测试通过微流控混合配制的mRNA-脂质纳米颗粒的 体外 和 体内 效率

该方案可用于配制包裹MRA的一致脂质纳米颗粒。可以调整配方参数，并可以评估各种脂质纳米颗粒的效力和生物分布。脂质纳米颗粒配方以及体外和体内测试的标准化方案可用于配制可以相互比较的一致脂质纳米颗粒。

在制定和评估纳米颗粒效力时，有很多小细节需要牢记，但哪些细节考虑在内？制备制剂应该不困难。首先用 200 至 300 毫升新鲜的 10X PBS 填充干净的 4 升烧杯，然后用超纯水将其稀释至 1X。

确保 PBS 的最终体积在 2 到 3 升之间。将适当容量的脂质纳米颗粒或LNP制剂的透析盒放入现场烧杯中。使用超纯水将 100 毫摩尔柠檬酸缓冲原液稀释 10 倍，以制备用于 mRNA 稀释的 10 毫摩尔柠檬酸缓冲液。

接下来，通过将每种脂质溶解在 100% 乙醇中，制备 C 12 200 可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和脂质锚定的 PEG 或脂质 PEG 储备溶液。通过在 37 摄氏度下加热和混合，确保储备溶液完全溶解。将锥形管中不同脂质成分的计算体积组合在一起。

用100%乙醇稀释脂质至最终体积为V，其代表LNP最终体积的25%。根据可电离脂质与mRNA的重量比和mRNA-LNP的总体积计算制剂所需的mRNA量。接下来，在冰上解冻编码mRNA的萤火虫荧光素酶。

然后使用 10 毫摩尔柠檬酸缓冲液将 mRNA 稀释至有机相的最终体积三倍。用表面去污剂喷洒 RNA 和 DNA 的精细擦拭布，并彻底擦拭微流体仪器的内部。接下来，打开一个新的微流体滤芯，并在入口通道朝下并背对的情况下插入它。

在支架上放置两个无菌的 15 毫升锥形管，盖上盖子。完成后，用含有在 10 毫摩尔柠檬酸缓冲液中稀释的 mRNA 的 mRNA 溶液填充 5 毫升注射器。然后用含有在100%乙醇中稀释的脂质的脂质溶液填充三毫升注射器。

确保从注射器中去除任何空气。然后不带针头，将含有mRNA溶液的5毫升注射器插入墨盒的左侧入口，将含有脂质溶液的三毫升注射器插入墨盒的右侧入口。打开微流控仪器，选择快速运行。

在为插入的 5 毫升和 3 毫升注射器选择正确的注射器类型后，以 3 比 1 的水与有机流速比输入 LNP 配制参数，然后按下开始按钮配制 mRNA-LNP。使用注射器将收集在右锥形管中的mRNA-LNP装入先前水合的透析盒中，而不刺穿或接触透析盒膜，将含有mRNA-LNP的透析盒放回含有PBS的烧杯中，并让它们透析至少两个小时。透析后，将含有mRNA-LNP的透析盒放入无菌生物安全柜中，并使用带针的注射器取出mRNA-LNP。

使用0.22微米注射器过滤器无菌过滤mRNA-LNP，并将其收集在无菌锥形管中。然后将 65 微升 mRNA-LNP 溶液放入 1.5 毫升微管中进行表征。将 5， 000 个 HepG2 细胞置于白壁、透明底部、96 孔板中，置于 100 微升完全细胞培养基中，并将细胞在含有 5% 二氧化碳的 37 摄氏度受控培养箱中孵育过夜。

在用mRNA-LNP处理细胞之前，从孔中取出完全培养基。接下来，在孵育 24 小时之前，用 100 微升在完全细胞培养基中以所需剂量稀释的 mRNA-LNP 或 100 微升完全培养基处理细胞。孵育后，从 96 孔板中取出细胞培养基，向每个孔中加入 20 微升裂解缓冲液，然后加入 100 微升荧光素酶测定试剂。

保护板免受光线照射，并将板放入酶标仪中以测量生物发光信号。使用无菌PBS稀释mRNA-LNP溶液，使100微升尾静脉注射体积中存在2微克的总mRNA。用 100 微升 mRNA-LNP 或 100 微升 PBS 填充 29 号胰岛素注射器，并从注射器中去除任何气泡。

将针头斜面朝上插入小鼠的侧尾静脉，并缓慢注射100微升mRNA-LNP或PBS。注射后6小时，在无菌PBS中制备每毫升15毫克的D-荧光素钾盐储备溶液。在活体成像系统（IVIS）的成像软件中，选择发光旁边的框，然后按初始化以准备仪器进行数据采集。

接下来，腹膜内给予先前治疗的小鼠200微升D-荧光素，并等待10分钟，同时荧光素酶信号稳定，然后再麻醉小鼠。将麻醉的小鼠转移到体内成像系统内的鼻锥上，确保它们在关闭腔室门之前仰卧，腹部暴露在外。在成像软件中，确保选择了正确的视野并将曝光时间设置为自动，单击软件中的获取按钮即可获得生物发光图像。

mRNA-LNP的包封效率为92.3%，使用改良的荧光测定法和方程式。用增加剂量的 mRNA-LNP 处理 5， 000 个 HepG2 细胞时观察到生物发光增加。荧光素酶表达在这项研究的最低剂量（每孔 5 纳克）下很容易检测到。

在用配制的LNPs处理的小鼠的上腹部观察到强烈的生物发光信号。 在肝脏信号周围绘制感兴趣的区域以计算总发光通量。总发光通量约为 5 乘以 10 到 9。

配制LNP时，始终保持可电离脂质与核酸的重量比。每体积的有机相应含有与三体积水相中的mRNA相对应的可电离脂质。