Name: Fluoreszenzbasierter Nachweis der FEN1-Nukleaseaktivität und Screening von niedermolekularen Inhibitoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Erfahren Sie eine fluoreszenzbasierte Methode zur Detektion der FEN1-Nukleaseaktivität und zum Screening niedermolekularer Inhibitoren. Diese effiziente Technik ermöglicht die Entwicklung gezielter Krebstherapien.

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<ol><li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell-virus-virophage+tripartite+infection+systems+discovered+in+the+freshwater+lake+Dishui+Lake+in+Shanghai%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China.</a> J Virol. 94 (11), e00149(2020).</li>
<li>Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virophages+of+giant+viruses%3A+An+update+at+eleven%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Virophages of giant viruses: An update at eleven.</a> Viruses. 11 (8), 733(2019).</li>
<li>Paez-Espino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+evolution%2C+and+classification+of+virophages+uncovered+through+global+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics.</a> Microbiome. 7 (1), 157(2019).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regulation+of+FEN1+nuclease+and+its+link+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer.</a> Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).</li>
<li>Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+targeting+FEN1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy.</a> Biomolecules. 12 (7), 946(2022).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FEN1+promotes+DNA+damage+and+enhances+chemotherapeutic+response+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells.</a> Med Oncol. 40 (8), 242(2023).</li>
<li>Abdel-Fatah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+protein+expression+analysis+reveals+flap+endonuclease+1+%28FEN1%29+as+a+key+biomarker+in+breast+and+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer.</a> Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).</li>
<li>Guo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEN1+endonuclease+as+a+therapeutic+target+for+human+cancers+with+defects+in+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).</li>
<li>Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flap+endonuclease+1+%28FEN1%29+as+a+novel+diagnostic+and+prognostic+biomarker+for+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Res+Hepatol+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer.</a> Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).</li>
<li>Finger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3%27-flap+pocket+of+human+flap+endonuclease+1+is+critical+for+substrate+binding+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis.</a> J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).</li>
<li>Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-protein+interaction+modes+of+FEN-1+with+gap+substrates+and+their+implication+in+preventing+duplication+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations.</a> Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).</li>
<li>McWhirter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+fluorescence+polarization+DNA+cleavage+assay+for+the+identification+of+FEN1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors.</a> J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).</li>
<li>Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+non-radioactive+assays+for+investigation+of+human+flap+endonuclease+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity.</a> Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).</li>
<li>Van Pel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+synthetic+lethal+interaction+network+identifies+FEN1+as+a+broad-spectrum+target+for+anticancer+therapeutic+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).</li>
<li>Tumey, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+optimization+of+a+N-hydroxy+urea+series+of+flap+endonuclease+1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors.</a> Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).</li>
<li>Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+assay+of+FEN1+activity+with+nicking+enzyme-assisted+signal+amplification+based+on+ZIF-8+for+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells.</a> Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fragment+maturation+involves+%CE%B1-segment+error+editing+by+the+mammalian+FEN1%2FMutS%CE%B1+functional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex.</a> EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).</li>
<li>Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+FEN-1%2FPCNA+interaction+results+in+DNA+replication+defects%2C+pulmonary+hypoplasia%2C+pancytopenia%2C+and+newborn+lethality+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice.</a> Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).</li>
<li>Hilda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-based+3D+cell+culture+technique+to+evaluate+the+half-maximal+inhibitory+concentration%3A+An+in+vitro+model+of+anticancer+drug+study+for+anaplastic+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid+Res%22%5BJournal%5D)">Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma.</a> Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).</li>
<li>Nadine, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microstructure+analysis+of+polymer+amended+fluid+fine+tailings+using+Fiji-ImageJ+image+analysis+software%22">Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software</a>. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).</li>
<li>Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPablo%2C+T+%22Figshare%22">Figshare</a>. , (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCL</td><td>Beyotime</td><td>ST774</td><td></td></tr><tr><td>30% Acr-Bis (29:1)</td><td>Beyotime</td><td>ST003-500ml</td><td></td></tr><tr><td>5M Nacl</td><td>Beyotime</td><td>ST347</td><td></td></tr><tr><td>BeyoBlue Plus</td><td>Beyotime</td><td>P0003S</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)-FEN1</td><td>Vazyme</td><td>C504-F1</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>Nr. P0007</td><td></td></tr><tr><td>Entfärbender Shaker</td><td>Kylin-Glocke</td><td>TS-100</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Beyotime</td><td>ST041</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator für Trockenbad</td><td>RUICHENG</td><td>DH200</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophorese-Gerät</td><td>Bei jing Liuyi Biotechnologie</td><td>DDY-6D</td><td></td></tr><tr><td>FEN1-IN-4</td><td>ZielMOL</td><td>Nr. T8545</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (IPTG)</td><td>Takaba</td><td>9030</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Slufate</td><td>Bioscharf</td><td>Nr. BS152</td><td></td></tr><tr><td>Labor-Zentrifuge</td><td>Thermo</td><td>SL 16R</td><td></td></tr><tr><td>LB Brühe</td><td>Solarbio GmbH</td><td>Nr. L8291</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Sein Bindeharz</td><td>7SE Biotechnologie</td><td>PANF001-001C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>ODYSSEE</td><td>LI-COR</td><td></td></tr><tr><td>SDB-SEITE</td><td>Beyotime</td><td>P0015L</td><td></td></tr><tr><td>Trition-x-100</td><td>Shyuanye</td><td>Nr. S15022</td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenzbasierter nachweis der fen1-nukleaseaktivität und screening von niedermolekularen inhibitoren

Fluorescence-Based Detection of FEN1 Nuclease Activity and Screening of Small-Molecule Inhibitors

Wie in Abbildung 2A gezeigt, bindet das Färbereagenz an das Protein, wodurch das Protein als blaue Bande auf dem Gel erscheint. Die erste Spur enthält das markierte Protein, das als Molekulargewichtsreferenz verwendet wird, wobei die BSA-Standardproteinbande einem Molekulargewicht von 70 kDa und die FEN1-Nukleinsäureproteinbande einem Molekulargewicht von 45 kDa entspricht. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die FEN1-Nuklease bei etwa 45 kDa als klare Bande erschien, was auf eine e...

Fluoreszenzbasierter Nachweis der FEN1-Nukleaseaktivität und Screening von niedermolekularen Inhibitoren

FEN1 (Flap Endonuclease 1) is a key DNA nuclease involved in DNA replication and damage repair, playing a crucial role in maintaining genomic stability. ...

fluorescence-based-detection-fen1-nuclease-activity-screening-small

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine neuartige Methode, die quantitative Analyse von FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-Signale für das Studium Enzymkinetik beschrieben.

Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse für SENP1 Protease Kinetics Bestimmung

Exonukleasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewährleistung der Genomstabilität. Der Verlust der WRN-Exonuklease-Funktion führt zu vorzeitiger Alterung. Die Untersuchung von Substraten und anderen Anforderungen an die Nuklease in vitro kann helfen, ihre Rolle in vivo aufzuklären. Hier demonstrieren wir einen schnellen und reproduzierbaren fluoreszenzbasierten Assay zur Messung seiner Nukleaseaktivität.

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

Wir präsentieren eine Open-Source hohe Content-Analyse (HCA) Instrument unter Verwendung von automatisierten Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) zur Untersuchung von Protein-Interaktionen mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basiert Ablesungen. Die Datenerfassung für dieses openFLIM-HCA Instrument wird von der Software in μManager geschrieben gesteuert und Datenanalyse wird in FLIMfit unternommen.

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

NMR-basierte Aktivitätsassays wurden entwickelt, um Inhibitoren von zwei Nukleosid-Ribohydrolase-Enzymen zu identifizieren und zu charakterisieren. Es werden Protokolle für anfängliche zusammengesetzte Assays mit 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen bereitgestellt.

NMR-based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit verschiedenen menschlichen Bedingungen verbunden, die ihr Potenzial als Biomarker zugrunde liegen. Die modulare und einfach zu implementierende Screening-Methodik, die in diesem Papier vorgestellt wird, ermöglicht die Auswahl spezifischer Nukleinsäuresonden zur Nutzung der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten.

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Die Überwachung von Änderungen der Schmelztemperatur eines Zielproteins(z. B.Thermal Shift Assay, TSA) ist eine effiziente Methode zum Screening von Fragmentbibliotheken von einigen hundert Verbindungen. Wir präsentieren ein TSA-Protokoll, das eine robotergestützte Nano-Differential Scanning Fluorimetry (Nano-DSF) zur Überwachung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz und der Lichtrückstreuung für das Fragmentscreening implementiert.

Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

RASopathien sind multisystemische genetische Syndrome, die durch eine Hyperaktivierung des RAS-MAPK-Signalwegs verursacht werden. Potenziell pathogene Varianten, die auf ihre Validierung warten, treten kontinuierlich auf, während schlechte präklinische Evidenz die Therapie einschränkt. Hier beschreiben wir unser in vivo-Protokoll zum Testen und Kreuzvalidieren von RASopathie-assoziierten ERK-Aktivierungsniveaus und ihrer pharmakologischen Modulation während der Embryogenese durch...

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll führt eine fluorometrische Screening-Methodik ein, die zur Identifizierung von Inhibitoren der Proteinsynthese von Naturprodukten oder kleinen Molekülen optimiert ist. Seine Praktikabilität eignet es sowohl für die Grundausbildung in Arzneimittelforschungstechniken als auch für die Anwendung in Kampagnen der Arzneimittelchemie.

Ein fluoreszenzbasiertes Protokoll zur vorläufigen Screening von Proteinsyntheseinhibitoren aus natürlichen Quellen

Hier beschreiben wir eine Methode zur zellbasierten Visualisierung, subzellulären Lokalisierung und quantitativer Analyse von poly(ADP-ribose) (PAR)-angereicherten Fokussen in fixierten Säugetierzellen. Dieser Test ermöglicht die Quantifizierung von Stellen mit DNA-Schaden-induzierter PARP-Aktivierung, einschließlich derjenigen, die mit der Basen-Exzisionsreparatur oder der Reparatur eines Einzelstrangbruchs verbunden sind, in den Kkernen von genotoxin-exponierten Zellen.

Visualisierung und quantitative Analyse der durch Genotoxin induzierten PARP1/PARP2-Aktivierung in Zellen mit einem fluoreszierenden Fusionsprotein-basierten Reporter

Erfahren Sie eine fluoreszenzbasierte Methode zur Detektion der FEN1-Nukleaseaktivität und zum Screening niedermolekularer Inhibitoren. Diese effiziente Technik ermöglicht die Entwicklung gezielter Krebstherapien.

Fluoreszenzbasierter Nachweis der FEN1-Nukleaseaktivität und Screening von niedermolekularen Inhibitoren

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