Fluoreszenzbasierter Nachweis der FEN1-Nukleaseaktivität und Screening von niedermolekularen Inhibitoren

Wir haben eine fluoreszenzbasierte Methode zum Nachweis der FEN1-Nukleaseaktivitäten und zum Screening der niedermolekularen Inhibitoren entwickelt, um die Diagnostik und die gezielte therapeutische Forschung voranzutreiben.

Zu den aktuellen Herausforderungen bei der Expression gehören die Komplexität und die Sicherheitsbedenken konventioneller Methoden sowie die hohen Kosten und die spezielle Ausrüstung, die für bestehende fluoreszenzbasierte Techniken erforderlich sind.

Dieses Protokoll behebt die Unzulänglichkeiten traditioneller radiologischer Methoden und teurer Fluoreszenztechniken und bietet eine sicherere, effizientere und einfach zu bedienende Nachweislösung.

Unser Labor wird sich auf die Optimierung einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform konzentrieren, um in vivo Anwendungen und Mechanismen von FEN1-Inhibitoren in der Krebstherapie zu erforschen.

[Dozent] Entwerfen Sie zunächst DNA-Oligonukleotidstränge basierend auf der spezifischen Spaltungsaktivität von FEN1. Mischen Sie die einzelsträngigen DNA-Oligonukleotide in einem Annealing-Puffer. Fügen Sie 10 Mikroliter Glühpuffer und entionisiertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern zu erhalten. Anschließend erhitzen Sie das Reaktionsgemisch eine Minute lang bei 100 Grad Celsius in einem Metallbad. Setzen Sie das Röhrchen sofort auf 72 Grad Celsius um und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Schalten Sie dann die Wärmequelle aus und lassen Sie die Lösung allmählich auf Raumtemperatur abkühlen, um das vollständige doppelsträngige DNA-Substrat zu bilden. Für den FEN1-Nukleaseaktivitätsassay werden zunächst zwei Mikroliter des DNA-Substrats mit der FEN1-Nuklease im Reaktionspuffer kombiniert. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch in einem Metallbad bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Fügen Sie 20 Mikroliter 2X-Terminierungspuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Laden Sie dann 20 Mikroliter der terminierten Probe auf ein vorbereitetes denaturierendes 12%iges Polyacrylamidgel. Elektrophorese des Gels bei 100 Volt für 60 Minuten. Sobald dies abgeschlossen ist, visualisieren Sie die Elektrophoreseergebnisse unter einem Fluoreszenzbildgebungssystem. Übertragen Sie mit einer Pipette zwei Mikroliter Dimethylsulfoxid in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie zwei Mikroliter FEN1-Nuklease und 10 Mikroliter 2X-Reaktionspuffer in das Röhrchen und sechs Mikroliter deionisiertes Wasser. Mischen Sie die Lösung gründlich und inkubieren Sie sie dann 10 Minuten lang auf Eis. Nach der Inkubation pipettieren Sie zwei Mikroliter DNA-Substrat, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 Mikrolitern zu erreichen. Als nächstes wird eine Arbeitsverdünnung des FEN1-Nukleaseinhibitors FEN1-IN-4 hergestellt, indem eine zweifache serielle Verdünnung aus einer einmolaren Stammlösung in Dimethylsulfoxid durchgeführt wird. Pipettieren Sie jeweils zwei Mikroliter der FEN1-Nuklease und des verdünnten FEN1-IN-4-Inhibitors in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter 2X Reaktionspuffer und vier Mikroliter deionisiertes Wasser. Vorsichtig mischen und die Mischung 10 Minuten auf Eis inkubieren. Geben Sie nun zwei Mikroliter DNA-Substrat in das Röhrchen, um das endgültige Volumen auf 20 Mikroliter zu erhöhen. Das Reaktionsgemisch wird bei 37 Grad Celsius in einem Metallbad für 15 Minuten inkubiert. Beenden Sie dann die Reaktion durch Zugabe von 20 Mikrolitern Terminationspuffer. Eine klare Proteinbande bei etwa 45 Kilodalton bestätigte die erfolgreiche Aufreinigung der FEN1-Nuklease aus der induzierten Expression. Das Fluorescein-markierte doppelsträngige DNA-Substrat trat bei 80 Kilodalton auf, was eine erfolgreiche Synthese im Vergleich zum einzelsträngigen Substrat bei 59 Kilodalton bestätigt. Die FEN1-Nuklease spaltete das doppelsträngige DNA-Substrat mit 80 Nukleotiden dosisabhängig, wobei eine vollständige Spaltung bei 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter beobachtet wurde. Die FEN1-IN-4-Verbindung hemmte signifikant die Spaltung des doppelsträngigen DNA-Substrats durch FEN1, wie die Retention der 80-Nukleotid-Bande zeigt. FEN1-IN-4 reduzierte die FEN1-Nukleaseaktivität konzentrationsabhängig, mit einer halbmaximalen Hemmkonzentration von 14,03 Mikromolaren.