Name: Ensemble Force Spektroskopie durch Scherkräfte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Ensemble-Force-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Liganden-Bindungen durch Scherkräfte. Diese hochdurchsatzfähige Methode ermöglicht Echtzeit-Erfassung biomolekularer Strukturen.

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Diese Forschungsarbeiten wurden von der National Science Foundation [CBET-1904921] und den National Institutes of Health [NIH R01CA236350] bis H. M.

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Puffer und chemischen Reagenzien sind in der Tabelle Materialien aufgeführt.
1. Vorbereitung des Scherkraftmikroskops
HINWEIS: Das Scherkraftmikroskop besteht aus zwei Teilen, einer Reaktionseinheit (Homogenisator) und einer Detektionseinheit (Fluoreszenzmikroskop). Die Vergrößerung des Okulars beträgt 10x und die Vergrößerung der Objektivlinse (Luft) ist 4x.
<ol><li>Montieren Sie den Homogenisator und das Mikroskop auf einem Montagetisch. Tragen Sie eine Schutzbrille und schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop ein und stellen Sie dann den Homogenisator ein, um sicherzustellen, dass der Anregungslichtstrahl einer geeigneten Wellenlänge (hier wurden 488 nm verwendet) durch die Mitte der Dispergierspitze des Homogenisators geht.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Reaktionskammer mit flachem Boden vor, die 5 cm hoch und 1,5 cm 2 x 1,5 cm2 im Querschnitt ist. Um den Hintergrund zu reduzieren, stellen Sie sicher, dass das ausgewählte Kammermaterial nicht fluoresziert, wie z. B. Gläser (einige Kunststoffe haben Fluoreszenz).</li>
	<li>Wählen Sie eine geeignete Homogenisator-Dispergierspitze, die die gewünschte Scherkraft bereitstellen kann. HINWEIS: Die Scherrate ist abhängig vom Abstand zwischen Rotor und Stator bei einer festen Drehzahl11 gemäß der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63741/63741eq01.jpg" style="margin: auto;"> wobei μ die dynamische Viskosität von Wasser bei 20 °C ist; D ist der Innendurchmesser des Stators; d ist der Außendurchmesser des Rotors und V die Schergeschwindigkeit (U/min).</li>
	<li>Klemmen Sie die Reaktionskammer auf den Probentisch des Fluoreszenzmikroskops, und stellen Sie die Kammer dann so ein, dass sie die Dispergierspitze des Homogenisators hält (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass sich die Dispergierspitze etwas über (~ 1 mm) der unteren Oberfläche der Reaktionskammer befindet.</li>
	<li>Stellen Sie die vertikale Position des Homogenisators und der Kammer zusammen ein, um sicherzustellen, dass der Fokus des Mikroskops auf der Oberfläche der Dispergierspitze liegt. Stellen Sie dann die horizontale Position der Dispergierspitze ein, um sicherzustellen, dass der Erfassungsbereich (Sichtfeld) zwischen Rotor und Stator eingestellt ist (Abbildung 1).</li>
	<li>Schalten Sie die Fluoreszenzkanäle entsprechend dem im Experiment verwendeten Fluoreszenzfarbstoff ein.</li>
	<li>Verwenden Sie vor dem Hochgeschwindigkeitsscherexperiment entionisiertes (DI) Wasser, um die Scherung mit einer niedrigen Schergeschwindigkeit (z. B. 2.000 U/min) zu testen, um sicherzustellen, dass die Dispergierspitze ordnungsgemäß arbeiten kann, ohne die Reaktionskammer zu berühren.</li>
</ol>2. Entfaltung von i-Motiven mit und ohne Liganden
<ol><li>Bereiten Sie eine menschliche Telomer-i-Motiv-DNA (Table of Materials) vor, die an ihren beiden Enden mit einem Farbstoff bzw. einem Quencher markiert ist, in DI-Wasser, wie in Hu et al.11 beschrieben. HINWEIS: i-Motiv mit Sequenz: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.</li>
	<li>Die DNA wird im 30 mM MES-Puffer bei pH 5,5 oder pH 7,4 auf 5 μM verdünnt. Der DNA-Lösung wird der Ligand L2H2-4OTD, der nach Abraham Punnoose et al.13 synthetisiert wurde, in einem Konzentrationsbereich von 0-60 μM hinzugefügt. Mischen Sie die Lösung vorsichtig für 10 min, um die i-Motivstrukturen ohne Licht zu falten.</li>
	<li>Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der Reaktionskammer, die mit deionisiertem DI-Wasser gefüllt ist, mit dem Fluoreszenzmikroskop ohne Scherung. Eine einfache Möglichkeit, die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren, besteht darin, die Reaktionskammer mit DI-Wasser zu waschen. Der Hintergrundfluoreszenzwert muss später in den Datenanalysen subtrahiert werden. HINWEIS: Streulicht sollte ab diesem Schritt vermieden werden.</li>
	<li>Stellen Sie die Parameter der CCD-Kamera über die Software ein. Die empfohlenen Parameter lauten wie folgt: Belichtungszeit = 0,5 s, CCD-Empfindlichkeit = 1600 und Aufnahmezeit = 20 min.</li>
	<li>Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere und saubere Reaktionskammer. Decken Sie die Reaktionskammer mit einer schwarzen Box ab. Starten Sie dann den Homogenisator, um die Scherung mit einer ausgewählten Scherrate von 9.724 s− 1 bis 97.245 s−1 (ausgewählt mit der mit dem Homogenisator verbundenen Software) für 20 Minuten durchzuführen, wobei die CCD-Kamera eingeschaltet ist, um die Daten aufzuzeichnen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit DI-Wasser.</li>
</ol>3. Scherkraftbetätigte Klickreaktion
<ol><li>Bereiten Sie i-Motiv-DNA in DI-Wasser vor. Inkubation von 10 μM i-Motiv-DNA in 300 μL 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4), ergänzt mit 150 μM CuCl und 300 μM Ascorbinsäure für 10 min, um die i-Motivstrukturen zu falten (alle Konzentrationen sind Endkonzentrationen in der Lösung). HINWEIS: CuCl ist der Katalysator der Klickreaktion. Ascorbinsäure verhindert die Oxidation von Kupfer (I).</li>
	<li>Ultrafiltrieren Sie die Lösung mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung bei einer Zentrifugalkraft von 14.300 x g. Die Lösung wird nach jeder Filtration mit 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4), ergänzt mit 300 μM Ascorbinsäure, auf ~500 μL aufgefüllt.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Filtration 3x.</li>
	<li>Die Restlösung wird gesammelt und ergibt ein Endvolumen von 300 μL durch Zugabe von 30 mM Tris (pH 7,4), ergänzt mit 300 μM Ascorbinsäure, zusammen mit 20 μM Calfluor 488 Azid, 20 μM HPG und 10 μM TBTA. Sobald die Reagenzien hinzugefügt wurden, bringen Sie die Lösung in die Dunkelkammer. HINWEIS: Licht sollte nach diesem Schritt vermieden werden.</li>
	<li>Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der mit DI-Wasser gefüllten Reaktionskammer vor den Scherexperimenten mit dem Mikroskop. Eine einfache Möglichkeit, die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren, besteht darin, die Reaktionskammer mit DI-Wasser zu waschen.</li>
	<li>Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere Reaktionskammer und starten Sie dann die Homogenisatorscherung mit einer Scherrate von 63.209 s−1 für 20 Minuten bei eingeschalteter CCD-Kamera .</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit DI-Wasser.</li>
</ol>

<ol><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+Optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li>
<li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+strong+is+a+covalent+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li>
<li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li>
<li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026(2016).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li>
<li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility%3A+Force-induced+collagen+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li>
<li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li>
<li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells%3A+go+with+the+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li>
<li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li>
<li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li>
<li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li>
<li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li>
<li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll ermöglicht die Echtzeituntersuchung der Entfaltung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen durch Scherkraft. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen, dass DNA-i-Motivstrukturen durch Scherkraft entfaltet werden können. Die Entfaltung des ligandengebundenen i-Motivs und die Scherkraft-betätigten Klickreaktionen waren Proof-of-Concept-Anwendungen für diese Ensemble-Kraftspektroskopie-Methode.
Abbildung 1</strong...

In der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie1 (SMFS) wurden die mechanischen Eigenschaften einzelner Molekülstrukturen mit hochentwickelten Instrumenten wie dem Rasterkraftmikroskop, einer optischen Pinzette und einer Magnetpinzette 2,3,4 untersucht. Eingeschränkt durch die gleiche Richtungsanforderung der Moleküle in den krafterzeugenden/detektierenden Aufbauten oder das kleine Sichtfeld in Magnetpinzetten und dem Miniatur-Zentrifugenkraftmikroskop (MCF)5,6,7,8, kann nur eine begrenzte Anzahl von Molekülen gleichzeitig mit SMFS untersucht werden. Der geringe Durchsatz von SMFS verhindert seine breite Anwendung im Bereich der molekularen Erkennung, was die Beteiligung einer großen Anzahl von Molekülen erfordert.
Die Scherströmung bietet eine mögliche Lösung, um Kräfte auf eine massive Gruppe von Molekülen auszuüben9. In einer Flüssigkeitsströmung innerhalb eines Kanals gilt: Je näher an der Kanaloberfläche, desto langsamer ist die Durchflussrate10. Ein solcher Strömungsgeschwindigkeitsgradient verursacht eine Schubspannung, die parallel zur Grenzfläche verläuft. Wenn ein Molekül in diese Scherströmung gebracht wird, orientiert sich das Molekül so, dass seine Längsachse mit der Strömungsrichtung übereinstimmt, da die Querkraft auf die lange Achse11 aufgebracht wird. Als Ergebnis dieser Neuorientierung wird erwartet, dass sich alle Moleküle des gleichen Typs (Größe und Länge der Griffe) in die gleiche Richtung ausrichten, während sie die gleiche Scherkraft erfahren.
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, um eine solche Scherströmung zu verwenden, um Scherkraft auf einen massiven Satz molekularer Strukturen auszuüben, wie das DNA-i-Motiv veranschaulicht. Bei diesem Protokoll wird eine Scherströmung zwischen Rotor und Stator in einer Homogenisatorspitze erzeugt. Die vorliegende Studie ergab, dass die gefaltete DNA-i-Motivstruktur durch Scherraten von 9724-97245 s−1 entfaltet werden konnte. Außerdem wurde eine Dissoziationskonstante von 36 μM zwischen dem L2H2-4OTD-Liganden und dem i-Motiv gefunden. Dieser Wert stimmt mit dem Wert von 31 μM überein, gemessen mit dem Gelverschiebungsassay12. Weiterhin wird die aktuelle Technik verwendet, um das i-Motiv zu entfalten, das das chelatierte Kupfer (I) freilegen kann, um eine Klickreaktion zu katalysieren. Dieses Protokoll ermöglicht es somit, einen großen Satz von i-Motiv-Strukturen mit kostengünstigen Instrumenten in angemessener Zeit (kürzer als 30 min) zu entfalten. Da die Querkrafttechnik den Durchsatz der Kraftspektroskopie drastisch erhöht, nennen wir diese Technik Ensemblekraftspektroskopie (EFS). Dieses Protokoll zielt darauf ab, experimentelle Richtlinien bereitzustellen, um die Anwendung dieses auf Scherkraft basierenden EFS zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>3K MWCO Amicon</td><td>Millipore Sigma</td><td>ufc900324</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>VWR</td><td>VWRC0143-100G</td><td></td></tr><tr><td>Calfluor 488 Azid</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1369-1</td><td></td></tr><tr><td>CuCl</td><td>Thermo&nbsp;</td><td></td><td></td>ACRO270525000</tr><tr><td>Dispersionsspitze</td><td>Schweiz</td><td>PT-DA07/2EC-B101</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Oligos</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farbstoff</td><td>IDT</td><td>/5Cy5/</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Janpan</td><td>Nikon TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Schweiz</td><td>PT 3100D</td><td></td></tr><tr><td>HPG</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>cs-295271</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>VWRC26760.295</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>VWR</td><td>VWRCE169-500G</td><td></td></tr><tr><td>Quencher</td><td>IDT</td><td>/3IAbRQSp/</td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>T2993</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>VWRCE133-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

ensemble force spektroskopie durch scherkräfte

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Einzelmolekültechniken, die auf Fluoreszenz und mechanochemischen Prinzipien basieren, bieten eine überlegene Empfindlichkeit in der biologischen Sensorik. Aufgrund des Mangels an Hochdurchsatzkapazitäten ist die Anwendung dieser Techniken in der Biophysik jedoch begrenzt. Die Ensemble-Kraft-Spektroskopie (EFS) hat einen hohen Durchsatz bei der Untersuchung eines massiven Satzes molekularer Strukturen gezeigt, indem mechanochemische Untersuchungen einzelner Moleküle in solche von molekularen Ensembles umgewandelt wurden. In diesem Protokoll wurden die DNA-Sekundärstrukturen (i-Motive) im Scherstrom zwischen Rotor und Stator einer Homogenisatorspitze mit Scherraten bis zu 77796/s entfaltet. Die Auswirkungen von Durchflussraten und Molekülgrößen auf die Scherkräfte des i-Motivs wurden nachgewiesen. Die EFS-Technik zeigte auch die Bindungsaffinität zwischen DNA-i-Motiven und Liganden. Darüber hinaus haben wir eine Klickchemiereaktion demonstriert, die durch Scherkraft (d.h. Mechano-Klick-Chemie) ausgelöst werden kann. Diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der Verwendung von Scherkraft zur Kontrolle der Konformation molekularer Strukturen.

Abbildung 1 zeigt die mechanische Entfaltung und Echtzeiterfassung von Ensemblemolekülen in EFS. In Abbildung 1B wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität der i-Motiv-DNA mit einer Scherrate von 9.724 s−1 bis 97.245 s−1 in einem pH-Puffer von 5,5 MES zunahm. Als Kontrolle wurde die Fluoreszenzintensität nicht erhöht, wenn die gleiche i-Motiv-DNA mit einer Rate von 63.209 s−1 in einem pH-Puffer von 7,4 MES ...

Die Ensemblekraftspektroskopie (EFS) ist eine robuste Technik zur mechanischen Entfaltung und Echtzeiterfassung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen in biophysikalischen und biosensorischen Bereichen.

Ensemble Force Spektroskopie durch Scherkräfte

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Dieses Protokoll bietet eine Hochdurchsatztechnik, um die intermolekulare Bindung zwischen DNA und Liganden zu untersuchen. Diese Technik hat einen hohen Durchsatz bei der Untersuchung massiver biomolekularer Strukturen gezeigt. Dazu wandelt es die mechanisch-chemischen Eigenschaften einzelner Moleküle in die von Molekülensembles um.Ich denke, es ist ein sehr fortschrittliches Experiment, aber es gibt nur wenige kritische Schritte. Zum Beispiel die Ausrichtung von Mikroskop, Homogenisator und Reaktionsröhrchen. Diese drei Dinge sollten perfekt aufeinander abgestimmt sein, um die Änderung der Fluoreszenz genau zu verfolgen.Beginnen Sie mit der Montage des Homogenisators und des Mikroskops auf einem Montagetisch. Schalten Sie nach dem Tragen der Schutzbrille das Fluoreszenzmikroskop ein und stellen Sie dann den Homogenisator ein, um sicherzustellen, dass der Anregungslichtstrahl durch die Mitte der Dispergierspitze des Homogenisators geht. Bereiten Sie dann eine Reaktionskammer mit flachem Boden vor, die fünf Zentimeter hoch und 1,5 mal 1,5 Quadratzentimeter im Querschnitt ist, um sicherzustellen, dass das ausgewählte Kammermaterial nicht fluoresziert, um den Hintergrund zu reduzieren.Danach klemmen Sie die Reaktionskammer auf den Probentisch des Fluoreszenzmikroskops und stellen dann die Kammer so ein, dass sie die Dispergierspitze des Homogenisators hält, wobei sichergestellt wird, dass sich die Spitze etwas über der unteren Oberfläche der Reaktionskammer befindet. Als nächstes passen Sie die vertikale Position des Homogenisators und der Kammer zusammen an, um sicherzustellen, dass der Fokus des Mikroskops auf der Oberfläche der Dispergierspitze liegt. Passen Sie dann die horizontale Position der Dispergierspitze an, um sicherzustellen, dass der Erfassungsbereich zwischen Rotor und Stater eingestellt ist.Schalten Sie die fluoreszierenden Kanäle entsprechend dem im Experiment verwendeten Fluoreszenzfarbstoff ein. Vor dem Hochgeschwindigkeitsscherexperiment wurde deionisiertes Wasser verwendet, um die Scherung mit einer niedrigen Schergeschwindigkeit zu testen. Bereiten Sie zunächst eine menschliche Telomer-i-Motiv-DNA vor, die an ihren beiden Enden jeweils mit einem Farbstoff und einem Quencher markiert ist, in entionisiertem Wasser, wie im Manuskript beschrieben.Als nächstes verdünnen Sie die DNA auf fünf Mikromolare in 30 Millimolar MES-Puffer bei pH 5,5 oder pH 7,4. Der DNA-Lösung wird der Ligand L2H24OTD" in einem Konzentrationsbereich von null bis 60 Mikromolar zugegeben und die Lösung 10 Minuten lang vorsichtig gemischt, um die i-Motivstrukturen ohne Licht zu falten. Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der Reaktionskammer, die mit entionisiertem Wasser gefüllt ist, mit dem Fluoreszenzmikroskop ohne Scherung.Stellen Sie dann die Parameter der CCD-Kamera mit der Software mit einer Belichtungszeit von 0,5 Sekunden, einer CCD-Empfindlichkeit von 1.600 und einer Aufnahmezeit von 20 Minuten ein. Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere und saubere Reaktionskammer und bedecken Sie die Reaktionskammer mit einem Blackbox. Starten Sie dann den Homogenisator, um die Scherung mit einer ausgewählten Scherrate von 9, 724 pro Sekunde bis 97, 245 pro Sekunde für 20 Minuten durchzuführen, wobei die CCD-Kamera eingeschaltet ist, um die Daten aufzuzeichnen.Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit entionisiertem Wasser. Bereiten Sie i-Motiv-DNA und entionisiertes Wasser vor. Dann inkubieren Sie 10 mikromolare i-Motiv-DNA und 300 Mikroliter 30 Millimolar-Tris-Puffer, ergänzt mit 150 Mikromol-Kupferchlorid und 300 Mikromolar-Ascorbinsäure für 10 Minuten, um die i-Motivstrukturen zu falten.Als nächstes ultrafiltrieren Sie die Lösung mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung bei einer Zentrifugalkraft von 14, 300 mal G.Auffüllen Sie die Lösung auf etwa 500 Mikroliter mit 30 Millimolar Tris-Puffern, ergänzt mit 300 Mikromolar Ascorbinsäure nach jeder Filtration. Nach dem Sammeln der Restlösung wird ein Endvolumen von 300 Mikrolitern durch Zugabe von 30 Millimolar Tris, ergänzt mit 300 Mikromolar Ascorbinsäure, zusammen mit 20 Mikromolar CalFluor 488 Azid, 20 Mikromolar HPG und 10 Mikromolar TBTA, hergestellt. Sobald die Reagenzien hinzugefügt wurden, bewegen Sie die Lösung in den dunklen Raum.Überprüfen und minimieren Sie dann die Hintergrundfluoreszenzintensität der mit entionisiertem Wasser gefüllten Reaktionskammer mit dem Mikroskop vor den Scherexperimenten. Als nächstes fügen Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere Reaktionskammer hinzu und starten dann die Homogenisatorscherung mit einer Scherrate von 63, 209 pro Sekunde für 20 Minuten bei eingeschalteter CCD-Kamera. Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit entionisiertem Wasser.Es wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität der i-Motiv-DNA mit der schieren Rate von 9.724 pro Sekunde bis 97.245 pro Sekunde in einem pH-Puffer von 5,5 MES zunahm. Die Fluoreszenzintensität wurde jedoch nicht erhöht, wenn die gleiche i-Motiv-DNA mit einer Rate von 63, 209 pro Sekunde geschert wurde, da sie sich bei pH 7,4 im MES-Puffer nicht faltet. Die Ligandenbindung an die DNA-i-Motivmoleküle, die dem reinen Fluss ausgesetzt waren, wurde ausgewertet, was zeigte, dass die Erhöhung der Fluoreszenzintensität mit zunehmender Ligandenkonzentration weniger offensichtlich wurde.Die Dissoziationskonstante wurde für die Wechselwirkung zwischen dem Liganden und dem i-Motiv bestimmt und betrug 34 Mikromol. Das Kupfer-Chelat-i-Motiv wurde mit der Scherrate von 63, 209 pro Sekunde entfaltet, und das freigesetzte Kupfer löste die fluorgene Klickreaktion aus, was im Laufe der Zeit zu einer erhöhten Fluoreszenzintensität führte. Stellen Sie zunächst sicher, dass der Erfassungsbereich zwischen Rotor und Stater eingestellt ist.Zweitens, überprüfen und minimieren Sie den Fluoreszenzhintergrund. Stellen Sie schließlich sicher, dass Sie die Reaktion filtern, bevor Sie eine Klickreaktion durchführen. Diese Methode öffnet ein Tor zur Erforschung der mechanischen Festigkeit, zum Falten und Entfalten aller Arten von Polymeren.Es könnten andere DNA-Strukturen, Proteine oder andere Polymere und ihre Wechselwirkung mit anderen Arten von Molekülen sein. Wie gesagt, mehrere andere Makromoleküle könnten mit diesem Ansatz untersucht werden.

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Biotechnik

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Wir präsentieren Ihnen ein detailliertes Protokoll skizziert wie nichtlineare oszillatorische Scherung Rheologie auf weichen Materialien durchgeführt und wie die SPP-LAOS-Analyse, um die Antworten zu verstehen, als eine Abfolge von physikalischen Prozesse ausgeführt.

Studium der großen Amplitudengang oszillatorische Scherung aus weichen Materialien

Das Protokoll beschreibt Verfahren, um Hochräumliche Auflösung Scomputed Tomography (CT)-Bilder eines körnigen Bodens während der triaxialen Kompression zu erfassen und Bildverarbeitungstechniken auf diese CT-Bilder anzuwenden, um das mechanische Verhalten von den Boden unter der Belastung.

Visualisierung von Versagen und dem damit verbundenen mechanischen Verhalten von granularen Böden unter Scherung mit Synchrotron-Röntgen-Mikrotomographie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Immobilisierung einzelner Makromoleküle in mikrofluidischen Geräten und zur Quantifizierung von Veränderungen in ihren Konformationen unter Scherfluss. Dieses Protokoll ist nützlich, um die biomechanischen und funktionellen Eigenschaften von Biomolekülen wie Proteinen und DNA in einer Strömungsumgebung zu charakterisieren.

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Die kovalente Befestigung von Sondenmolekülen an aatomaren Kraftmikroskopie(AFM)-Auslegerspitzen ist eine wesentliche Technik für die Untersuchung ihrer physikalischen Eigenschaften. So können wir die Dehnkraft, Desorptionskraft und Länge von Polymeren über die AFM-basierte Einzelmolekülkraftspektroskopie mit hoher Reproduzierbarkeit bestimmen.

Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Hier wird ein umfassendes Protokoll zur Durchführung von ultraschnellen Kraftklemmexperimenten an prozessiven Myosin-5-Motoren vorgestellt, das leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von prozessiven Motoren ausgeweitet werden könnte. Das Protokoll beschreibt alle notwendigen Schritte, von der Einrichtung der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zur Datenerfassung und Analyse.

Analyse der mechanoenzymatischen Eigenschaften prozessiver Myosine mit ultraschneller Kraftklemmenspektroskopie

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Erfahren Sie die Ensemble-Force-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Liganden-Bindungen durch Scherkräfte. Diese hochdurchsatzfähige Methode ermöglicht Echtzeit-Erfassung biomolekularer Strukturen.

Ensemble Force Spektroskopie durch Scherkräfte

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