Name: Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Polysomenprofilierung zur Analyse der Translationseffizienz unter Hitzestress bei Arabidopsis thaliana. Diese standardisierte Methode ermöglicht die Isolierung von ribosomenassoziierten mRNAs für translatomische Studien.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analyse der translationalen Regulation in hitzegestresster Arabidopsis

<ol><li>Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+translation+regulation+in+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">The significance of translation regulation in the stress response.</a> BMC genomics. 14, 1-11 (2013).</li>
<li>Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+machinery%3A+the+basis+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genom%22%5BJournal%5D)">Translation machinery: the basis of translational control.</a> J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).</li>
<li>Dever, T. E., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elongation%2C+termination%2C+and+recycling+phases+of+translation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Dennis, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+Arabidopsis+thaliana+CK2+holoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).</li>
<li>Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+plant+translation+initiation+factors+by+CK2+enhances+the+in+vitro+interaction+of+multifactor+complex+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components.</a> J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).</li>
<li>Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOR+and+RPS6+transmit+light+signals+to+enhance+protein+translation+in+deetiolating+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).</li>
<li>Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphorylation+of+carboxyl-terminal+eIF2%CE%B1+by+SPA+kinases+contributes+to+enhanced+translation+efficiency+during+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis.</a> Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).</li>
<li>Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+translational+control+contributes+to+the+regulation+of+Arabidopsis+photomorphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis.</a> Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).</li>
<li>Des Marais, D. L., Juenger, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropy%2C+plasticity%2C+and+the+evolution+of+plant+abiotic+stress+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance.</a> Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+for+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Physio+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Metabolomics for plant stress response.</a> Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+heat+stress+and+drought+stress+in+pearl+millet+based+on+Pacbio+full-length+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing.</a> BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).</li>
<li>Wasternack, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+jasmonates+in+plant+stress+responses+and+development-applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects.</a> Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+induction+during+NLR-mediated+immunity+in+plants+is+dynamically+regulated+by+CDC123%2C+an+ATP-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein.</a> Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).</li>
<li>Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stress+granules%3A+trends+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Plant stress granules: trends and beyond.</a> Front Plant Sci. 12, 722643(2021).</li>
<li>Hamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+is+induced+by+a+threshold+temperature+rather+than+a+temperature+difference+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis.</a> J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).</li>
<li>Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+stress+granules+and+processing+bodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants.</a> Plants. 9 (9), 1122(2020).</li>
<li>Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+crop+yields+and+their+variability+at+different+levels+of+global+warming%5BTitle%5D)+AND+%22Earth+Sys+Dyn%22%5BJournal%5D)">Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming.</a> Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+TaHSFA6e+modulates+heat+shock+protein-mediated+translational+regulation+in+response+to+heat+stress+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat.</a> New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (87), e51164(2014).</li>
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<li>Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+ETHYLENE+RESPONSE+FACTOR1+regulates+abiotic+stress-responsive+gene+expression+by+binding+to+different+cis-acting+elements+in+response+to+different+stress+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals.</a> Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).</li>
<li>Van den Broeck, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+network+to+phenotype%3A+the+dynamic+wiring+of+an+Arabidopsis+transcriptional+network+induced+by+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Sys+Biol%22%5BJournal%5D)">From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress.</a> Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+and+identification+of+newly+synthesized+proteomes+with+bioorthogonal+non-canonical+amino-acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging.</a> Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+de+novo+protein+synthesis+in+starvation-induced+autophagy+using+bioorthogonal+noncanonical+amino+acid+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Acad+Press%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging.</a> Acad Press. 588, 41-59 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Eppendorf-Röhrchen</td><td>Labcon</td><td>3012-870-000-9</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>13,2 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Ultrazentrifugation</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Honeywell</td><td>32712</td><td>Polysomenprofil</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Honeywell</td><td>32211</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Cycloheximid (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-C7698</td><td>Polysomenprofil</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>GeneChip Eukaryotische Poly-A RNA Kontrollkit</td><td>Invitrogen</td><td>900433</td><td>Normalisierung</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Honeywell</td><td>15523</td><td>Normalisierung</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H3149</td><td>Polysomenprofil</td></tr><tr><td>HiScript III RT SuperMix für qPCR-Kit</td><td>Vazyme</td><td>R323-01</td><td>Normalisierung</td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 3040-01</td><td>Polysomenprofil</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-M8266</td><td>Polysomenprofil</td></tr><tr><td>MS Basalmedium</td><td>Phyto</td><td>M524</td><td></td></tr><tr><td>Pflanzenkultur Peak Chart Spritzenpumpe</td><td>Brandel</td><td>SYN4007LS</td><td>Polysomenprofil</td></tr><tr><td>Polyoxyethylen-10-Tridecylether (PTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td>Polysomenprofil</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N251B</td><td>Polysomenprofil</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat (DOC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-D6750</td><td>Polysom-Profil</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td>Polysom-Profil</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>BP170-8882</td><td>Normalisierung</td></tr><tr><td>TRI Reagenz</td><td>MRC</td><td>TR118</td><td>RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>J.T.Baker</td><td>&nbsp; 4109-06</td><td>Polysom-Profil</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100K</td><td>Ultrazentrifugation</td></tr><tr><td>UV/VIS-Detektor</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>Polysomenprofil</td></tr></tbody></table>

translationseffizienztest mit polysomenprofilen unter hitzebelastung

Translation Efficiency Test Using Polysome Profiles Under Heat Stress

Der Wildtyp von Arabidopsis, Col-0, wurde auf MS-Medium unter einer Lichtphotoperiode von 16 h:8 h gezüchtet. Zur Kontrolle wurden 5 Tage alte Sämlinge ohne Hitzestressbehandlung verwendet. Die Hitzestressgruppe wurde 1 h lang einer Wärmebehandlung bei 40 °C in einem vorgewärmten Wasserbad unterzogen, während die Erholungsgruppe unmittelbar nach der Wärmebehandlung 2 h lang bei 22 °C behandelt wurde. Durch den Einsatz unterschiedlicher Wärmebehandlungsbedingungen und Rückgewinnungsbedingungen können wir nachfolgende Schritte nutzen, um ihre translationale Effizienz zu messen.
Vor der RNA-Extraktion muss zunächst der Saccharosegradient vorbereitet werden. Um die nicht-polysomale und polysomale RNA anhand ihres Dichteunterschieds zu trennen, stellten wir eine Gradientenlösung mit Saccharosekonzentrationen von 12,5 %, 24,4 %, 36,3 %, 48,1 % und 60 % her. Dann luden wir die Gradientenlösungen von hoher zu niedriger Konzentration, beginnend von unten (Abbildung 1A). Anschließend können wir diesen Gradienten nutzen, um die nicht-polysomale RNA mit niedrigerer Dichte in der oberen Schicht zu trennen, während die polysomale RNA mit höherer Dichte in der unteren Schicht mit höheren Saccharosekonzentrationen verteilt wird. Die nicht-polysomale und polysomale RNA wurden aus dem behandelten oder unbehandelten Col-0 extrahiert. Um zu verhindern, dass Partikel in der Lösung die Ergebnisse der Polysomen-Profiling-Analyse beeinflussen, sollte die RNA-haltige Lösung durch ein Zellsieb filtriert werden, um eine partikelfreie Extraktionslösung zu erhalten. Der filtrierte Überstand wurde auf einen vorgefertigten Saccharosegradienten geladen und äquilibriert. Nach der Ultrazentrifugation von Saccharosegradienten beladenen Proben wurden die nicht-polysomale und polysomale RNA entsprechend der Dichte innerhalb des Saccharosegradienten verteilt. Anschließend wurde die Polysomenprofilierung mit einem Dichtegradientenfraktionator durchgeführt (Abbildung 1B). Der Dichtegradientenfraktionator wird mit Hilfe einer Software gesteuert, die zunächst mit deionisiertem Wasser kalibriert wurde. Nach der Kalibrierung werden die Proben nach der Ultrazentrifugation auf den Fraktionator geladen. Im Softwaresteuerungsmodus injiziert die Mikrovolumen-Spritzenpumpe Saccharoselösung mit Konzentrationen, die höher als der Saccharosegradient sind, in den Gradienten und drückt die Probe. Auf diese Weise kann die Messung am oberen Rand des Saccharosegradienten beginnen, wo die Dichte niedriger ist, und nach unten gehen, wo die Dichte höher ist. Anschließend werden Softwareeinstellungen aktiviert, um die Datenerfassung zu starten und das Polysomenprofildiagramm durch OD254-Messung zu generieren (Abbildung 1B). Wenn wir eine höhere Signalintensität in der polysomalen Fraktion beobachten, deutet dies darauf hin, dass die Probe eine höhere Translationseffizienz aufweist.
Die Flächen der Polysomenprofilierung für 5 Tage alte Col-0-Sämlinge unter verschiedenen Behandlungen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Ergebnisse der Kontrollgruppe zeigen eine klare Trennung zwischen der nicht-polysomalen Fraktion und der polysomalen Fraktion (Abbildung 2A). Nach 1 h Hitzestress bei 40 °C nahm die Signalintensität der polysomalen Fraktion jedoch signifikant ab (Abbildung 2B). Wenn die wärmebehandelten Sämlinge 2 h lang bei 22 °C regenerieren konnten, erholte sich die Signalintensität der polysomalen Fraktion auf ein ähnliches Niveau wie in der Kontrollgruppe (Abbildung 2C). Unsere Ergebnisse zeigten, dass eine 1-stündige Hitzestressbehandlung die Translationseffizienz von Arabidopsis-Sämlingen signifikant reduzierte. Die Pflanzen benötigten jedoch eine 2-stündige Erholungsphase, um die Translationseffizienz wieder auf ein Niveau zu bringen, das mit dem von Sämlingen vergleichbar ist, die nicht unter Hitzestress leiden.
Um weitere Beweise für den Vergleich der Translationseffizienz von Col-0-Keimlingen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu sammeln, haben wir die nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Fraktionen isoliert und extrahiert. Die Entnahme von nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Fraktionen orientierte sich an den Ergebnissen der Polysomenprofilmessungen. Für die Extraktion von nicht-polysomalen und polysomalen RNAs verwenden wir das Phenol/Guanidiniumthiocyanat-Reagenz, um die isolierten nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Proben zu extrahieren. Mit der von uns verwendeten RNA-Extraktionsmethode können wir stabile und qualitativ hochwertige RNA für unsere folgende Analyse erhalten (Tabelle 1). Normalisieren Sie anschließend die extrahierte RNA mit dem GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit, um Fehler zu mindern, die durch unterschiedliche Extraktionsverluste verursacht werden. Als nächstes wurde die Echtzeit-PCR verwendet, um die Expression von DAP-Genen zu quantifizieren, die in den dem Kit hinzugefügten B. subtilis-Genen enthalten sind. Eine vergleichende Analyse der DAP-Genexpressionsniveaus zwischen nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Gruppen wurde durchgeführt, um den RNA-Gehalt unter Bedingungen des proportionalen Verlusts abzuschätzen (Abbildung 3A). Wir berechneten das Verhältnis von normalisierter polysomaler RNA zu Gesamt-RNA, um die Translationseffizienz zwischen ihnen zu klären (Abbildung 3B). Schließlich wurde das Verhältnis von RNA in Polysomen unter Verwendung des normierten RNA-Gehalts berechnet (Abbildung 3C). Die Ergebnisse des RNA-Verhältnisses in Polysomen unter verschiedenen Behandlungen von Col-0 zeigten ein Muster, das mit den in Abbildung 2A gezeigten Ergebnissen des Polysomenprofils übereinstimmte. Beide Ergebnisse deuten darauf hin, dass Hitzestress das RNA-Verhältnis in der polysomalen Fraktion signifikant reduziert und dieser Effekt nach einer 2-stündigen Erholung bei 22 °C wieder rückgängig gemacht werden kann (Tabelle 1).
Mit diesem Verfahren können wir die gesamte nicht-polysomale oder polysomale RNA-Fraktion mit hoher Qualität erhalten, anstatt die RNA in zusätzliche Fraktionen zu trennen23. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass sowohl Polysomenprofile als auch der Anteil an RNA in Polysomen die Translationseffizienz in Arabidopsis unter verschiedenen behandelten Bedingungen effektiv widerspiegeln können.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig01.jpg"> Abbildung 1: Workflow-Diagramm für die Polysomenprofilierung. (A) Schematische Darstellung der Vorbereitung des Saccharosegradienten in einem 13-ml-Zentrifugenröhrchen. (B) Das Flussdiagramm veranschaulicht den experimentellen Prozess der Polysomenprofilierung. Zunächst wird das Translatom extrahiert. Anschließend werden nicht-polysomale und polysomale RNA anhand ihrer Dichteunterschiede mittels Ultrazentrifugation in Saccharosegradienten unterschiedlicher Dichte getrennt. OD254 wird mit einem Dichtegradientenfraktionator gemessen, um das untenstehende Ergebnisdiagramm der Polysomenprofilierung zu erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig02.jpg"> Abbildung 2: Polysomen-Profilierung von Col-0 unter verschiedenen Bedingungen. (A, B, C) Die Polysomenprofilierung von Col-0 ergibt sich unter den Bedingungen (A) keine Wärmebehandlung (Kontrolle), (B) Wärmebehandlung bei 40 °C für 1 h und (C) Rückgewinnung bei 22 °C für 1 h nach der Wärmebehandlung. Die nicht-polysomale und polysomale RNA wurden unter Verwendung eines Saccharosegradienten von 12,5 % bis 60 % fraktioniert. Die Positionen der nicht-polysomalen (NP) und polysomalen (PL) RNA sind auf den Profilen angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67445/67445fig03.jpg"> Abbildung 3: Workflow-Diagramm für die nicht-polysomale und polysomale RNA-Extraktion. (A) Eine Illustration der RNA-Normalisierung durch Spike-in. (B) Eine Veranschaulichung der Trennung von nicht-polysomaler und polysomaler RNA und die Berechnung des Prozentsatzes polysomaler RNA. (C) Der prozentuale Anteil an polysomaler RNA in Col-0, die unter verschiedenen Bedingungen behandelt wurde. Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD an (n=3 biologische Wiederholungen). *p-Wert &lt; 0,01, Schüler-t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67445/67445fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Inhalt (ng)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Steuerung</td>
			<td>RNA-NP</td>
			<td>758.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>302.3</td>
			<td>2.21</td>
			<td>2.13</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Hitzestress</td>
			<td>RNA-NP</td>
			<td>821.5</td>
			<td>2.2</td>
			<td>2.15</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>174.3</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.21</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Genesung</td>
			<td>RNA-NP</td>
			<td>797.2</td>
			<td>2.17</td>
			<td>2.16</td>
		</tr><tr><td>RNAPL</td>
			<td>300.9</td>
			<td>2.19</td>
			<td>2.18</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Gehalte und Qualitäten an nicht-polysomaler und polysomaler RNA. Diese Tabelle zeigte, dass die RNA-Gehalte und -Qualitäten analysiert wurden. Der RNA-Gehalt wurde nach der Extraktion mit modifizierten Methoden normalisiert.

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Translational control of different genes under heat stress is a critical step for plant adaptation to the environment. Assessing the translational ...

translation-efficiency-test-using-polysome-profiles-under-heat-stress

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

Die Fähigkeit der Zellen, sich an Stress anzupassen, ist entscheidend für ihr Überleben. Die Regulation der mRNA-Translation ist eine solche Anpassungsstrategie, die eine schnelle Regulation des Proteoms ermöglicht. Hier stellen wir ein standardisiertes Polysomen-Profiling-Protokoll zur Verfügung, um spezifische mRNAs zu identifizieren, die unter Stressbedingungen selektiv translatiert werden.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Extraktion und Fraktionierung von Transkripten aus pflanzlichem Gewebe auf der Grundlage der Anzahl der gebundenen Ribosomen. Es ermöglicht eine globale Abschätzung der Translationsaktivität und die Bestimmung des Translationsstatus spezifischer mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Das übergeordnete Ziel der Polysome Profilerstellung Technik ist Analyse der übersetzerischen Tätigkeit der einzelnen mRNAs oder Transkriptom mRNAs während der Proteinsynthese. Die Methode ist für Studien von Protein-Synthese-Verordnung, Übersetzung Aktivierung und Repression in Gesundheit und mehrere menschliche Krankheiten wichtig.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Polysome Profilierung auf das Herz isoliert PERFUNDIERTEN Maus durchführen. Wir beschreiben Methoden für Herz Perfusion, Polysome Profilierung und Analyse der Polysome Fraktionen in Bezug auf mRNAs, MiRNAs und Polysome Proteom.

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

In diesem Video werden wir beschreiben eine Methode zur Beurteilung der Person psychophysiologische Reaktion auf Stress mit Biofeedback. Wir werden außerdem allgemeine Leitlinien für die Planung der Behandlung.

Psychophysiologische Stress Assessment mit Biofeedback

Erfahren Sie die Polysomenprofilierung zur Analyse der Translationseffizienz unter Hitzestress bei Arabidopsis thaliana. Diese standardisierte Methode ermöglicht die Isolierung von ribosomenassoziierten mRNAs für translatomische Studien.

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

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