Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen
7. April 2023
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines neuen, schnellen optischen Bildgebungsgeräts für die makroskopische Photolumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von Proben mit langem Zerfall. Die Integrations-, Bildaufnahme- und Analyseverfahren werden ebenso beschrieben wie die Präparation und Charakterisierung der Sensormaterialien für die Bildgebung und die Anwendung des Imagers bei der Untersuchung biologischer Proben.
Unser Protokoll bietet eine detaillierte 2D-Kartierung der Phosphoreszenzlebensdauer und der Sauerstoffkonzentration in makroskopischen Objekten, insbesondere in lebendem tierischem Gewebe und ganzen Tieren, mit Hilfe spezieller Sonden und Sensormaterialien. Diese Informationen sind für viele Forschungsbereiche wichtig. Unser Protokoll verwendet ein integriertes und kompaktes Bildgebungsmodul, das im TCSPC-Modus arbeitet und eine einfache und genaue Visualisierung der Lebensdauer und Sauerstoffverteilung in komplexen biologischen Proben, wie z. B. lebendem Gewebe, ermöglicht.
Nehmen Sie den Cricket-Adapter und inspizieren Sie ihn von verschiedenen Seiten. Entfernen Sie den vorderseitigen C-Mount-Adapter, um den Photonis PP0360EF-Verstärker im Cricket zu zeigen, und setzen Sie dann den C-Mount-Adapter wieder ein. Entfernen Sie den vorderseitigen C-Mount-Adapter des Cricket und setzen Sie den 650 plus/minus 50 Nanometer Emissionsfilter ein.
Reparieren Sie es, indem Sie die C-Halterung wieder einsetzen. Verbinden Sie dann das TPX-Kameramodul mit drei Kameras über die Ringadapter mit der Rückseite des Cricket-Moduls. Verbinden Sie das Objektiv über den C-Mount-Adapter mit der Vorderseite des Cricket-Moduls.
Schließen Sie die LED an eine Stromversorgung und einen Impulsgeber an. Montieren Sie nun die superhelle 390-Nanometer-LED an einem Pfosten, der an einem Steckbrett in der Blackbox befestigt ist. Schalten Sie die LED ein und fokussieren Sie sie, um eine effektive und gleichmäßige Anregung der abgebildeten Probe zu gewährleisten.
Montieren Sie die Kamerabaugruppe oben auf der optischen Blackbox mit Blick nach unten in Richtung des Tisches, auf dem die Proben abgebildet werden sollen. Schließen Sie die Kamera und die LED an Zwei-Puls-Generatoren und ein Vierkanal-Oszilloskop an. Synchronisieren Sie mit den Einstellungen des Oszilloskops und der Impulsgeneratoren die an die Kamera gesendeten Impulse und die LED.
Verwenden Sie das spezielle Kabel und die Buchse am Cricket-Gerät, um den Verstärker an ein Standardnetzteil anzuschließen, und stellen Sie die Verstärkung auf 2,7 Volt ein. Positionieren Sie die Probe vor dem Kameraobjektiv. Schalten Sie dann die Kamera und alle elektrischen Module mit Ausnahme des Verstärkers ein.
Aktivieren Sie die SOFI-Software, um die Betriebsparameter wie Fokussierung und Probenausrichtung einzustellen. Stellen Sie in den Modulen die Bildbelichtung auf 0,01 Sekunden ein. Wählen Sie Unendliche Frames und stellen Sie den Pixelbetriebsmodus auf Zeit über Schwellenwert ein.
Gehen Sie dann zur Vorschau und wählen Sie Aktives Modul, um das Medipix/Timepix-Rahmenfenster zu öffnen. Passen Sie im nächsten Schritt nach dem Start der Aufnahme die Farbskala an und drehen Sie das Bild in die gewünschte Ausrichtung. Schalten Sie danach das Licht im Raum aus und schalten Sie den Verstärker ein.
Fokussieren Sie die Kameraoptik mit den Fokussierfunktionen des Objektivs und des Cricket-Adapters auf den Probentisch, um klare Bilder von Proben mit gutem Kontrast und guter Helligkeit zu erzeugen. Sobald der Fokus abgeschlossen ist, schließen Sie die SOFI-Software. Gehen Sie dann zum Terminal, führen Sie die Befehle der benutzerdefinierten Software aus, um die Rohdaten im Binärformat zu erfassen, und schließen Sie das Terminal.
Öffnen Sie ein neues Terminal, um die erfassten Daten zu verarbeiten. Laden Sie die Datendatei und führen Sie den Datenreduzierer aus. Analysieren Sie die Nachbearbeitungsdaten mit einem speziellen Programm, das in der Programmiersprache C geschrieben ist und die Daten in eine ICS-Bilddatei schreibt.
Öffnen Sie anschließend die ICS-Bilddateien mit der frei verfügbaren Software Time Resolved Imaging und verwenden Sie zwei Exponentialfunktionen, um die Phosphoreszenzzerfälle anzupassen. Öffnen Sie zum Schluss die Fitted. ICS-Bilddateien mit der verfügbaren Bildanalyse-Software.
Generieren Sie Bilder mit Phosphoreszenzlebensdauer mithilfe von Lookup-Tabellen und kodieren Sie sie in einer Pseudofarbskala. Verwenden Sie die Funktion Messen, um die durchschnittlichen Lebensdauerwerte für das gesamte Bild oder die relevanten Bereiche zu berechnen. Phosphoreszenzintensität und Phosphoreszenzlebensdauer bildgebende Mikroskopiebilder des Platin-Octaethylporphyrin-Farbstoff-Sensorspots im sauerstoffhaltigen und sauerstoffarmen Zustand werden gezeigt.
Stellen Sie sicher, dass der richtige Emissionsfilter im Cricket montiert ist und die richtige LED, Kabelverbindungen und Impulseinstellungen verwendet werden. Derzeit ist dieses Protokoll auf Tiermodelle beschränkt, kann aber potenziell zur Diagnose und Behandlung pathologischer Zustände im Zusammenhang mit Gewebehypoxie wie Krebs, Schlaganfall und Entzündungen angewendet werden.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt einen neuartigen optischen Bildgebungsapparat für makroskopische photolumineszenzlebensdauerbasierte Bildgebung vor, der besonders nützlich für biologische Proben wie lebendes Tiergewebe ist. Das Protokoll ermöglicht eine detaillierte Kartierung der Phosphoreszenzlebensdauer und Sauerstoffkonzentration, was entscheidend für das Verständnis verschiedener biologischer Prozesse ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Biologische Bildgebung
- Analyse der Phosphoreszenzlebensdauer
- Sauerstoffkonzentrationsmessung
Hintergrund
- Die makroskopische Bildgebung ist entscheidend für die Untersuchung komplexer biologischer Proben.
- Bestehende Methoden können langsam zerfallende Proben möglicherweise nicht effizient analysieren.
- Ziel dieser Studie ist es, Visualisierungstechniken in lebendem Gewebe zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Optische Bildgebung im Zeit-korrelierten Einzelphotonenzählmodus (TCSPC)
- Anwendung an lebendem Tiergewebe
- Verwendung maßgeschneiderter Bildgebungsmodule und Datenverarbeitungssoftware
Hauptergebnisse
- Effektive Visualisierung von Lebensdauer- und Sauerstoffverteilung
- Möglichkeit zur Erzeugung von Phosphoreszenz-Lebensdauer-Bildern mit hohem Kontrast
- Erfolgreiche Anwendung bei der Beobachtung hypoxischer Bedingungen im Gewebe
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert einen innovativen Bildgebungsansatz für die biologische Forschung.
- Mögliche Anwendungen zur Diagnose und Behandlung von Erkrankungen im Zusammenhang mit Gewebehypoxie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Kartierung der Gewebeoxygenierung mittels Phosphoreszenz-Lebensdauernbildgebung adressiert ein kritisches Bedürfnis in der präklinischen Forschung nach einer genauen Beurteilung von Hypoxie. Diese Fähigkeit erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Krankheitsmodellierung und unterstützt die mechanistische Entlastung bei der Zielvalidierung in der Onkologie und Stoffwechselforschung. Die schnelle, hochsensible Bildgebung der Plattform ermöglicht eine robuste Bewertung der Gewebemikroumgebungen und liefert damit Entscheidungsgrundlagen für frühe Portfolioentscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Gewebeoxygenierung als funktionellen Biomarker in Krankheitsmodellen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem räumlich aufgelöste Hypoxiedaten in lebendem und ex vivo-Gewebe bereitgestellt werden.
- Erleichtert die Zielvalidierung, indem die Sauerstoffverteilung mit der Aktivität biologischer Signalwege verknüpft wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Gewebemodelle für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening unter kontrollierten Sauerstoffzuständen vor.
- Liefert reproduzierbare, quantitative Lebensdauermessungen zur Assay-Standardisierung.
- Ermöglicht die Bereitschaft für Hochdurchsatzanalysen, indem die Bildaufnahmezeit auf unter 20 Sekunden pro Probe reduziert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt präklinische Modelle auf krankheitsrelevante Hypoxie-Signaturen ab, um die Translation zu gewährleisten.
- Ermöglicht die metabolische Bildgebung sowohl in ex vivo- als auch in lebenden Tiermodellen.
- Liefert quantitative Endpunkte für die risikoadjustierte Weiterentwicklung therapeutischer Kandidaten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Bildgebungsplattform integriert die frühe Entdeckung bis hin zur präklinischen Validierung und unterstützt Arbeitsabläufe bei der Target-Validierung, der Leitstruktur-Identifizierung und der translationsmedizinischen Forschung.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung von sauerstoffabhängigen Mechanismen in Gewebemodellen.
- Screening: Bietet standardisierte, quantitative Messgrößen für die Assay-Entwicklung und die Bewertung von Verbindungen.
- Analytik: Erzeugt räumlich aufgelöste, quantitative Lebensdauer- und Sauerstoffkonzentrationskarten für den Vergleich.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem Bildgebungsdaten mit krankheitsrelevanten Hypoxie-Biomarkern abgeglichen werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine modulare, umkonfigurierbare Bildgebungsfunktion, die an verschiedene Sonden und Gewebesysteme angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in Modellen hypoxiegetriebener Erkrankungen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht schnelle, reproduzierbare Bildgebung mit standardisierten Protokollen und flexibler Kompatibilität von Sonden.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch von Projekten sowie die Kapitalallokation, indem robuste quantitative Endpunkte bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf validierten Daten zur Gewebeoxygenierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der optischen Bildgebung und der Analyse der Phosphoreszenz-Lebensdauer.
- Benötigt Zugang zu spezialisierten Messgeräten, einschließlich Kameras mit TCSPC-Funktion und Bildverstärkern.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei den Bildgebungsprotokollen und Datenanalyse-Workflows über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Anpassbar an verschiedene Gewebemodelle und Sondenchemikalien bei entsprechender Konfiguration.
- Zurzeit auf Tiermodelle beschränkt; eine Übertragung auf andere Systeme erfordert weitere Validierungen.
