Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Die funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie ist eine Methode zur Untersuchung von Proteindomänenbewegungen in Echtzeit. Die Modifikation dieser Technik für ihre Anwendung in nativen Zellen ermöglicht nun die Detektion und Verfolgung einzelner Spannungssensorbewegungen von spannungsabhängigen Ca²⁺ -Kanälen in murinen isolierten Skelettmuskelfasern.

CaV1.1, ein Mitglied der spannungsabhängigen Ionenkanäle, verfügt über vier verschiedene Spannungssensoren. Es gibt Hinweise darauf, dass einige Spannungssensoren mehr zur Aktivierung des Ryanodinrezeptors oder des Kalziumstroms beitragen. Unser Ziel ist es, die genaue Rolle jedes Spannungssensors bei der Anregungs-Kontraktions-Kopplung und der Aktivierung des Kalziumkanals zu identifizieren.

Die Anregungs-Kontraktions-Kopplung wird seit den frühen 50er Jahren untersucht, doch die molekularen Details, wie dieser Prozess abläuft, sind noch unbekannt. Jüngste Fortschritte in der zyroelektronenmikroskopischen Struktur des Kanals, die Charakterisierung eines neuartigen CaV1.1-akzessorischen Proteins, die Entdeckung einer alternativen Spleißvariante des Kanals und die Identifizierung von krankheitsverursachenden Mutationen haben das Interesse an diesem Gebiet neu entfacht. In unserem Fachgebiet werden viele Techniken eingesetzt, von der klassischen Elektrophysiologie und Molekularbiologie bis hin zu neuartigeren Techniken wie Kryo-Elektronenmikroskopie, molekulardynamischer Simulation, gezieltem Proteinabbau und funktioneller ortsgerichteter Fluorometrie sowie gentechnisch veränderten Zellen oder Tiermodellen.

Derzeit steht der Kraftstoff vor mehreren experimentellen Herausforderungen. In einem Skelettmuskel ist der ordnungsgemäße Transport und die Kommunikation zwischen CaV1.1 und RyR1 sowie vielen regulatorischen Proteinen entscheidend, um die Kopplung von Erregung und Kontraktion zu unterstützen. Die Methoden, um diese Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen CaV1.1 und RyR1 direkt zu untersuchen, fehlen oder sind unvollständig.

Das Labor von Dr. Martin Schneider beschäftigt sich seit Jahrzehnten mit der Anregungs-Kontraktions-Kopplung und charakterisiert Spannungsmessmechanismen in CaV1.1, die Freisetzung von Kalzium und lokale Kalziumfreisetzungsereignisse, die als Kalziumfunken bekannt sind. In jüngster Zeit hat unser Labor neue optische Techniken implementiert, um verschiedene Schritte der Erregungs-Kontraktions-Kopplung und der Bewegung von Spannungssensoren in funktionierenden erwachsenen Muskelzellen zu untersuchen. Während dies bisher in einem heterologen Expressionssystem durchgeführt wurde, erlaubt unser Protokoll nun die Verfolgung von Konformationsänderungen in CaV1.1-Spannungssensoren während eines sich ausbreitenden Aktionspotentials in seiner natürlichen Umgebung.

Unsere neue Technik wird es uns ermöglichen, die genaue Bewegung des Spannungssensors zu untersuchen, die für die Anregungs-Kontraktions-Kopplung benötigt wird. Wir wollen wissen, welche Ladungsreste in jedem S4 für seine Funktion entscheidend sind, oder genau jedes S4 translozieren, und all diese Translokation ist mit der Öffnung von CaV1.1 oder der Aktivierung des Ryanodinrezeptors verbunden.