单层石墨烯在冷冻电子显微镜载网中的应用以实现高分辨率结构解析

冷冻电镜样品制备中的一个常见挑战是颗粒在气-水界面处聚集，导致颗粒产生优势取向并发生变性。相比之下，更理想的情况是使颗粒吸附在载网表面，而石墨烯等具有鳍状薄膜支撑结构的材料有助于实现这一状态。另一个挑战是需要相对较高的样品浓度，而石墨烯也有望解决这一问题。

石墨烯包被载网在冷冻电镜结构解析中具有诸多优势，但长期以来，其在实验室内的可重复制备存在困难，且商业购买成本高昂。本方案实现了单层石墨烯的稳定沉积，从而降低了研究人员在研究中使用此类载网的门槛。石墨烯因其独特的材料特性而与众不同。

它是一种碳单层结构，因此背景噪声极低。其他冷冻电镜载网支撑材料，例如薄层无定形碳或氧化石墨烯碎片，无法以单层形式应用，会产生更强的背景信号。现在我们已经建立了将石墨烯应用于冷冻电镜载网的可靠方案，接下来希望进一步对石墨烯包被的载网进行功能化修饰，引入亲和探针，以实现直接从细胞裂解液中在载网上捕获目标分子。

这可能会缓解冷冻电镜样品制备中的另一个瓶颈。首先，在一个50毫升烧杯中配制石墨烯刻蚀溶液。具体操作为：将4.6克过硫酸铵（APS）加入20毫升分子级水中，用铝箔覆盖烧杯，并使APS完全溶解。

为对CVD石墨烯区域进行MMA包覆，需小心切割出一块方形石墨烯，将其转移至洁净培养皿中的盖玻片上，并盖上培养皿，随后运送至旋涂仪。接下来，将旋涂仪设置为高速旋转60秒，转速为每分钟2,500转。然后，小心地将CVD石墨烯样品转移至尺寸匹配的卡盘上。

按下吸取或吸附按钮，启动真空泵，将石墨烯固定在卡盘上。然后将MMA滴加到CVD石墨烯方片的中心。盖上盖子，抽真空，并立即按下启动或停止按钮。

停止旋转并关闭真空泵后，使用镊子小心取出涂有甲基丙烯酸甲酯（MMA）的化学气相沉积（CVD）石墨烯。将石墨烯翻转，使涂层面向下，重新放回玻璃盖玻片上。接着，使用平头镊子将盖玻片上的CVD石墨烯转移至辉光放电器中，在25毫安电流下辉光放电30秒。

将载有石墨烯的盖玻片放回培养皿中，最后盖上盖子，以便运送至铜刻蚀区域。首先，将涂有甲基丙烯酸甲酯（MMA）的石墨烯方片切割成网格大小的片状。

为此，使用两把反向作用镊子支撑CVD石墨烯方片，同时确保在将其固定到镊子上时MMA面朝上。要将石墨烯切割成小方块，需用两把反向作用镊子夹住石墨烯正面朝上的部分，将其固定在原位，同时在从小方块切割下来后，用镊子夹住其边缘。倾斜盛有过硫酸铵（APS）的烧杯，以较小的角度将石墨烯方块放入溶液中，避免其沉入液体深处。

然后选取一个方片，在释放之前使其接触APS溶液的表面。用铝箔覆盖烧杯后，在25摄氏度下孵育过夜。接下来，要将MMA石墨烯薄膜从APS溶液中取出，首先将一块玻璃盖玻片垂直浸入溶液中，然后横向移动，使其接触一个漂浮的方片。

然后小心地取下盖玻片，确保薄膜在取下时完全附着在盖玻片的一侧。将盖玻片垂直浸入盛有分子生物学级水的50 mL烧杯中，使附着的薄膜脱离并进入水中。以类似方式，将所有薄膜转移至该烧杯中。

将薄膜置于烧杯中静置20分钟，然后即可用于粘附到冷冻电镜载网上。要将甲基丙烯酸甲酯（MMA）涂层的化学气相沉积（CVD）石墨烯附着到载网上，使用先前制备并保存在盛有分子级水的烧杯中的、与载网尺寸匹配的涂层石墨烯方片。使用反向操作镊子，将载网垂直轻轻浸入水中，使碳面朝向漂浮在水面上的MMA石墨烯方片。

当方片与网格接触后，小心地将网格从水中取出，确保方片完全粘附在网格的碳膜一侧。将网格放置在干净的盖玻片上，使MMA石墨烯面朝上，静置空气干燥一到两分钟。使用平头镊子将带有网格的盖玻片转移至预热至130摄氏度的加热板上。

将载网置于玻璃培养皿的皿盖内覆盖，孵育20分钟。随后，为用丙酮洗涤甲基丙烯酸甲酯（MMA），将整个盖玻片转移至含有15毫升丙酮的培养皿中，孵育30分钟。然后使用洁净的玻璃刻度移液管，将丙酮转移至废液容器中。

使用另一支洁净的玻璃刻度吸管，向培养皿中加入 15 毫升新鲜丙酮，孵育 30 分钟。经过三次丙酮洗涤后，移除丙酮，并使用一支洁净的玻璃刻度吸管，将其替换为 15 毫升异丙醇。

然后使用镊子将载网从异丙醇中小心取出，置于洁净的盖玻片上晾干。接着，将带有石墨烯涂层载网的盖玻片放置于设定为100摄氏度的加热板上，加热10分钟，以蒸发残留的有机物。使用反向镊子，轻轻将载网转移至紫外臭氧清洗仪的洁净照射区域，确保石墨烯涂层面向上。

滑动关闭照明区域并打开仪器。将时间旋钮设定为指定的处理时间，以开始对载网进行紫外臭氧处理。最后，在处理后的载网上进行冷冻电子显微镜样品的 plunge 冷冻。