Ein fluoreszenzbasiertes Protokoll zur vorläufigen Screening von Proteinsyntheseinhibitoren aus natürlichen Quellen

Ein fluoreszenzbasiertes Protokoll zur vorläufigen Screening von Proteinsyntheseinhibitoren aus natürlichen Quellen. Die Proteinsynthese beinhaltet stark regulierte Prozesse, Transkription und Translation. Die Transkription wird hauptsächlich durch Transkriptionsfaktoren, Chromatinmodifikationen und regulatorische RNAs reguliert.

Während die Translation durch Initiierungsfaktoren, Signalwege und RNA-Stabilitätsmechanismen reguliert wird. Diese Regulationssysteme ermöglichen es den Zellen, zelluläre Funktionen aufrechtzuerhalten und effektiv auf Stress oder Schäden zu reagieren. Krebszellen stören die Proteinsynthese, indem sie translationale Mechanismen kapern, um ihren hohen Energiebedarf und ihr unkontrolliertes Wachstum zu unterstützen.

Diese Umprogrammierung ist das Ergebnis einer Dysregulation nahezu aller wichtigen onkogenen Signalwege, die das Überleben, die Proliferation und Metastasierung der Zellen fördert und gleichzeitig Zelltodwege unterdrückt. Da diese verbesserte Proteinsynthese für das Überleben von Krebs entscheidend ist, zeigen Behandlungen, die diesen Prozess ansprechen und blockieren, vielversprechende Therapien. Zur Identifizierung von Proteinsyntheseinhibitoren kann der folgende Proteinsynthese-Inhibition-Fluoreszenz-Test verwendet werden.

Vor Beginn des Experiments müssen Verbindungen, um verlässliche Ergebnisse zu erzielen, in einer angemessenen Konzentration unterhalb der Toxizitätsschwelle verabreicht werden. Um eine Anfangskonzentration festzustellen, sollte ein Zytotoxizitätstest durchgeführt werden, um das EC 50 der Verbindung zu bestimmen. Wenn dies nicht möglich ist, können die Verbindungen in diesem Test dosisabhängig getestet werden, um die wirksamsten Konzentrationsparameter zu bestimmen.

Wenn die Konzentration der Verbindungen den Zelltod auslöst, wird ein Test bei reduzierten Konzentrationen notwendig. Es ist außerdem wichtig, Farbstoffe jederzeit vor Licht zu schützen, wenn sie nicht verwendet werden. Eine längere Lichtbelichtung führt zu Photobleaching, was zu einer verminderten Datenqualität führt.

Schritt 3.1: Bereiten Sie das Hauptgemisch A vor, beschriften Sie ein Zentrifugenrohr als A, dann pipettieren Sie 598,5 Mikroliter Kulturmedium und 1,5 Mikroliter Protein in A. Setzen Sie diese Mischung erneut auf, um die Homogenität zu gewährleisten, indem Sie sie nach oben und unten pipettieren. Bereiten Sie nun die Hauptmischung B vor. Beschriften Sie ein Zentrifugenrohr als B, dann pipettieren Sie 1,5 Mikroliter Protein, 6,6 Mikroliter Cycloheximid und 591,9 Mikroliter Kulturmedium in B. Suspendieren Sie diese Mischung erneut, um die Homogenität zu gewährleisten, indem Sie sie auf und ab pipetieren. Nachdem ein Mikroliter Testverbindung und ein Mikroliter Vehikel in zwei Brunnen gepipettiert wurde, pipettieren Sie vorsichtig 99 Mikroliter Mastermischung A in beide diese Brunnen und pipettieren Sie schräg an die Seite des Brunnens, um kinetische Störungen der Zellen zu verhindern.

Pipetten Sie 100 Mikroliter Mastermischung B in zwei unbehandelte Brunnen. Pipette schräg in die Seite des Brunnens, um kinetische Störungen der Zellen zu verhindern. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die gewünschten Komponenten vollständig in die Zellen einzubinden.

Zellen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten bis zwei Stunden inkubieren. Entfernen Sie das Zellkulturmedium durch Aspiration. Neigen Sie die Platte und aspirieren Sie an der Seite des Bohrlochs statt in der Mitte, um kinetische Störungen der Zellen zu verhindern.

Dann geben Sie 100 Mikroliter PBS-Puffer in jede Mulde und zentrifugieren Sie die Platte bei 900 g für fünf Minuten. Nach dem Zentrifugieren sollten Sie daran denken, den PBS-Puffer durch Aspiration zu entfernen. Schritt fünf: Fixierung und Permeabilisierung.

Gib jedem Brunnen 100 Mikroliter fixierende Lösung hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 15 Minuten in einer dunklen Umgebung. Dann aspirieren Sie die Zellen.

Waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und entfernen Sie sie durch Aspiration. Wiederhole das zweimal. Fügen Sie jedem Bohrloch 100 Mikroliter Permeabilisierungspuffer hinzu.

Danach 10 Minuten bei Zimmertemperatur ausbrüten. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer durch Aspiration. Schritt sechs, Proteinreaktion und Färbung.

Bereite die Reaktionscocktail-Mastermischung vor. Fügen Sie 651 Mikroliter PBS-Puffer in ein Zentrifugenrohr hinzu. Dann gib sieben Mikroliter 100-faches Kupferreagenz dazu.

Dann sieben Mikroliter fluoreszierendes Azid. Und schließlich 35 Mikroliter Reduktionsmittel in das Zentrifugenrohr eingeben. Folgen Sie genau dieser Reihenfolge beim Zufügen der Reagenzien und geben Sie dann 100 Mikroliter des Reaktionscocktails zu jedem Brunnen.

Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in einer dunklen Umgebung bei Raumtemperatur, um Photobleaching zu verhindern. Zentrifugiere die Zellen bei 900g für fünf Minuten. Aspirieren, die Zellen waschen und dann erneut aspirieren.

Bereiten Sie eine 1-fache Verdünnung der gesamten DNA-Färbung vor und fügen Sie jedem Brunnen 100 Mikroliter hinzu. Inkubieren Sie Zellen bei Raumtemperatur für 20 Minuten in einer dunklen Umgebung, um Photobleaching zu verhindern. Zentrifugiere die Platte bei 900g für fünf Minuten.

Waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer und entfernen Sie sie durch Aspiration. Wiederhole diesen Schritt zweimal. Schließlich werden die Zellen mit 100 Mikrolitern gekühltem PBS-Puffer wieder suspendiert, um sie auf die Bildgebung vorzubereiten.

Schritt acht, Bildgebung. Stecken Sie die Platte in den Plattenleser und stellen Sie die Vergrößerung auf 20-fach ein. Analysieren Sie den Kernfärbung mit dem GFP-469/525-Nanometer-Kanal.

Verwenden Sie Autobending und Autofokus, um die Bildergebnisse zu verbessern. Analyse der aktiven Proteinsynthese mit dem Texas Red 586/647 Nanometer-Kanal. Verwenden Sie Autobending und Autofokus, um die Bildergebnisse zu verbessern.

Fluoreszierende Sonden sind empfindlich gegenüber Photobleaching, einem Phänomen, bei dem eine Lichtstrahlung dazu führt, dass Fluorophore ihre fluoreszierenden Eigenschaften verlieren. Farbstoffe sollten jederzeit vor Licht geschützt sein, wenn sie nicht verwendet werden. Zusätzlich muss die Anzahl der Scans in jedem Brunnen und die Zeit unter bestrahltem Licht begrenzt werden.

Eine längere Lichtbelichtung führt zu Photobleaching, was letztlich zu einer Beeinträchtigung der Datenqualität führt. Schauen wir uns die repräsentativen Ergebnisse an. Hier sind lebende Zellen in grünen Stellen zu sehen, und die aktive Proteinsynthese wird durch rote Proteine angezeigt.

Der bekannte Proteinsyntheseinhibitor Cycloheximid führt zu einem starken Rückgang der Proteinsynthese, wie in Abbildung 1B im Vergleich zum negativen Kontroll-DMSO in Abbildung 1A, es wird weniger rotes Leuchtstofflicht ausgestrahlt. Die Behandlung mit Verbindung 1, wie in Abbildung 1C zu sehen, führte entweder zu einer Zellablösung oder zum Zelltod. Daher können wir keine eindeutigen Behauptungen über die Hemmung der Proteinsynthese aufstellen.

Dies erfordert weitere Dosis-Wirkungs-Studien, um festzustellen, ob es die Proteinsynthese bei niedrigeren Konzentrationen hemmt. Verbindung zwei zeigt eine moderate Hemmung der Proteinsynthese, wie in Abbildung 1D dargestellt. Dieser fluorometrische Test ist ein wertvolles Forschungsinstrument und eine zugängliche chemische biologische Methode zur Ausbildung von Bachelor-Studierenden.

Durch die Bereitstellung eines zugänglichen, effizienten Protokolls mit minimaler Datenverarbeitung verschafft es den Studierenden praktische Erfahrungen und moderne Techniken zur Wirkstoffforschung und beschleunigt den Prozess der Arzneimittelentwicklung. Das Protokoll verwendet ein fluoreszierendes Substrat und fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopietechniken, um systematisch die hemmenden Fähigkeiten der natürlichen Produktverbindungen eins und zwei zu erkennen und zu messen. Mit Cycloheximid als Referenzinhibitor zeigten beide Naturprodukte unterschiedliche Hemmungen der Proteinsynthese.

Da die Nachfrage nach neuen Proteinsyntheseinhibitoren wächst, stattet dieser Ansatz Studierende mit sinnvollen Forschungsmöglichkeiten aus und trägt gleichzeitig zu Fortschritten in der Krebstherapie bei.