Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von Motilitätsphänotypen bei Pseudomonas aeruginosa

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, zu verstehen, wie Bakterien funktionieren und Infektionen verursachen, mithilfe von Systembiologie und Genomik. Wir haben das Ziel, die Gene zu identifizieren, die die bakterielle Physiologie beeinflussen, wenn sie die Infektionsumgebung nachahmen, um neue Ziele für die Entwicklung besserer Antibiotika und alternativer Behandlungen zu finden. Wir entwickelten ein Hochdurchsatzprotokoll, um genetische Faktoren zu identifizieren, die die Motilität von Pseudomonas aeruginosa beeinflussen, und so genomweite Analysen von Schwarm- und Zuckungsverhalten ermöglichen. Diese Forschungsinitiative deckte molekulare Mechanismen auf, die die Beweglichkeit antreiben und auch zur Bildung von Biofilmen, zur Besiedlung und zur Umgehung der Wirtsabwehr beitragen.

Er ist an verschiedene Assays und Bakterienarten anpassungsfähig. Zunächst nehmen Sie die Quellplatten der Mutantenbibliothek von Pseudomonas aeruginosa transposon und lassen Sie sie etwa eine Stunde lang flach auf einer Oberfläche bei Raumtemperatur liegen, damit sie abkühlen. Für den gewünschten Test wählen Sie M9-Glukose-0,5%-Agar-Platten zum Schwärmen und LB-Agar-1%-Agar-Platten zum Zucken.

Um den Replikator für eine genaue Kolonieübertragung zu konfigurieren, schalten Sie den Replikator ein. Im Abschnitt "Modus auswählen und ausführen" wählen Sie ausgewählte gespeicherte Programme auswählen und ausführen. Im Abschnitt "Quellplatten auswählen" wählen Sie Plus-Platte 384 Agar.

Dann wähle im Abschnitt "Ziel-Platten auswählen" Plus-Platte 384 Agar aus. Wählen Sie im Abschnitt "Pads aus" den kurzen Pin 384 aus. In Singer-Programmen wählst du viele replizieren, dann zu Optionen für Programme replizieren und allgemein, recyceln und keine auswählen.

Im Abschnitt Quelle wähle Versatz, dann Zufalls- und Standardradius. Im Abschnittsziel wähle Pinning und justiere den Druck auf 2 %. Alle anderen Einstellungen bleiben Standardeinstellungen. Dann stecken Sie den kurzen Pin RePads 384 in das entsprechende Fach.

Positionieren Sie die Quell- und Zielplatten auf der vorgesehenen Plattform des Replikators. Platziere die 384-Dichte-Quellplatten und die leeren Motilitätsplatten auf die Plattform. Drücken Sie mit den ausgewählten Parametern, um den Übertragungsprozess zu starten.

Der mikrobielle Array-Pinning-Roboter überträgt Kolonien von den 384-Dichte-Quellplatten auf die Motilitätsplatten. Anschließend legen Sie die geimpften Motilitätsplatten in Plastiktüten. Legen Sie die Beutel mit den Tellern vorsichtig in den Inkubator, eingestellt auf 37 Grad Celsius für 18 Stunden.

Nach der Inkubationszeit werden hochauflösende Bilder der Motilitätsplatten mit einer hochwertigen Bildgebungssoftware aufgenommen. Nach Durchführung des Motilitätstests und der Bildgebung der Motilitätsplatten wird das Makro in ImageJ durchgeführt. Öffnen Sie den Ordner mit den Bildern, um das Batch zur Analyse zu laden.

Wenn du aufgefordert wirst, ändere den Winkel mit der Vorschauoption, bis die Platte gerade steht, um die Drehung der Platte anzupassen. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf den Okay-Button. Bewegen Sie dann das rechteckige Werkzeug um die Kolonien, um den Teil der Platte mit den Kolonien zu beschneiden.

Wenn Sie bereit sind, klicken Sie auf Okay, um den Zuschnitt abzuschließen. Definieren Sie das Gitter, das zur Zeichnung des Interessensbereichs (ROI) um jede Kolonie verwendet wird, und messen Sie die Motilitätsfläche. Wählen Sie die passende Koloniedichte aus und passen Sie die Parameter entsprechend an, um sicherzustellen, dass jeder Kreis um eine Kolonie herum positioniert ist.

Wenn du bereit bist, aktiviere das Okay-Feld und klicke auf den Okay-Button. Der Motilitätsbereich jeder Kolonie wird gemessen, und eine CSV-Datei mit den Daten wird im vorgesehenen Ordner gespeichert. Für den Motilitätstest wird eine Agarlösung mit M9, Glukose, Casaminosäuren und Magnesiumsulfat autoklaviert.

Gießen Sie 25 Milliliter des abgekühlten, gemischten Agar in jede Petriplatte. Anschließend wird jede Platte mit 2,5 Mikrolitern Bakterienkultur über Nacht geimpft und 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, wobei die Deckel nach oben gerichtet sind, um die Motilitätsphänotypen zu beobachten. Nach dem Autoklavieren einer LB-Lösung mit 1 % Agar wird 25 Milliliter des abgekühlten, gemischten LB 1 % Agar in Petriplatten gegossen.

Stechen Sie Impfbakterien an die Unterseite der zuckenden Platten, die 1 % Agar enthalten. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden und dann weitere 48 Stunden bei Zimmertemperatur. Nach dem Inkubieren wird der Agar vorsichtig von den Platten entfernt.

Visualisieren Sie die Zuckungszone, indem Sie die Petrischale mit einer 1%-Kristall-Violettlösung färben. Der Twitching-Motility-Assay zeigte, dass Pseudomonas aeruginosa-Mutanten mit T4P-Maschinengen-Deletionen signifikant kleinere Halo-Regionen aufwiesen als der Wildtyp, was auf eine verminderte Zuckungsbeweglichkeit hinweist. Die Analyse der Schwarmmotilität zeigte, dass Deletionsmutanten der PA14-Bibliothek signifikant reduzierte Halo-Regionen ohne Vorsprünge aufwiesen, was eine defekte Schwarmfähigkeit bestätigt.

Bakterielle Motilitätsstudien sind oft durch ihren Durchsatz begrenzt. Unser Hochdurchsatz-Motilitätsprotokoll wird Forschern helfen, die bakterielle Motilität umfassend zu untersuchen. Durch die Verwendung einer genomweiten Mutantensammlung ist es beispielsweise möglich, alle mit der Motilität verbundenen Gene zu identifizieren und aufzuzeigen, wie Bakterien Infektionen verursachen.

Unsere Ergebnisse werfen neue Fragen zur genetischen Kontrolle der Motilität bei Pseudomonas aeruginosa, ihrer Rolle bei der Biofilmbildung und ihrer Verbindung zur Pathogenese auf. Sie helfen außerdem bei der Untersuchung, wie Umweltbedingungen das Motilitätsverhalten beeinflussen und ob gezielte Motilitätsgene zu innovativen antimikrobiellen Therapien führen könnten.