des Zytometers, insbesondere die Photomultiplierröhrenspannung (PMT) und die Kompensation müssen für jedes spezifische Gerät, den Untersuchungsgegenstand (Zellen, künstliche o...

Hier beschreiben wir eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Membranen von Zellen oder Mikrovesikeln.

Analyse der Wechselwirkung fluoreszierend markierter Proteine mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie

In the human body, most of the major physiologic reactions involved in the immune response and blood coagulation proceed on the membranes of cells. An ...

Mit dieser Mengendurchflusszytometrie-Methode können Forscher die kinetischen und Gleichgewichtsbräuche der eingebrachten Membraninteraktion berechnen und die Anzahl der Proteine schätzen, die von Stellen auf der PPH-Membran eingebracht werden. Die Vorteile dieser Methode sind die Einfachheit und Verfügbarkeit von Reagenzien und Geräten. Diese Methode dient ausschließlich der Grundlagenforschung.Das Protokoll wurde entwickelt, um Proteinlipidwechselwirkungen in der Blutberechnung zu untersuchen, und kann in anderen Bereichen verwendet werden, um die Wechselwirkung von Proteinen mit verschiedenen Lipidmembranen zu charakterisieren. Die Methode kann für die Mengenbewertung der Ligandenbindungsdynamik an den verschiedenen Zellen und Ligandentypen verwendet werden. Beginnen Sie die kinetischen Bindungsexperimente, indem Sie die Phospholipidvesikel im Tyrode-Puffer auf eine Konzentration von einem Mikromolar und ein Gesamtvolumen von 250 Mikrolitern verdünnen.Mischen Sie dann fluoreszierend markierten Gerinnungsfaktor X oder FX FD und eine Konzentration von 500 Nanomolar mit den Phospholipidvesikeln in einem Verhältnis von eins zu eins, um ein Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern zu erhalten. Injizieren Sie sofort 500 Mikroliter der gemischten Suspension in das Durchflusszytometer. Bei einer Durchflussrate mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und einem Emissionsfilter von 585 Nanometern; mit einer Breite von 42 für Kanal FL zwei.Als nächstes messen Sie die mittlere Fluoreszenz in Kanal FL vier mit Anregung bei 633 Nanometern und Emissionsfilter bei 660 Nanometern mit einer Breite von 20. Wenn die Sättigung der Bindung erreicht ist, verdünnen Sie die Probe schnell um das 20-fache mit dem Tyrode-Puffer und überwachen Sie die Dissoziation, bis eine Basisfluoreszenz oder ein Plateau erreicht ist. Für Gleichgewichtsbindungsexperimente werden fünf mikromolare künstliche Phospholipidvesikel mit unterschiedlichen Konzentrationen von FX FD von null bis 1000 nanomolar im Tyrode-Puffer für 20 Minuten inkubiert.Nach der Inkubation verdünnen Sie jede Probe um das 20-fache auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern mit dem Puffer von Tyrode und analysieren Sie die verdünnte Probe dann innerhalb von 30 Sekunden durch Durchflusszytometrie. Um die Daten zu analysieren, exportieren Sie die Experimente im FSC-Format aus der Zytometrie-Datenerfassungssoftware in die Zytometersoftware zur Datenanalyse. Indem Sie die Datei auswählen und dann auf die Registerkarten Exportieren und FSC-Dateien klicken.Sobald Sie fertig sind, öffnen Sie die FCS-Dateien in der Zytometer-Software, indem Sie die Dateien auf dem Computer auswählen und die Dateien in den Arbeitsbereich des Programms ziehen. Für das Gating der Mikrovesikel identifizieren Sie den Bereich der Mikrovesikel durch Fluoreszenz des lipophilen Farbstoffs, DIC 16 drei. Verwenden Sie dann die Schaltfläche "Plot" im Arbeitsblatt, um aus FL zwei D I C 16 in Protokollkoordinaten einen Punktplot-SSC zu erstellen.Wählen Sie dann die rechteckige Gate-Taste, um einen Gating-Bereich zu zeichnen. Um die kinetischen Experimente zu analysieren, erstellen Sie ein Punktdiagramm unter Verwendung der Koordinaten der Fluoreszenz über die Zeit für die Region der Vesikel. Exportieren Sie als Nächstes die Daten über die Änderung der Fluoreszenz im Laufe der Zeit im CSV-Format;indem Sie Sample auswählen und mit der rechten Maustaste auf die Registerkarte Export klicken, gefolgt von FL viermal in Parametern, wählen Sie das Verzeichnis zum Speichern aus, bevor Sie auf das CSV-Format auswählen klicken und auf die Registerkarte Export klicken.Öffnen Sie nach der Übertragung die CSV-Datei in einer statistischen Software, um die einfache gleitende durchschnittliche Fluoreszenz und die Zeit für jeweils 1000 Ereignisse zu berechnen, nähern Sie sich einem Diagramm der Abhängigkeit der einzelnen gleitenden durchschnittlichen Fluoreszenz von der Zeit unter der Annahme der exponentiellen Abhängigkeit und verwenden Sie den Wert, um die kinetische Assoziationskonstante mit einer Gleichung zu berechnen. Berechnen Sie dann die kinetische Dissoziationskonstante mit der Gleichung wie zuvor beschrieben. Um das Datum des Gleichgewichtsbindungsassays zu analysieren, bestimmen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz von FX FD im Bereich der Vesikel für jede ausgewählte Konzentration von FX FD und nähern Sie sich dann der Abhängigkeit des gebundenen Faktors Fluoreszenz von der Konzentration des hinzugefügten Faktors unter der Annahme der Einzelplatzbindung an.Berechnen Sie die durchschnittlichen Bindungsparameter mit einer Gleichung aus mindestens drei unabhängigen Wiederholungen. Fahren Sie fort, kalibrierte Perlen vorzubereiten, indem Sie gelfiltrierte Blutplättchen mit Calcium IANA 4A dreiundzwanzig, einhundertsiebenundachtzig in Gegenwart von 2,5 Millimolar Calciumchlorid für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Addieren die aktivierten Blutplättchen die verschiedenen Konzentrationen von FX FD und inkubieren Sie die Blutplättchen mit zwei Volumenprozent Formaldehyd.Nach einer Stunde stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Blutplättchen mit drei molaren Glycin und 5% BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann reinigen Sie die Mischung aus dem nicht umgesetzten Farbstoff mit Zentrifugation bei 400 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie das Supernat, bevor Sie das Pellet im Puffer von Tyrode mit 0,5% BSA wieder suspendieren.Als nächstes messen Sie den Fluoreszenzpegel der Kalibrierkügelchen in jeder Probe mit einem Spektrofluorometer und dann mit dem Durchflusszytometer. Bestimmen Sie die Anzahl der Perlen in jeder Probe mit Hilfe eines Zellzählers. Wandeln Sie die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Perlenprobe mit einem Spektrofluorometer in die Konzentration des löslichen Fluoreszenzfarbstoffs um und berechnen Sie die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration für die Anzahl der Spektrofluorometermoleküle neu.Erstellen Sie ein Abhängigkeitsdiagramm der durchschnittlichen Fluoreszenz der Kügelchen in einem Durchflusszytometer auf der Anzahl der Flurophormoleküle für jede Probe. Nähern Sie sich dann der Abhängigkeit durch die Linienproportionalität an, indem Sie die Analyse anpassen und lineare Tabs in der richtigen Reihenfolge anpassen. Berechnen Sie aus der Näherung in der Gleichung den Umrechnungsfaktor der mittleren Fluoreszenz zu Bindungsstellen.Berechnen Sie später die scheinbare Anzahl der Bindungsstellen pro Vesikel von Interesse. Die repräsentative Analyse zeigt Gating der künstlichen Phosphorlipidvesikel, die einen Mikrometer groß sind, mit dem eingearbeiteten lipophilen Fluoreszenzfarbstoff, Farbstoff I C 16, das Gate wurde basierend auf einer Probe gesetzt, die die gleiche Größe künstliche Lipidvesikel ohne den Fluoreszenzfarbstoff enthielt. Die Kinetik des Proteins, das an die Vesikel bindet, wurde in der ersten Phase analysiert, indem die Probe kontinuierlich gesammelt wurde.Die gewonnenen Daten wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die durchflusszytometrischen Messungen sollten so schnell wie möglich nach dem Mischen der Lösungen und der Verdünnung mit dem Puffer von Tyrode beginnen. Die vorgeschlagene Methode könnte mit Oberflächenplasmaresonanz für die Untersuchung von Membranwechselwirkungen ergänzt werden, die hochempfindlich mit guter temporärer Auflösung ist und keine Lieferung erfordert Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Zugänglichkeit und Einfachheit.

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Biochemistry

Biochemie

Dieses Video diskutiert den Fluoreszenz-Leckage-Assay, um die Wechselwirkungen von zellpenetrierenden Peptiden mit Zellmembranen unter Verwendung von Zellmembran-Nachahmungen zu untersuchen - große unilamelläre Vesikel oder LUVs, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher verkapselt sind.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der zellpenetrierenden Peptidinteraktion mit der Membran

In diesem Video demonstrieren wir die Interaktion zwischen Proteinen und künstlichen Phospholipid-Vesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie. Die Bindung von fluoreszenzmarkierten Proteinen an fluoreszenzmarkierte Phospholipid-Vesikel erhöht die mittlere Fluoreszenzintensität, und dieser Anstieg wird mit einem Durchflusszytometer nachgewiesen.

Quantitative Durchflusszytometrie zur Untersuchung markierter Protein-Phospholipid-Vesikel-Wechselwirkungen

In diesem Video demonstrieren wir Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen in einem mikrofluidischen Muster unter Verwendung des pH-Modulationsassays unter Verwendung eines pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der an das Phosphatidylethanolamin-Lipid einer unterstützten Lipiddoppelschicht, einer sogenannten mikrofluidischen Plattform, gebunden ist. Die Modulation des pH-Werts nach der Proteinbindung an Phospholipid führt zu einer Fluoreszenzlöschung.

pH-Modulationsassay an gestützten Lipiddoppelschichten zum Nachweis von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluoreszenz Komplementation bietet einen hohen Durchsatz quantitative Methode zur Protein-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen. Diese Methode kann zur Zuordnung Proteinbindungsstellen und zum Screening von Faktoren, die Protein-Protein-Interaktion reguliert angewendet werden.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Ererbten Arrhythmien werden häufig durch Mutationen verursacht, die die Oberfläche Lieferung eines oder mehrerer Ionenkanäle verändern. Hier passen wir die Durchflusszytometrie-Assays eine Quantifizierung der relativen Gesamt und Zelloberflächenproteinexpression von rekombinanten Ionenkanäle in tsa-201-Zellen exprimiert zu liefern.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Liposomen und wie diese auf einer Oberfläche immobilisiert und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie massiv parallel abgebildet werden können. Dies ermöglicht die Quantifizierung der Größe und der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen der Population.

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Hier beschreiben wir Protokolle mit fluoreszierenden Lipidsensoren und Liposomen, um festzustellen, ob ein Protein Phosphatidylserin oder Phosphatidylinositol-4-phosphat in vitroextrahiert und transportiert.

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Erfahren Sie, wie Sie Protein-Lipid-Wechselwirkungen mit quantitativer Durchflusszytometrie charakterisieren können. Diese Methode ermöglicht die Berechnung kinetischer und Gleichgewichtskonstanten für Grundlagenforschung.

Analyse der Wechselwirkung fluoreszierend markierter Proteine mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Analyse der Wechselwirkung fluoreszierend markierter Proteine mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie

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