Name: Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Erfahren Sie die makroskopische Phosphoreszenzlebensdauer-Bildgebung mit TCSPC-Modus für biologische Gewebe. Diese Methode ermöglicht präzise Sauerstoffkonzentrationsmessungen und Visualisierung hypoxischer Zustände in lebenden Tieren.

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Die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit durch die Science Foundation Ireland, die Zuschüsse SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 und 18/SP/3522 sowie Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) wird dankbar gewürdigt.

Alle Verfahren mit Tieren wurden im Rahmen von Zulassungen der Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irland) gemäß der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften (2010/63/EU) durchgeführt und von der Ethikkommission für Tierversuche des University College Cork genehmigt.
1. Probenvorbereitung
<ol><li>Färbung mit der Sonde von lebenden Gewebeproben ex vivo<ol><li>Für Ex-vivo-Anwendungen werden frisch isolierte Gewebeproben von 4 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen verwendet.</li>
		<li>Am Tag des Experiments wird eine Maus durch Enthauptung eingeschläfert und etwa 10 mm große Fragmente des Dickdarms (Dickdarm) schnell präpariert. Waschen Sie sie sofort mit PBS-Puffer, legen Sie sie in DMEM-Medium, das mit 10 mM Hepes-Puffer (pH 7,2) ergänzt ist, und inkubieren Sie sie bei 37 °C36.</li>
		<li>Für die Oberflächenfärbung der Serosalseite des Darms werden die lebenden Gewebeproben in eine Minischale überführt, 2 ml vollständige DMEM-Sonde mit 1 mg/ml NanO2-IR aufgetragen, um die Gewebeproben zu bedecken, und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. HINWEIS: Zellen im postmortalen Gewebe bleiben in Kultur viele Stunden am Leben. NaNO2-IR zeigt eine geringe Zytotoxizität, so dass alle Experimente innerhalb von 4 h nach der Gewebeisolierung abgeschlossen wurden.</li>
		<li>Für eine intraluminale Ex-vivo-Färbung des Tiefengewebes werden die Darmstücke in eine trockene Petrischale gegeben und überschüssiges DMEM mit Filterpapier entfernt.</li>
		<li>Injizieren Sie 1 μl DMEM mit 1 mg/ml NanO2-IR 35 mit einer Hamilton-Spritze in das Lumen und inkubieren Sie die Proben15 Minuten oder bis zu 4 Stunden. HINWEIS: NaNO2-IR zeigt geringfügige zytotoxische Langzeitwirkungen; Daher sollten alle Experimente innerhalb von 4 h nach der Gewebeisolierung abgeschlossen sein.</li>
	</ol></li>
	<li>Präparation von gefärbtem Tumorgewebe bei lebenden Tieren<ol><li>Für In-vivo-Anwendungen werden CT26-Zellen 18 h lang in einem serumfreien Medium mit NaNO2-IR-Sonde bei 0,05 mg/ml vorgefärbt.</li>
		<li>Nehmen Sie eine Maus, rasieren Sie den Injektionsbereich in der rechten Flanke und injizieren Sie mit einer Spritze 200 μl einer Mischung aus 1 × 105 nicht gefärbten Zellen und 1 × 105 Zellen, die mit NanO2-IR vorgefärbt sind.</li>
		<li>Lassen Sie die Tumore in den Mäusen wachsen, indem Sie die Tumorgröße mit einem Messschieber und das Tiergewicht regelmäßig überwachen37. Die Tiere mit transplantierten Tumoren sind am siebten Tag des Tumorwachstums bereit für die Bildgebung. HINWEIS: Das Tumorvolumen wurde mit Gleichung (1) berechnet: V = (L × W 2)/2 (1) wobei L der Durchmesser des Tumors und W is der Durchmesser senkrecht zum Durchmesser L ist.</li>
		<li>Opfern Sie die Tiere durch Zervixluxation kurz vor der Bildgebung.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Einrichtung der PLIM-Bildgebung
<ol><li>Nehmen Sie den Cricket-Adapter und entfernen Sie den C-Mount-Adapter auf der Rückseite, um Zugang zum Verstärkergehäuse im Inneren zu erhalten. Setzen Sie den Bildverstärker MCP-125 in dieses Fach ein und setzen Sie den C-Mount-Adapter wieder ein.</li>
	<li>Entfernen Sie den vorderseitigen C-Mount-Adapter des Cricket, setzen Sie den 760-nm- ± 50-nm-Emissionsfilter ein und befestigen Sie ihn, indem Sie den C-Mount wieder einsetzen.</li>
	<li>Verbinden Sie das Tpx3Cam-Kameramodul über den C-Mount-Adapter mit der Rückseite des Cricket-Moduls</li>
	<li>Verbinden Sie das Objektiv über den C-Mount-Adapter mit der Vorderseite des Cricket-Moduls.</li>
	<li>Montieren Sie die gesamte Kamerabaugruppe auf der optischen Blackbox mit Blick nach unten auf den Tisch, auf dem die Proben abgebildet werden sollen (Abbildung 1).</li>
	<li>Montieren Sie die superhelle LED mit 624 nm an einem Pfosten, der mit einem Steckbrett in der Blackbox verbunden ist.</li>
	<li>Schließen Sie die LED an eine Stromversorgung und einen Impulsgeber an. Schalten Sie die LED ein und fokussieren Sie sie, um eine effektive und gleichmäßige Anregung der abgebildeten Proben zu gewährleisten.</li>
	<li>Schließen Sie die Kamera an einen anderen Impulsgeber an und synchronisieren Sie die an die Kamera gesendeten Impulse mit der LED38.</li>
	<li>Schließen Sie den Verstärker mit dem speziellen Kabel und der Buchse am Cricket-Gerät an ein Standardnetzteil an und stellen Sie die Verstärkung auf 2,7 V ein.</li>
	<li>Fokussieren Sie die Kameraoptik mit den Fokussierfunktionen des Objektivs und des Cricket-Adapters auf den Probentisch, um klare Bilder von Proben mit gutem Kontrast und guter Helligkeit zu erzeugen.</li>
	<li>Für die Verwendung von Imagern mit Pt-Porphyrin-Farbstoffen ersetzen Sie die 625-nm-LED durch eine 390-nm-LED zur Anregung und ersetzen Sie den 760-nm- ± 50-nm-Filter durch einen 650-nm- ± 50-nm-Filter im Cricket-Modul.</li>
</ol>3. Bildaufnahme
<ol><li>Platzieren Sie die Probe vor dem Kameraobjektiv. Anmerkungen: Verwenden Sie einen X-Y-Z-verstellbaren Tisch als Probenhalter, um die Probenposition für eine gute Fokussierung einzustellen.</li>
	<li>Schalten Sie alle Lichter im Raum aus.</li>
	<li>Schalten Sie die Sophy-Software ein, um die Betriebsparameter wie Fokussierung und Probenausrichtung einzustellen. HINWEIS: Die Sophy-Software wird zusammen mit der Kamera bereitgestellt, um die Bildgebungsparameter einzustellen und die Daten aufzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Software mit der Kamera verbunden ist, indem Sie den Kameracode überprüfen. Für die Datenerfassung haben wir jedoch ein anderes Programm verwendet.</li>
	<li>Wählen Sie unter Module die Option " Unendliche Frames" aus, und stellen Sie den Pixelbetriebsmodus auf " Zeit über Schwellenwert" ein.</li>
	<li>Wechseln Sie unter Module zu Vorschau, und wählen Sie Aktives Modul aus. Dadurch wird das Fenster Medpix/Timpix Frames geöffnet.</li>
	<li>Ändern Sie in diesem Fenster die Farbskala und drehen Sie das Bild in die gewünschte Ausrichtung.</li>
	<li>Schalten Sie den Verstärker ein und starten Sie die Aufnahme. Anmerkungen: Verwenden Sie den Aufnahmebildschirm der Sophy-Software, um die Ausrichtung und den Fokus der Probe visuell zu bestätigen und die LED-Anregungsparameter für die Aufzeichnung zu optimieren.</li>
	<li>Stoppen Sie die Aufnahme und schließen Sie die Sophy-Software.</li>
	<li>Gehen Sie zum Terminal und verwenden Sie die speziell entwickelte Software, um die Rohdaten im Binärformat zu erfassen und nachzubearbeiten (https://github.com/svihra/TimePix3).<ol><li>Führen Sie im Terminal die folgenden Befehle aus, um die Daten aufzuzeichnen: CD-Dokument/SPIDR/trunk/Release/ 
		 Ls ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Name der Datei} - t {Erfassungszeit} HINWEIS: Überprüfen Sie nach der Eingabe von "ls" die Liste der Dateien im aktuellen Verzeichnis. Vergewissern Sie sich, dass Tpx3daq angezeigt wird.</li>
		<li>Warten Sie, bis alle Frames aufgezeichnet wurden.</li>
		<li>Um die Daten zu verarbeiten, führen Sie die folgenden Befehle im Terminal aus: cd Dokumente/Datenverarbeitung/Timepix3/Timepix3/ wurzel . L Datenprozess.cpp++ .x DRGUI. C</li>
		<li>Warten Sie, bis sich ein RRGui-Fenster öffnet. Wählen Sie alle Variablen auf der linken Seite und Alle Daten, Einzelne Datei und Schwerpunkt auf der rechten Seite aus.</li>
		<li>Wählen Sie die Datei aus, die verarbeitet werden soll, und führen Sie die Datenreduzierung aus. HINWEIS: Alle verarbeiteten Dateien werden im selben Ordner wie die Rohdatei angezeigt.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>Analysieren Sie die nachbearbeiteten Daten mit einem speziellen Programm, das in C-Sprache geschrieben ist und die Daten in eine .ics Bilddatei (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam) schreibt.</li>
	<li>Öffnen Sie die .ics Bilddateien mit der frei verfügbaren Software Time Resolved Imaging (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie zwei Exponentialfunktionen , um die Phosphoreszenzzerfälle anzupassen.</li>
	<li>Öffnen Sie die passenden .ics Bilddateien mit der verfügbaren Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Generieren Sie mithilfe von Lookup-Tabellen Bilder mit Phosphoreszenzlebensdauer und kodieren Sie sie in einer Pseudofarbskala (z. B. blaue Farbe für kurze Lebensdauer und rot für lange Lebensdauern). Verwenden Sie die Funktion Messen , um die durchschnittlichen Lebensdauerwerte für das gesamte Bild oder bestimmte Interessenbereiche (ROIs) zu berechnen.</li>
	<li>Rechnen Sie die Lebensdauerwerte in die Sauerstoffkonzentration um, indem Sie die Gleichung verwenden, die sich aus der Anpassung derO2-Kalibrierung der Sonde36 ergibt. HINWEIS: Für diese Arbeit wurde Gleichung (2) verwendet: O2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)</li>
</ol>

<ol><li>Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+oxygen+and+hypoxia+in+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).</li>
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<li>Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+imaging+of+living+cells+and+tissues+using+luminescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+C%3A+Photochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).</li>
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<li>Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+fluorescence+and+phosphorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging.</a> Applied Physics Letters. 108, 091111(2016).</li>
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<li>Babilas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+pO2+imaging+during+tourniquet-induced+forearm+ischemia+using+planar+optical+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors.</a> Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).</li>
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<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+O2+concentration+in+ex-vivo+tissue+samples+on+a+fast+PLIM+macro-imager%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager.</a> Scientific Reports. 10, 19006(2020).</li>
<li>Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+tumor+volume+measurement+in+the+awake%2C+manually+restrained+mouse+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+luminescence+lifetime+macro-imager+based+on+a+Tpx3Cam+optical+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera.</a> Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).</li>
<li>Papkovsky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorescent+polymer+films+for+optical+oxygen+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors.</a> Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).</li>
<li>Sen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+planar+phosphorescence+based+oxygen+sensors+on+a+TCSPC-PLIM+macro-imager%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators%2C+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager.</a> Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459(2020).</li>
<li>Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging.</a> Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die obigen Protokolle geben eine detaillierte Beschreibung des Zusammenbaus des neuen Imagers und seines Betriebs im Mikrosekunden-FLIM/PLIM-Modus. Die TCSPC-basierte Tpx3Cam-Kamera der neuen Generation, die über den opto-mechanischen Adapter Cricket mit dem Bildverstärker, dem Emissionsfilter und dem Makroobjektiv gekoppelt ist, ergibt ein stabiles, kompaktes und flexibles optisches Modul, das einfach zu bedienen ist. Es wurde gezeigt, dass der Imager bei einer Reihe verschiedener Proben und analytischer Aufgaben gut fu...

O2 ist einer der wichtigsten Umweltparameter für lebende Systeme, und die Kenntnis der Verteilung vonO2 und seiner Dynamik ist für viele biologische Studien wichtig 1,2,3. Die Bestimmung der Sauerstoffversorgung des Gewebes mit Hilfe der phosphoreszierenden Sonden 4,5,6,7,8 und PLIM 9,10,11,12,13 erfreut sich in der biologischen und medizinischen Forschung zunehmender Beliebtheit 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dies liegt daran, dass PLIM im Gegensatz zu Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzintensitätsmessungen nicht von externen Faktoren wie Sondenkonzentration, Photobleichung, Anregungsintensität, optischer Ausrichtung, Streuung und Autofluoreszenz beeinflusst wird.
Aktuelle O2 PLIM-Plattformen sind jedoch durch ihre Empfindlichkeit, Bildaufnahmegeschwindigkeit, Genauigkeit und allgemeine Benutzerfreundlichkeit eingeschränkt. Die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) in Kombination mit einem Raster-Scanning-Verfahren wird häufig in PLIM- und FLIM-Geräten (Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie) verwendet20,21,22. Da PLIM jedoch eine lange Pixelverweilzeit (im Millisekundenbereich) erfordert, ist die Zeit der Bildaufnahme viel länger als für FLIM-Anwendungen erforderlich 20,22,23. Andere Techniken, wie z. B. geschlossene CCD/CMOS-Kameras, haben keine Einzelphotonenempfindlichkeit und niedrige Bildraten20,24,25,26. Darüber hinaus werden die bestehenden PLIM-Systeme meist im mikroskopischen Format verwendet, während makroskopische Systeme weniger verbreitet sind27.
Der TCSPC-basierte PLIM-Makro-Imager28 wurde eingerichtet, um viele dieser Einschränkungen zu überwinden. Das Design des Imagers wurde durch die Verwendung eines neuen opto-mechanischen Adapters, Cricket, erheblich erleichtert, der über Folgendes verfügt: i) zwei C-Mount-Adapter, die eine einfache Kopplung des Kameramoduls auf der Rückseite und des Objektivs auf der Vorderseite ermöglichen; ii) ein internes Gehäuse für einen Bildverstärker und eine Steckdose für letzteren an der Außenseite der Grille; iii) ein Innenraum hinter dem frontseitigen C-Mount-Adapter, in dem ein Standard-25-mm-Emissionsfilter vor dem Druckübersetzer untergebracht werden kann; und iv) eine eingebaute Lichtkollimationsoptik mit Ringregulatoren, die eine optische Ausrichtung/Fokussierung zwischen dem Objektiv und der Kamera ermöglichen, um gestochen scharfe Bilder auf dem Kamerachip zu erzeugen.
Im zusammengebauten Imager ist das Kameramodul mit der Rückseite des Cricket-Adapters gekoppelt, der auch einen Bildverstärker enthält, der aus einer Photokathode besteht, gefolgt von einer Mikrokanalplatte (MCP), einem Verstärker und einem schnellen Szintillator, P47-Phosphor. Im Inneren des Cricket ist ein 760-nm- ± 50-nm-Emissionsfilter angebracht, und ein Objektiv, NMV-50M11'', ist am vorderseitigen C-Mount-Adapter angebracht. Schließlich werden das Objektiv und die Kamera optisch mit Ringreglern ausgerichtet.
Die Aufgabe des Verstärkers besteht darin, einfallende Photonen zu detektieren und sie in schnelle Lichtblitze auf dem Kamerachip umzuwandeln, die registriert und zur Erzeugung von Emissionszerfällen und Lebensdauerbildern verwendet werden. Das Kameramodul besteht aus einem fortschrittlichen TCSPC-basierten optischen Sensorarray (256 Pixel x 256 Pixel) und einem Auslesechip der neuen Generation 29,30,31,32,33, die die gleichzeitige Aufzeichnung der Ankunftszeit (TOA) undder Zeit über dem Schwellenwert (TOT) von Photonenausbrüchen an jedem Pixel des Bildgebungschips mit einer Zeitauflösung von 1,6 ns und einer Ausleserate von 80 Mpixel/s ermöglichen.
In dieser Konfiguration hat die Kamera mit dem Verstärker eine Einzelphotonenempfindlichkeit. Es ist datengesteuert und basiert auf dem SPIDR-System (Speedy Pixel Detector Readout)34. Die räumliche Auflösung des Imagers wurde zuvor mit planaren phosphoreszierendenO2-Sensoren und einer Auflösungsplattenmaske charakterisiert. Die Instrumentenantwortfunktion (IRF) wurde durch die Abbildung eines planaren Fluoreszenzsensors unter den gleichen Einstellungen wie bei allen anderen Messungen gemessen. Die Lebensdauer des Farbstoffs von rund 2,6 ns war kurz genug, um ihn für die IRF-Messung im PLIM-Modus zu verwenden. Der Imager kann Objekte mit einer Größe von bis zu 18 mm x 18 mm mit räumlichen und zeitlichen Auflösungen von 39,4 μm bzw. 30,6 ns (volle Breite bei halbem Maximum) abbilden.
Die folgenden Protokolle beschreiben den Zusammenbau des Makro-Imagers und seine anschließende Verwendung zur Kartierung der O2-Konzentration in biologischen Proben, die mit der zuvor charakterisierten Nahinfrarot-O2-SondeNanO2-IR 35 gefärbt wurden. Bei der Sonde handelt es sich um eine helle, photostabile, zelldurchlässige O2-Sonde, die auf dem Farbstoff Platin(II)-benzoporphyrin (PtBP) basiert. Es ist bei 625 nm erregbar, emittiert bei 760 nm und bietet eine robuste optische Reaktion auf O2 im physiologischen Bereich (0%-21% oder 0-210 μM vonO2). Der Imager wird auch demonstriert, um verschiedene Sensormaterialien auf Basis von Pt(II)-Porphyrin-Farbstoffen zu charakterisieren. Insgesamt ist der Imager kompakt und flexibel, ähnlich wie eine herkömmliche Fotokamera. Im aktuellen Setup ist der Imager für verschiedene Weitfeld-PLIM-Anwendungen geeignet. Der Ersatz der LED durch eine schnelle Laserquelle wird die Leistung des Imagers weiter verbessern und könnte potenziell FLIM-Anwendungen im Nanosekundenbereich ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>627 nm LED</td><td>Parts Express</td><td></td><td>Kann je nach Anregungswellenlänge des Sensors durch eine andere LED ersetzt werden. Verwendete 390 nm LED für Pt-Porphyrin-Farbstoffe.</td></tr><tr><td>760 &plusmn; 50 nm Emissionsfilter</td><td>Edmund Optics</td><td>84-788</td><td>Kann je nach Emissionswellenlänge des Sensors durch einen anderen Filter ersetzt werden. Gebraucht 650 &plusmn; 50 nm Bandpassfilter für Pt-Porphyrin-Farbstoffe.</td></tr><tr><td>Balb/c Mäuse</td><td>Envigo, UK</td><td>Balb/c</td><td></td></tr><tr><td>Black Box</td><td>Thorlabs</td><td>XE25C9/M</td><td></td></tr><tr><td>Cricket Adapter</td><td>Photonis</td><td>Cricket-2</td><td></td></tr><tr><td>CT26 Zellen &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CT26. WT</td><td>https://www.atcc.org/products/crl-2638</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0697</td><td>Andere Medien können ebenfalls verwendet</td></tr><tr><td>werden ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Kostenlose Bildanalysesoftware. Kann heruntergeladen werden unter: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>MCP-125 Bildverstärker mit P47 Phosphorschirm</td><td>Photonis</td><td>PP0360EF</td><td></td></tr><tr><td>Minischüsseln</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.300</td><td>35 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Mylar-Kunststofffolie, 75 Mikron&nbsp;</td><td>RS Irland</td><td>785-0795</td><td>ODie Kunststoffsubstrate können auch verwendet werden</td></tr><tr><td>NanO2-IR</td><td>hausgemacht</td><td>n/a</td><td>Die Sonde kann nach der veröffentlichten Methode 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In-vivo-Bildgebung der Stoffwechselaktivität des Gehirns mit einer phosphoreszierenden, sauerstoffempfindlichen Sonde. J Neurosci-Methoden. 2013 Jun 15; 216(2):146-51. DOI: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178." oder von unserem Labor zur Verfügung gestellt.&nbsp;</td></tr><tr><td>NMV-50M11" 50 mm Objektiv</td><td>Navitar</td><td></td><td>Andere Objektive, die mit C-Mount Adatoren kompatibel sind, können verwendet werden</td></tr><tr><td>Optisches Steckbrett</td><td>Thorlabs</td><td>MB1836</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td>92 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>Tenma</td><td>72-10495</td><td></td></tr><tr><td>Impulsgeber</td><td>Tenma</td><td>TGP110</td><td></td></tr><tr><td>Sophy</td><td>Amsterdam Scientific Instruments</td><td>n/z</td><td>Zur Verfügung gestellt von ASI zusammen mit dem Tpx3Cam</td></tr><tr><td>Tpx3Cam</td><td>Amsterdam Scientific Instruments</td><td>TPXCAM</td><td></td></tr><tr><td>Tri2 Software</td><td>University of Oxford</td><td>n/a</td><td>Free Time Resolved Imaging Software, kann heruntergeladen werden von: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml</td></tr><tr><td>XYZ Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>LT3</td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenzlebensdauer-makro-imager für biomedizinische anwendungen

Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications

In diesem Artikel wird ein neuer Photolumineszenz-Lifetime-Imager vorgestellt, der entwickelt wurde, um die molekulare Sauerstoffkonzentration (O2) in verschiedenen phosphoreszierenden Proben abzubilden, die vonO2-empfindlichen Festkörperbeschichtungen bis hin zu lebenden tierischen Gewebeproben, die mit löslichenO2-empfindlichen Sonden gefärbt wurden, reichen. Insbesondere wurde die nanopartikelbasierte Nahinfrarotsonde NanO2-IR verwendet, die mit einer 625 nm Leuchtdiode (LED) anregbar ist und bei 760 nm emittiert. Das Bildgebungssystem basiert auf der Timepix3-Kamera (Tpx3Cam) und dem opto-mechanischen Adapter, der auch einen Bildverstärker beherbergt. Die Phosphoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (PLIM) wird häufig für verschiedene Studien benötigt, aber die aktuellen Plattformen haben Einschränkungen in ihrer Genauigkeit, allgemeinen Flexibilität und Benutzerfreundlichkeit.
Bei dem hier vorgestellten System handelt es sich um einen schnellen und hochempfindlichen Imager, der auf einem integrierten optischen Sensor und einem Auslesechip-Modul, Tpx3Cam, aufgebaut ist. Es wird gezeigt, dass es hochintensive Phosphoreszenzsignale und stabile Lebensdauerwerte aus oberflächengefärbten Darmgewebeproben oder intraluminal gefärbten Fragmenten des Dickdarms erzeugt und die detaillierte Kartierung desO2-Spiegels im Gewebe in etwa 20 s oder weniger ermöglicht. Erste Experimente zur Bildgebung von Hypoxie in transplantierten Tumoren bei bewusstlosen Tieren werden ebenfalls vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie der Imager für die Verwendungmit O2-empfindlichen Materialien auf Basis von Pt-Porphyrin-Farbstoffen neu konfiguriert werden kann, wobei eine 390-nm-LED für die Anregung und ein 650-nm-Bandpassfilter für die Emission verwendet werden. Insgesamt konnte festgestellt werden, dass der PLIM-Imager genaue quantitative Messungen der Lebensdauerwerte für die verwendeten Sonden und entsprechende zweidimensionale Karten derO2-Konzentration liefert. Es ist auch nützlich für die metabolische Bildgebung von Ex-vivo-Gewebemodellen und lebenden Tieren.

Für Ex-vivo-Bildgebungsanwendungen wurden Fragmente von Darmgewebe durch die topische Anwendung der NanO2-IR-Sonde auf der serosalen Seite des Gewebes gefärbt. Für eine tiefere Färbung wurde 1 μL der Sonde in das Lumen injiziert. In letzterem Fall schirmte die 0,2-0,25 mm dicke Darmwand die Sonde von der Kamera ab. Die beiden Färbeverfahren sind in Abbildung 2A dargestellt.
Die resultierenden Intensitäts- und PLIM-Bilder sind in <strong ...

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines neuen, schnellen optischen Bildgebungsgeräts für die makroskopische Photolumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von Proben mit langem Zerfall. Die Integrations-, Bildaufnahme- und Analyseverfahren werden ebenso beschrieben wie die Präparation und Charakterisierung der Sensormaterialien für die Bildgebung und die Anwendung des Imagers bei der Untersuchung biologischer Proben.

Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen

This paper presents a new photoluminescence lifetime imager designed to map the molecular oxygen (O2) concentration in different phosphorescent samples ...

Unser Protokoll bietet eine detaillierte 2D-Kartierung der Phosphoreszenzlebensdauer und der Sauerstoffkonzentration in makroskopischen Objekten, insbesondere in lebendem tierischem Gewebe und ganzen Tieren, mit Hilfe spezieller Sonden und Sensormaterialien. Diese Informationen sind für viele Forschungsbereiche wichtig. Unser Protokoll verwendet ein integriertes und kompaktes Bildgebungsmodul, das im TCSPC-Modus arbeitet und eine einfache und genaue Visualisierung der Lebensdauer und Sauerstoffverteilung in komplexen biologischen Proben, wie z. B. lebendem Gewebe, ermöglicht.Nehmen Sie den Cricket-Adapter und inspizieren Sie ihn von verschiedenen Seiten. Entfernen Sie den vorderseitigen C-Mount-Adapter, um den Photonis PP0360EF-Verstärker im Cricket zu zeigen, und setzen Sie dann den C-Mount-Adapter wieder ein. Entfernen Sie den vorderseitigen C-Mount-Adapter des Cricket und setzen Sie den 650 plus/minus 50 Nanometer Emissionsfilter ein.Reparieren Sie es, indem Sie die C-Halterung wieder einsetzen. Verbinden Sie dann das TPX-Kameramodul mit drei Kameras über die Ringadapter mit der Rückseite des Cricket-Moduls. Verbinden Sie das Objektiv über den C-Mount-Adapter mit der Vorderseite

fluorescence-lifetime-macro-imager-for-biomedical-applications

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine ​​und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Quelle: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Alter C. Elegans mittels Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung. J. Vis. Exp. (2020). Dieses Video zeigt die Verwendung der Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) zur Beurteilung der PolyQ-Proteinaggregation in C. elegans Neuronen und vergleicht Kontroll- und Chaperonprotein-defiziente Würmer. Eine erhöhte Aggregation bei Chaperon-defizienten Würmern fördert den Energietransfer zwischen geclusterten...

Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung der PolyQ-Proteinaggregation in Caenorhabditis elegans-Neuronen

Wir präsentieren eine Open-Source hohe Content-Analyse (HCA) Instrument unter Verwendung von automatisierten Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) zur Untersuchung von Protein-Interaktionen mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basiert Ablesungen. Die Datenerfassung für dieses openFLIM-HCA Instrument wird von der Software in μManager geschrieben gesteuert und Datenanalyse wird in FLIMfit unternommen.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für die quantitative Darstellung der Komplexbildung des SNARE-Proteine, basierend auf Förster Resonance Energietransfer und Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie ermöglicht.

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Ein Verfahren wird vorgestellt, um Proteinkinase-A-Aktivitäten in kopffesten, sich verhaltenden Mäusen zu visualisieren. Ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter, tAKAR, wird in kortikalen Neuronen ausgedrückt und für die Bildgebung durch ein Schädelfenster zugänglich gemacht. Die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Bildmikroskopie wird verwendet, um PKA-Aktivitäten in vivo während der erzwungenen Fortbewegung zu visualisieren.

Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Wir beschreiben die Verwendung einer neuartigen, Frequenzbereichs-Lumineszenz-Lebensdauerkamera zur Kartierung von 2D O2-Verteilungen mit optischen Sensorfolien. Das Kamerasystem und die Bildanalyseverfahren werden zusammen mit der Vorbereitung, Kalibrierung und Anwendung von Sensorfolien zur Visualisierung der O 2-Mikroumgebung in der Rhizosphäre von Wasserpflanzen beschrieben.

Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von O2 mit einem Frequency-Domain-basierten Kamerasystem

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

Ziel dieses Protokolls ist es, die quantitative Fluoreszenzlebensdauermessung von Riboglow-Sonden für reproduzierbare RNA-Bildgebungsworkflows in vitro, in lebenden Säugetierzellen und in dreidimensionalen zellulären Modellen zu ermöglichen. Wir skizzieren Probenvorbereitung, Sondenabgabe, Datenerfassung und quantitative Analyse-Workflows zur Extraktion unverzerrter Fluoreszenzlebensdauermessungen.

Charakterisierung von Riboglow-Sonden in vitro als Grundlage für fluoreszenzlebenslange Bildgebung in lebenden Säugetierzellen und dreidimensionalen zellulären Modellen

BioMEMS and Cellular Biology: Perspektiven und Anwendungen

Erfahren Sie die makroskopische Phosphoreszenzlebensdauer-Bildgebung mit TCSPC-Modus für biologische Gewebe. Diese Methode ermöglicht präzise Sauerstoffkonzentrationsmessungen und Visualisierung hypoxischer Zustände in lebenden Tieren.

Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen

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