Herstellung von zytoplasmatischen und nukleären langen RNAs aus primären und kultivierten Zellen

Dieses Protokoll ist notwendig, um die unterschiedlichen Rollen definierter biochemischer Elemente im Zellkern und im Zytoplasma zu bewerten und intrazelluläre Interaktionen zwischen diesen Domänen innerhalb verschiedener Zelllinien zu analysieren. Diese Technik verwendet alltägliche Laborgeräte und Reagenzien, um die zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen effizienter zu trennen. Dieses Protokoll kann dies kostengünstiger und schneller als andere Protokolle tun.

Mit zunehmender Verbreitung von Studien zu zytoplasmatischen und nukleären Wechselwirkungen können die Auswirkungen der Lokalisierung auf intrazelluläre Ereignisse besser verstanden werden. Der Austausch zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern kann analysiert werden, was darauf hinweist, ob bestimmte Moleküle während dieses Austauschs zur Krebsentstehung führen können, wie Studien an Kernproteinen gezeigt haben. Der kritischste Schritt im Protokoll besteht darin, die Konzentration des Lysepuffers auf eine geeignete Konzentration zu ändern.

Da die Verwendung von Lysepuffer weitgehend von der Störung der Zellmembranen abhängt, gibt es natürliche Varianten in der Wirksamkeit von Lysepuffer auf verschiedenen Zelllinien. Zu Beginn pelletieren Sie die Zellen mit 1,5-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugation für fünf Minuten bei 2000 G.Entsorgen Sie den Überstand mit einer Aspirationspipette. Resuspendieren Sie das Pellet in 300 Mikroliter eiskaltem Lysepuffer.

Dann drehen Sie die Röhrchen zwei Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von etwa 12.000 G bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und legen Sie ihn in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Das verbleibende Pellet ist die Kernfraktion.

Als nächstes geben Sie 500 Mikroliter eiskaltes PBS in das Pellet und zentrifugieren Sie es bei 2000 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Um die Trennung der Kompartimente mittels qPCR zu bestätigen, wandeln Sie zunächst die RNA mit einem handelsüblichen Kit in komplementäre DNA um. Bereiten Sie den Reverse-Transkriptase-Mastermix vor.

Fügen Sie Template-RNA hinzu. Inkubationsreaktionen in einem Thermocycler. Fahren Sie mit der Durchführung einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion und -analyse fort.

Beginnen Sie mit der Verdünnung der cDNA-Synthese mit DEPC-Wasser, um eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter zu erreichen. Bereiten Sie mit einem PCR-Mastermix die Reaktion für jede Probe anhand manueller Anweisungen vor. Erwerben Sie kommerzielle Sonden, die zum Nachweis der zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionierung erforderlich sind.

Verwenden Sie MALAT1 als Kernmarker und TUG1 als zytoplasmatischen Marker. Berechnen Sie das Volumen jeder Komponente, indem Sie jede Komponente für jedes der technischen Replikate für die einzelne Probe mit drei multiplizieren. Erfassen Sie für jede nukleare und zytoplasmatische Probe die Mischungen Kernfraktion mit MALAT1, zytoplasmatische Fraktion mit MALAT1, Kernfraktion mit TUG1 und zytoplasmatische Fraktion mit TUG1.

Vortex, um Lösungen kurz zu mischen und 20 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung einer optischen Reaktionsplatte zu überführen. Decken Sie die Platte mit einer durchsichtigen Klebefolie ab, die für die qPCR verwendet wird, und zentrifugieren Sie die Platte kurz, um Luftblasen zu entfernen, und schleudern Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf das 300-fache G. Wählen Sie mit einer Konstruktions- und Analysesoftware die Standardkurve für die Zyklusparameter aus.

Wählen Sie mit der qPCR-Software Setup ausführen aus. Wählen Sie auf der Eigenschaftenseite der Datendatei die Parameter Methode und Eingabezyklus aus. Wählen Sie nach der Eingabe der Zyklusparameter die Registerkarte "Platte" aus und geben Sie die zu verarbeitenden Proben ein.

Wählen Sie Ausführen starten. Erstellen Sie nach Abschluss des Laufs eine Datentabelle mit dem Probennamen, dem Zielnamen und dem Quantifizierungszyklus. Beginnen Sie mit den MALAT1-Proben, um den Kernanteil zu berechnen.

Subtrahieren Sie die zytoplasmatische Fraktion MALAT1 von der Kernfraktion MALAT1. Fahren Sie mit den MALAT1-Proben fort, um den zytoplasmatischen Anteil zu berechnen. Subtrahieren Sie die MALAT1-Kernfraktion von der zytoplasmatischen MALAT1-Fraktion und berechnen Sie dann die beiden auf negative Delta-CQ angehobenen Fraktionen. Führen Sie die Berechnungen mit TUG1-Stichproben durch.

Wenn TUG1 als Positivkontrolle für zytoplasmatische Elemente vorhanden ist, wird erwartet, dass die zytoplasmatischen Fraktionierungsniveaus höher sind als die Kernfraktionierungsniveaus. Ein negatives Ergebnis, bei dem in der Probe mit MALAT1 eine zytoplasmatische Fraktionierung beobachtet wird. Dies deutet auf eine Kontamination von RNA hin, die aus der Kernfraktion isoliert wurde, möglicherweise aufgrund zu niedriger oder zu hoher Lysekonzentrationen.

MALAT1 und TUG1 zeigten die höchste Korrelation mit der nuklearen und zytoplasmatischen Trennung, was durch einen Western-Blot und eine RNA-Elektrophorese bestätigt wurde, die die Reinheit und Qualität der Proben bestätigte. Zusätzlich kann die Reinheit von nukleären und zytoplasmatischen Extrakten durch einen Western Blot unter Verwendung von Lamin als Marker für die Kernfraktion und Alpha-Tubulin als positivem Marker für die zytoplasmatische Fraktion nachgewiesen werden. In der zytoplasmatischen RNA-Elektrophorese wurde kein Peak beobachtet, was eine hohe Qualität und eine geringe oder keine Kontamination in der zytoplasmatischen RNA-Probe zeigt.

Die Verwendung von Lysepuffer ist entscheidend für eine ordnungsgemäße Fraktionierung, und die Optimierung der Lysepufferkonzentration auf die gewünschte Zelllinie von Interesse ist unerlässlich. Diese Technik ermöglicht die gezielte Untersuchung der nukleären und zytoplasmatischen Wechselwirkung, die auf eine Vielzahl von Forschungsthemen anwendbar ist und ein besseres Verständnis dafür ermöglicht, wie die Lokalisierung bestimmter biologischer Elemente mit ihrer Funktion korrelieren kann.