Name: Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Lernen Sie ein kostengünstiges Photoirradiationsverfahren zur Reduktion von Gewebeautofluoreszenz in FFPE-Proben. Diese Methode ermöglicht die Multiplex-Bildgebung von Immunzellinteraktionen in komplexen Geweben.

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<ol><li>Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1</a> (2023).</li>
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<li>Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in tuberculosis.</a> Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).</li>
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<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibex%3A+An+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
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<li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multispectral+led+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li>
<li>Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+embedding+and+LED+autofluorescence+reduction+for+rodent+spinal+cord+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology.</a> J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omic+profiling+of+follicular+lymphoma+reveals+changes+in+tissue+architecture+and+enhanced+stromal+remodeling+in+high-risk+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients.</a> Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IBEX+knowledge-base%3A+A+central+resource+for+multiplexed+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques.</a> PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).</li>
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<li>Mcshane, P. J., Glassroth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+disease+due+to+nontuberculous+mycobacteria%3A+Current+state+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights.</a> Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).</li>
<li>Hsu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+GATA2+are+associated+with+the+autosomal+dominant+and+sporadic+monocytopenia+and+mycobacterial+infection+%28monomac%29+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome.</a> Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).</li>
<li>Vinh, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+and+sporadic+monocytopenia+with+susceptibility+to+mycobacteria%2C+fungi%2C+papillomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses.</a> Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).</li>
<li>Filipe-Santos, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+susceptibility+to+mycobacteria+is+caused+by+mutations+in+nemo+impairing+CD40-dependent+IL-12+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production.</a> J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).</li>
<li>Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+fluorescence+of+NAD%28P%29H+in+whole-cell+preparations+of+tumours+and+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues.</a> Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).</li>
<li>Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+mitochondrial+deficiencies+in+living+cells+by+microspectrofluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry.</a> J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).</li>
<li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+ceroid+formation%3A+The+cellular+recycling+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system.</a> Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).</li>
<li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin%3A+Mechanisms+of+age-related+accumulation+and+influence+on+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function.</a> Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).</li>
<li>Jung, T., Bader, N., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin%3A+Formation%2C+distribution%2C+and+metabolic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences.</a> Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).</li>
<li>Sherratt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+and+the+ageing+elastic+fibre%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity and the ageing elastic fibre.</a> Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).</li>
<li>Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+collagen%3A+More+than+scaffolding%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Lung collagen: More than scaffolding.</a> Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+frequency-domain+fluorescence+spectroscopy+and+applications+to+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes.</a> Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,3 % Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. T8787</td><td>Lösung zum Blockieren des Puffers</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. A4503</td><td>Lösung zum Blockieren des Puffers</td></tr><tr><td>1% menschlicher BD Fc Block</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>564220</td><td>Fc-Block zum Blockieren des Puffers erforderlich</td></tr><tr><td>150 W LED-Lampe</td><td>Amazonas</td><td>B07VH3CVSF</td><td>LED-Lichtquelle für die Gewebe-Photobestrahlung</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Lösung zum Blockieren von Puffer- und Waschschritten</td></tr><tr><td>20 Gallonen Vorratsbehälter</td><td>Amazonas</td><td>B001B1C4G0</td><td>Behälter für den Photobestrahlungsprozess</td></tr><tr><td>40 W RGBW Flut LED-Lampe&nbsp;</td><td>Amazonas</td><td>B08QFPJSMD</td><td>RGB-Lichtquelle für die Photobestrahlung von Gewebe</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam (Englisch)</td><td>AB43019/NA</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Alpha-glatte Muskulatur Aktin DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Avidin/Biotin Blockierungskit</td><td>Abcam (Englisch)</td><td>Artikel-Nr.: ab64212</td><td>Avidin- und Biotin-Blockierungslösung</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>554714</td><td>Lösung zur Fixierung</td></tr><tr><td>BOND Entwachsungslösung</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221076</td><td>Lösung zur Entparaffinierung</td></tr><tr><td>BOND Epitop-Rückhollösung 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235529</td><td>Citratbasierte pH 6 Epitop-Rückgewinnungslösung (ER1)</td></tr><tr><td>BOND Epitop-Rückhollösung 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235530</td><td>EDTA-basierte pH-9-Epitop-Rückgewinnungslösung (ER2)</td></tr><tr><td>BOND Research Detektionssystem</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0396648</td><td>Automatisiertes Forschungsfärbereagenz</td></tr><tr><td>BOND RX Forschung Färber</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td>Automatisierte Färbeplattform für die Forschung</td></tr><tr><td>BOND Waschlösung</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221077</td><td>Puffer waschen</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>347420/AB_400298</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82/AB_11150959</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>FAB8165G/AB_2728839</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>CD45 Phycoerythrin (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE/NA</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135/AB_2892745</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A32814/AB_2762838</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32787/ AB_2762830</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson Immunforschung</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A32794/AB_2762834</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>EasyDip Färbesystem</td><td>Angebot für Neueinsteiger</td><td>5300KIT</td><td>Färbesystem für Objektträger</td></tr><tr><td>Fluormount-G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td>Einhängemedien</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Kernfärbung für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Imaris Dateikonverter x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Instrumente</td><td></td><td>Kostenloser Dateikonverter</td></tr><tr><td>ImarisViewer Software x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Instrumente</td><td></td><td>Kostenlose Bildbearbeitungssoftware</td></tr><tr><td>ImmEdge-Stift</td><td>Vector Laboratorien</td><td>H-4000</td><td>Hydrophober Barrierestift</td></tr><tr><td>Lithium-Borhydrid (1 Gramm)</td><td>STREM Chemikalien</td><td>93-0397</td><td>Chemikalie zur Farbstoffinaktivierung, kaufen Sie kleine Aliquots dieser Chemikalie (1 Gramm)</td></tr><tr><td>Lumican Biotin</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>BAF2846</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Micro Cover Brille</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>Glas-Diaabdeckungen</td></tr><tr><td>Pan-Cytokeratin Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750/AB_2868569</td><td>Antikörper für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>PELCO BioWave Pro Mikrowellensystem</td><td>Ted Pella Inc</td><td>36500-230</td><td>Wissenschaftliche Mikrowelle ohne Erwärmung</td></tr><tr><td>PELCO SteadyTemp Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>50062</td><td>Vollautomatische Temperaturregelung für wissenschaftliche Mikrowellen</td></tr><tr><td>SimpleITK</td><td>Open-Source-Software</td><td></td><td>Registrierungs- und Kanalverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. S11227</td><td>Markierungsreagenz für die IBEX-Bildgebung. Siehe Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Weitfeld-Mikroskop</td><td>Leica Mikrosysteme</td><td>NA</td><td>Leica Microsystems THUNDER Imager mit LED8-Lichtquelle und LAS X Software (3.7.1.21655). Für die Fluoreszenzbildgebung wurde ein spezieller Quad-Band-Filter mit externem Filterrad (PN: 11536075) mit zwei zusätzlichen Einzelbandfiltern (PN: 8118215) verwendet, um sieben Farbkanäle pro Durchgang abzubilden. Die Filteranregungs-, dichroitischen und Emissionslinien sind (1) Quad-Band-Würfel: dichroitisch bei 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, keine Anregungs- oder Emissionsfilter; (2) Außenfilterrad Position 1: 434/32, Position 2: 520/40, Position 3: 585/20, Position 4: 720/60, Position 5: Durchlauf; (3) Einzelband 1&ndash; 585/22 Anregung, 594 dichroitisch, 625/30 Emission; (4) Single-Band 2&ndash; 635/20 Anregung, 647 dichroitische, 667/30 Emission.</td></tr><tr><td>Zeiss Reiniger für optische Gläser</td><td>Amazonas</td><td>B00GPVQVCO</td><td>Reiniger für Objektive für Mikroskope</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Antikörper</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam (Englisch)</td><td>AB43019</td><td>Polyklonales Kaninchen IgG, Zyklus 1</td></tr><tr><td>Alpha-glatte Muskulatur Aktin DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R</td><td>1A4/asm-1, Zyklus 1</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>FAB8165G</td><td>Polyklonales Ziegen-IgG, Zyklus 1</td></tr><tr><td>CD8 Alexa Fluor 647</td><td>BioLegende</td><td>372906</td><td>C8/144B, Zyklus 1</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135</td><td>KP1, Zyklus 1</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A32814</td><td>Polyklonaler Esel, Zyklus 1</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A32787</td><td>Polyklonaler Esel, Zyklus 1</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A32794</td><td>Polyklonaler Esel, Zyklus 1</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Nukleares Etikett, Zyklus 1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>347420</td><td>MMA, Zyklus 2</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82</td><td>L26, Zyklus 2</td></tr><tr><td>CD45 Phycoerythrin (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>2B11 + PD7/26, Zyklus 2</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson Immunforschung</td><td>715-545-020</td><td>Polyklonaler Esel, Zyklus 2</td></tr><tr><td>Lumican Biotin</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>BAF2846</td><td>Polyklonales Ziegen-IgG, Zyklus 2</td></tr><tr><td>Pan-Cytokeratin Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>AE-1/AE-3, Zyklus 2</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. S11227</td><td>N/A, Zyklus 2</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>Zyklus 2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><stark>Lösungen</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer (Zyklus 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. T8787</td><td>0,3 Vol.-%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. A4503</td><td>1 Vol.-%</td></tr><tr><td>Mensch BD Fc Block</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>564220</td><td>1 Vol.-%</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>97,7 Vol.-%</td></tr><tr><td>Primär-Antikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blockieren des Puffers (Zyklus 1)</td><td>Siehe oben</td><td></td><td>Nach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biotium</td><td>40046</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>CD8 AF647</td><td>BioLegende</td><td>372906</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blockieren des Puffers (Zyklus 1)</td><td>Siehe oben</td><td></td><td>Nach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen</td></tr><tr><td>CD4&nbsp; Nr. AF488</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>FAB8165G</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam (Englisch)</td><td>AB43019/NA</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper-Färbelösung #1 (Zyklus 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blockieren des Puffers (Zyklus 1)</td><td>Siehe oben</td><td></td><td>Nach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziege AF Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A32814/AB_2762838</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen AF Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A32794/AB_2762834</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus AF Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. A32787/AB_2762830</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper-Färbelösung #3 (Zyklus 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blockieren des Puffers (Zyklus 1)</td><td>Siehe oben</td><td></td><td>Nach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen</td></tr><tr><td>CD68 iF594</td><td>Caprico Biotechnologies</td><td>1064135</td><td>1:10</td></tr><tr><td>a-SMA DL755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>1:30</td></tr><tr><td>BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2) </stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. T8787</td><td>0,3 Vol.-%</td></tr><tr><td>Mensch BD Fc Block</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>564220</td><td>1 Vol.-%</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>98,7 Vol.-%</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper-Färbelösung #4 (Zyklus 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)</td><td>Siehe oben</td><td></td><td>Nach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>347420</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Lumican Biotin</td><td>Forschung & Forschung D-Systeme</td><td>BAF2846</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>1:20</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-0202-82</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Pan-Cytokeratin AF750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper-Färbelösung #2 (Zyklus 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA-freier Blockierungspuffer (Zyklus 2)</td><td>Siehe oben</td><td></td><td>Nach Zugabe von Antikörpern auf Volumen auffüllen</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus IgM AF488</td><td>Jackson Immunforschung</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Strepavidin AF594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. S11227</td><td>1:200</td></tr></tbody></table>

optimierter workflow für iteratives bleaching erweitert die multiplex-bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen proben

Optimized Workflow for Iterative Bleaching Extends Multiplexity Imaging of Highly Autofluorescent Clinical Samples

Die Entwicklung eines Multiplex-Antikörper-basierten Bildgebungspanels erfordert viel Zeit, Aufwand und Ressourcen12. Diese Herausforderungen sind besonders ausgeprägt bei der Entwicklung eines Panels für archivierte FFPE-Proben aus stark autofluoreszierenden Geweben, wie hier beschrieben (Abbildung 1). Um diese Herausforderungen zu meistern, identifizierten wir zunächst die hellsten Fluorophore, die mit unserem Farbstoffinaktivierungsprotokoll kompatibel sind (<stron...

Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben

The prevalence of pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing globally. Though NTM-induced pulmonary disease often ...

optimized-workflow-for-iterative-bleaching-extends-multiplexity

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hintergrund Autofluoreszenz biologischer Proben erschwert oft Fluoreszenz basierende bildgebende Verfahren, vor allem im Alter menschlicher postmitotischen Gewebe. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Autofluoreszenz aus diesen Proben effektiv entfernt werden kann mit einer handelsüblichen Licht emittierende Diode Licht Quelle zu Photobleach die Probe vor Immunostaining.

Einfache Beseitigung von Hintergrundfluoreszenz in Formalin fixiert menschliche Gehirngewebe für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Ein detailliertes Protokoll für ein sechs-Marker multiplex Immunfluoreszenz-Panel optimiert und durchgeführt ist, mit Hilfe einer automatisierten Stainer für konsistentere Ergebnisse und eine kürzere Verfahrensdauer. Dieser Ansatz kann direkt von jedem Labor für Immuno-onkologischen Studien angepasst werden.

Automatisierte Multiplex Immunfluoreszenz Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf Formalin fixiert Karzinom Gewebeproben

Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie ist eine neue Technologie, die die Visualisierung mehrerer Zelltypen innerhalb intakten formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeermöglicht. Präsentiert werden Richtlinien zur Sicherstellung eines erfolgreichen 7-Farben-Multiplex mit Anweisungen zur Optimierung von Antikörpern und Reagenzien, zur Vorbereitung von Dias, Design und Tipps zur Vermeidung von häufigauftretenden Problemen.

Optimierung, Design und Vermeidung von Fallstricken in der manuellen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.

Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Die zyklische Multiplex-Immunhistochemie ermöglicht den gleichzeitigen In-situ-Nachweis mehrerer Marker durch wiederholte Antigen-Antikörper-Inkubation, Bildscannen sowie Bildausrichtung und -integration. Hier stellen wir das Operationsprotokoll zur Identifizierung von Immunzellsubstraten mit dieser Technologie in Lungenkrebs- und gepaarten Hirnmetastasenproben vor.

Zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.

Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben

Hier beschreiben wir die Anwendung der Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) Methode unter Verwendung kommerziell verfügbarer, automatisierter Gewebefärbegeräte und Optimierungsüberlegungen für die Verwendung von Tyramid-Signalamplifikations-basierten Reagenzien.

Iteratives Bleaching erweitert die Multiplizität durch den Einsatz von Färbeautomatisierung für Core-Anlagen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz, das optimiert wurde, um die dreidimensionale Architektur von Peritonealmetastasen zu charakterisieren.

Dreidimensionale Bildgebung von tumortragendem Gewebe mit dem iterativen Bleaching erweitert den Multiplexitätsansatz

Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baut auf der Basis-IBEX-Technik auf, indem es Heparin-Blocking hinzufügt, um unspezifische Bindungen zu minimieren, und die spektrale Detektion mit computergestützter Entmischung nutzt, um die Autofluoreszenz zu unterdrücken. Dieser Ansatz beschleunigt die Bildaufnahme bei gleichzeitiger Reduzierung von Hintergrundquellen und ermöglicht robuste mehrstufige räumliche Proteomanalysen mit hohen Parametern.

High-Plex-Bildgebung mittels spektral-konfokaler Mikroskopie zur Minimierung unspezifischer Gewebefluoreszenz

Multiplexierte Immunfluoreszenz ermöglicht die sequentielle Markierung mehrerer Antikörpermarker innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts, um die räumliche Analyse der Gewebearchitektur und Zellpopulationen zu unterstützen. Hier wird ein Arbeitsablauf zur Multiplexerkennung von seneszenzassoziierten, strukturellen und immunen Markern präsentiert, einschließlich manueller und automatisierter Objektträgervorbereitung, iterativer Bildgebung und Einzelzellanalyse mit digitaler Pathologiesoftware.

Multiplexierter Immunfluoreszenz-Assay zur räumlichen Bewertung von Altersmarkern in vivo

Lernen Sie ein kostengünstiges Photoirradiationsverfahren zur Reduktion von Gewebeautofluoreszenz in FFPE-Proben. Diese Methode ermöglicht die Multiplex-Bildgebung von Immunzellinteraktionen in komplexen Geweben.

Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben (Video) | JoVE Journal

Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben

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