Freilandfähiger Candidatus liberibacter asiaticus-Nachweis mittels Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a

Huang long bing, abgekürzt als HLB. Es ist eine verheerende Zitruskrankheit weltweit. In den meisten Zitrusländern wie China und den USA wird HLB durch das phloembeschränkte Bakterium Candidatus Liberibacter asiaticus, abgekürzt CLas, verursacht.

Die Früherkennung von CLas war wichtig für Züchter, um frühzeitig eingreifen und die Ausbreitung von Krankheiten zu verhindern. Hier haben wir eine neue Methode für die schnelle und portable HLB-Diagnose entwickelt, die mit der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und dem CRISPR-Cas12a-System kombiniert wird. Wir nannten es CLas-DETECTR.

Die Sensitivität unserer Plattform ist viel höher als die PCR. Darüber hinaus zeigt es ein ähnliches Ergebnis mit qPCR, wenn die Blattproben verwendet wurden. Im Vergleich zu den herkömmlichen CLas-Detektionen kann unsere Methode in 90 Minuten fertiggestellt werden und arbeitet in einem isothermen Zustand.

Das Ergebnis kann auch durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld visualisiert werden. Der CLas-DETECTR enthält vier Schritte: Lösungsvorbereitung, Gesamt-DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten, isotherme DNA-Amplifikation und die Ergebnisse der Visualisierung. Das Schema des CLas-DETECTR-Assays ist hier dargestellt.

Puffer A, Lösung B und Lösung C werden wie im Protokoll beschrieben vorbereitet. Um Zeit zu sparen und diese Methode für den CLas-Nachweis im Feld geeignet zu machen, wurde der E.coli-Polyethylenglykol-basierte Ansatz verwendet, um rohe Pflanzenextrakte für die DNA-Amplifikation zu erhalten. Zitrusblätter werden im Werkzeug verwendet.

Stanzen Sie die wenigen Blattscheiben aus dem Blatt. Legen Sie die Blattscheiben in ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Rohr. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Puffer A in das Röhrchen hinzu.

Die Blattscheiben manuell mit einem Kunststoffstab glatt schleifen. Lassen Sie die Röhre 10 Minuten ungestört. Der Überstand wird anschließend zur DNA-Amplifikation aufgebracht.

Für die isotherme DNA-Amplifikation einen Mikroliter Überstand aus Schritt 2.3 und einen Mikroliter Magnesiumacetat in Lösung B geben und gut mischen. Im Labor inkubieren Sie sie in einem einfachen Inkubator bei 37 Grad für 15 Minuten. Um die Ergebnisse zu visualisieren, fügen Sie 10 Mikroliter der Mischung aus Schritt 3.2 in Lösung C hinzu und mischen Sie gut.

Inkubieren Sie sie im 37-Grad-Inkubator für 60 Minuten. Tragen Sie eine Schutzbrille und beobachten Sie das grüne Fluoreszenzsignal durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät. Um die Spezifität von CLas-DETECTR zu testen, wurden zunächst reine Kolonien von Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.

Citri, der Erreger des Zitruskrebses, und Burkholderia stabilis Stamm 1440, der in unserem Labor isoliert wurde, wurden verwendet, um ihre genomische DNA zu extrahieren. Dann wurden diese drei Bakterien genomische DNA und die CLas-positive Newhall-Blätter genomische DNA dem CLas-DETECTR-Test unterzogen. Um die Sensitivität von CLas-DETECTR zu testen, wurde eine Reihe von CLas-DNA-Fragmentverdünnungen mittels PCR, CLas-DETECTR und qPCR nachgewiesen, wie im Protokoll beschrieben. Nach dem Spezifitäts- und dem Sensitivitätstest wurde die CLas-DETECTR-Methode verwendet, um das Vorhandensein der CLas im Feld nachzuweisen.

Blattproben von Newhall Süßorangenbaum, der in der Keimplasma-Ressourcengärtnerei auf dem Campus der Gannan Normal University, Jiangxi, China, angebaut wurde. qPCR, eine überzeugende CLas-Nachweismethode, die üblicherweise im Labor verwendet wird, wurde ebenfalls angewendet. Die Blattproben von HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Newhall-Bäumen, bei denen das Vorhandensein der CLas in unserem Labor bestätigt wurde, wurden dem CLas-DETECTR-Test unterzogen.

Das grüne Fluoreszenzsignal wurde in der HLB-infizierten Probe erfasst, nicht jedoch in der HLB-nicht infizierten und negativen Kontrolle. Wir bestimmten die Spezifität von CLas-DETECTR mit Nukleinsäuren, die aus anderen Bakterien extrahiert wurden. Im CLas-DETECTR-Assay zeigten nur gDNA, die aus CLas-positiven Newhall-Blättern extrahiert wurde, grün fluoreszierende Signale.

gDNA, extrahiert aus Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri und Burkholderia stabilis Stamm 1440 nicht, was bedeutet, dass der CLas-DETECTR CLas spezifisch nachweisen kann. Wir testeten auch die Empfindlichkeit von CLas-DETECTR mit einer Reihe von CLas-DNA-Verdünnungen, die im Protokoll aufgeführt sind.

PCR kann 201 Kopien pro Megaliter nachweisen. Auf der anderen Seite kann CLas-DETECTR 2,01 Kopien pro Megaliter detektieren, was auf seine Verfügbarkeit als empfindliche Felddiagnose hindeutet. qPCR kann 0,201 Kopien pro Megaliter nachweisen und der Ct-Wert ist höher als 36.

CLas-DETECTR ist also zwei Größenordnungen empfindlicher als herkömmliche PCR und eine Größenordnung weniger empfindlich als qPCR, wenn verdünnte CLas-spezifische Amplicons verwendet wurden. Schließlich wurde die Machbarkeit des CLas-DETECTR für Feldproben erneut untersucht und seine Empfindlichkeit mit qPCR verglichen. In Zahlen, sehen wir.

Wir können sehen, dass der Ct-Wert höher als 36 ist, wenn die CLas-Konzentration weniger als 0,2 Kopien pro Megaliter beträgt, was eine sehr niedrige Konzentration ist. Unter den 15 Proben betrug der Ct-Wert der mittels qPCR nachgewiesenen Proben 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 und 14 weniger als 36. Ein scheinbares grünes Fluoreszenzsignal wurde beobachtet.

Wenn andererseits der Ct-Wert der mittels qPCR nachgewiesenen Proben 6, 7, 9, 12 und 15 unbestimmt war, wurden keine grün fluoreszierenden Signale beobachtet. Darüber hinaus wurden schwache grün fluoreszierende Signale beobachtet, wenn der CT-Wert der Probe 5 und 11, die durch qPCR detektiert wurden, höher als 36 war. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere Plattform ein schnelles, robustes und empfindliches Werkzeug für die HLB-Diagnose im Feld ist.