Standardisierte modulare Assemblierung von polycistronischen Operons mit modularem Klonieren (MoClo) unter Verwendung des In-Cloning-Toolkits

Ich entwickelte Methoden, die modulare DNA-Assemblierung von kleinen einzelnen molekularen Teilen bis hin zu chromosomengroßen Konstrukten ermöglichen und Zellen mit diesen künstlichen Chromosomen umprogrammieren können. Eine wichtige Innovation auf diesem Gebiet ist die Entwicklung modularer Klon-Toolkits, die die modulare Zusammenstellung von Multi-Gen-Konstrukten aus einer Bibliothek standardisierter molekularer Teile ermöglichen. Modulare Klon-Toolkits sind typischerweise dafür konzipiert, monocistronische Transkriptionseinheiten zu klonen.

Dieses Protokoll demonstriert eine verallgemeinerbare Methode zur Montage polycistronischer Transkriptionseinheiten mit dem In-Cloning-Toolkit. Diese Strategie des Klonens einer polycistronischen Transkriptionseinheit ermöglicht es, Codierungssequenzen flexibel entweder in einer einzelnen Transkriptionseinheit oder in polycistronischen Anordnungen zu verwenden. Um zu beginnen, wählen Sie die Level-0-Teile aus, die zu einer Transkriptionseinheit zusammengesetzt werden.

Diese müssen mindestens ein RBS, eine Codierungssequenz und einen Terminator enthalten. Wählen Sie die Position, an der die Transkriptionseinheit im Operon zusammengesetzt wird. Basierend auf der gewählten Position wählen Sie das entsprechende Akzeptor-Plasmid aus und simulieren Sie die Golden Gate-Assembly in SnapGene.

Bei der Golden Gate-Reaktion wird das Enzym SAP1 verwendet, um die Ribosomenbindungsstelle, die kodierende Sequenz und den Terminator von ihren jeweiligen Plasmiden freizusetzen und das Akzeptorplasmid aufzuschneiden. Assembleren Sie die Ribosomenbindungsstelle, die Codierungssequenz und den Terminator in das Schnittakzeptorplasmid. Als Nächstes verwenden Sie für die Golden Gate-Reaktion eine Pipette, um 50 Femtomole jedes gewünschten Einsatzes und 50 Femtomole des Akzeptorplasmids hinzuzufügen.

Ein Mikroliter jeweils 10x T4 DNA-Ligasepuffer, T4-Ligase und SAP1 in ein Reaktionsrohr. Dann wird nukleasefreies Wasser hinzugefügt, um das Endvolumen auf 10 Mikroliter zu bringen. Setze das Rohr in einen Thermocycler.

Laufen Sie 25 Zyklen mit 37 Grad Celsius für drei Minuten, 16 Grad Celsius für vier Minuten und 50 Grad Celsius für 20 Minuten. Dann wird die Enzyme 20 Minuten lang bei 80 Grad Celsius inaktiviert. Optional pipettieren Sie 0,5 Mikroliter SAP1 auf die GG-Reaktion und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Pipettieren Sie fünf Mikroliter der Reaktion in 50 Mikroliter chemisch kompetente E.coli-Zellen. Führen Sie eine Wärmeschocktransformation durch, indem Sie das Rohr für 30 Sekunden bei 42 Grad Celsius in ein Wasserbad tauchen und das Rohr dann für zwei Minuten auf Eis legen. Als Nächstes werden die Zellen eine Stunde lang in einem Milliliter Medium inkubiert, um die Genesung zu unterstützen.

Platte 100 Mikroliter der Transformation entfaltet sich auf eine LB-Schneckenplatte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag sollten Sie zwei weiße Kolonien mit einer Impfschleife oder einer Pipettenspitze auswählen.

Impfen Sie jedes in fünf Milliliter LB-Medium, das 100 Mikrogramm Ampicillin pro Milliliter enthält. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator mit 250 Umdrehungen pro Minute. Führen Sie eine karierte Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.

Verdauen Sie ein Mikrogramm extrahierter Plasma-DNA, indem Sie einen Mikroliter 10-fachen Verdauungspuffer und einen Mikroliter BBS1 hinzufügen. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Mikroliter zu erreichen, und inkubieren Sie. Jetzt lade das verdaute Plasmid auf ein 1%-Agarose-Gel und führe Elektrophorese bei 100 Volt für 35 Minuten durch.

Dann bilde ich das Gel ab und vergewissere die korrekte Anordnung des Plasmids. Um ein Level-M-Konstrukt zusammenzustellen, wählen Sie die Level-1-Transkriptionseinheiten aus, die zusammengesetzt werden sollen. Simuliere die Golden Gate-Assemblierung, indem du die erste und zweite Transkriptionseinheit sowie den Endlinker mit dem Enzym BBS1 freigibst.

Gleichzeitig wird das Akzeptorplasmid aufgeschnitten und dann alle drei Teile zu dem Akzeptorplasmid zusammengesetzt, um die polycistronische Transkriptionseinheit zu bilden. Die negative Kontrolle für die Level-1-Plasmidassemblierung, die keinen Terminatorteil hatte, ergab keine Kolonien, während die vollständige Reaktion 292 weiße Kolonien und keine roten Kolonien hervorbrachte. Die Montage des Multigen-Konstrukts ohne die zweite Kassette bei 37 Grad Celsius ergab nur zwei weiße Kolonien, während die vollständige Montage neun große und 435 kleine Kolonien ergab.

Bei 30 Grad Celsius ergab die negative Kontrolle für die Multigen-Assemblierung vier weiße Kolonien, während die vollständige Reaktion mehr als 1.500 Kolonien hervorbrachte. BSA1-Digest des Akzeptorplasmids PMA60 liefert das erwartete Einzelband mit 5.500 Basenpaaren. Die BSA1-Verdauung von Plasmiden aus 24 Kolonien zeigte, dass 23 von 24 das korrekte Restriktionsmuster von zwei Bändern bei etwa 4.300 Basenpaaren und 1.700 Basenpaaren aufwiesen.

Die Fluoreszenzbildgebung zeigte starke grüne und cyane Fluoreszenz in Kolonien von Platten mit OC6-Induktor, während Platten ohne Induktor minimale oder keine Fluoreszenz zeigten.