Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben

[Erzähler] Mit Hilfe der räumlichen Proteomik, die von Nature Methods als Methode des Jahres 2024 ausgezeichnet wurde, können die genauen Standorte von Immunzellen sowie Zell-Zell-Interaktionen innerhalb von Geweben kartiert werden. Dabei zeigen sich räumliche Muster, die mit klinischen Ergebnissen verknüpft sind. Die Erstellung komplexer Antikörper-Panels und bildgebender Gewebe mit hoher endogener Fluoreszenz stellt IBEX und andere Fluoreszenzmikroskopietechniken vor erhebliche Herausforderungen an Zeit, Ressourcen und Fachwissen. Mit Hilfe von IBEX wurden tumorspezifische Merkmale bei Hochrisikopatienten mit follikulärem Lymphom und mit Kollegen vom Human Cell Atlas identifiziert. Es wurde eine umfassende räumliche Karte des menschlichen Thymus erstellt. Es ist wenig über die Zusammensetzung von Immunzellen, räumliche Wechselwirkungen und Unterschiede in der Zytokinproduktion bei verschiedenen mykobakteriellen Lungenpathologien bekannt. Dieses Protokoll schließt diese Lücke. Dieses Protokoll bietet eine kostengünstige, anpassungsfähige Photobestrahlungsmethode, um die Autofluoreszenz des Breitbandgewebes, insbesondere in schwierigen FFPE-Proben, deutlich zu reduzieren und gleichzeitig das Antikörpersignal für die räumliche Analyse zu erhalten. Tauchen Sie die Objektträger zunächst mit Gewebe in PBS, nachdem Sie die Antigengewinnung abgeschlossen haben. Nehmen Sie einen Objektträger aus dem PBS und trocknen Sie mit einem fusselfreien Tuch den überschüssigen Puffer vorsichtig ab, ohne das Taschentuch zu berühren. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Rand um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger. Nachdem Sie den Vorgang für die restlichen Objektträger wiederholt haben, lassen Sie die hydrophoben Barrieren 10 Minuten trocknen. Leiten Sie dann mit einem fusselfreien Tuch das PBS aus dem Gewebeabschnitt ab, ohne das Gewebe direkt zu berühren. Geben Sie nun 200 Mikroliter Blockpuffer auf den Objektträger und verschließen Sie die Feuchtigkeitskammer. Stellen Sie die Kammer in eine nicht erhitzende wissenschaftliche Mikrowelle mit Temperaturregelungsmechanismus und führen Sie das zuvor festgelegte Programm fünf Zyklen aus. Während der Blockierungsinkubation ist die primäre Antikörperfärbelösung 1 mit Haken und der Blockierungspuffer mit dem Fc-Block vorzubereiten. Kombinieren Sie die Antikörper und mixen Sie den Cocktail vorsichtig. Wenn der Mikrowellenzyklus abgeschlossen ist, entfernen und öffnen Sie die Objektträgerkammer und leiten Sie den Blockierungspuffer vom Objektträger ab, ohne das Gewebe zu berühren. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter primäre Antikörper-Färbelösung 1 in den Objektträger. Stellen Sie die Kammer wieder in die Mikrowelle und führen Sie das Primärantikörperprogramm erneut für ca. 30 Minuten aus. Sobald die Markierung des primären Antikörpers abgeschlossen ist, halten Sie den Objektträger senkrecht. Um den Objektträger zu waschen, pipettieren Sie 1.000 Mikroliter PBS auf das Gewebe und lassen Sie es ablaufen. Leiten Sie das überschüssige PBS ab und fixieren Sie den Objektträger mit 1% Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur in der Feuchtigkeitskammer. Waschen Sie den Objektträger nach dem Fixieren drei- bis fünfmal gründlich mit 1.000 Mikrolitern PBS und lassen Sie bis zum Photobestrahlungsschritt eine Schicht PBS auf dem Gewebe. Um die Photobestrahlungsbox vorzubereiten, besorgen Sie sich eine 150-Watt-LED-Lampe, eine 40-Watt-RGBW-Flut-LED-Lampe, einen großen Plastikbehälter mit einem Fassungsvermögen von 75,71 Litern oder mehr, frisches PBS und eine Petrischale. Füllen Sie nun die Petrischale mit 1x PBS, um den Objektträger vollständig einzutauchen. Führen Sie die Photobestrahlung in einem kalten Raum durch, um die Hitze der Lampen zu minimieren. Legen Sie dann den Objektträger in die Petrischale und stellen Sie sicher, dass er vollständig in PBS eingetaucht ist. Platzieren Sie anschließend die 40-Watt-Lampe direkt über der Petrischale, wobei die Lichtquelle nach unten zur Rutsche zeigt, und stellen Sie die Lampe auf den Rotlichtmodus. Schalten Sie abschließend sowohl die 150-Watt- als auch die 40-Watt-Lampe ein und decken Sie das gesamte Setup mit dem Deckel des Kunststoffbehälters ab. Schalten Sie die Lampe nach zwei Stunden auf grünes Licht und inkubieren Sie 16 Stunden lang. Die hellsten Fluorophore, die mit dem Farbstoffinaktivierungsprotokoll kompatibel sind, wurden identifiziert und mit niedrig exprimierten Markern gepaart, um die Signaldetektion zu verbessern. Die Autofluoreszenz war nach Photobestrahlung und bei längeren Bildgebungswellenlängen signifikant reduziert. Direkt konjugierte Antikörper, die auf hochexprimierte strukturelle Marker, Alpha-Aktin der glatten Muskulatur und Pan-Zytokeratin, abzielen und im nahen Infrarotkanal bei 750 Nanometern ersetzt werden. Das Hintergrundsignal wurde rechnerisch unter Verwendung eines ungefärbten Referenzbildes und der SimpleITK-Arithmetik subtrahiert, und die wahren Signale wurden durch Schwellenwerte verstärkt. Die Ganzdia-Bildgebung von IBEX-gefärbten Schnitten zeigte Granulome mit nekrotischen Kernen und CD15-positiven Neutrophilen. Mycobacterium tuberculosis oder nichttuberkulöse Mykobakterien wurden in der Nähe des nekrotischen Kerns des Granuloms mit Anti-Antigen-85B-Antikörpern nachgewiesen. Granulomassoziiertes lymphatisches Gewebe enthielt CD20-positive B-Zellen, CD4-positive T-Zellen, einige CD8-positive T-Zellen und CD45-Markierung aller Immunzellen in der Lunge. Die IBEX-Bildgebung ermöglichte auch die Visualisierung anatomischer Merkmale der Lunge, einschließlich Bronchialepithelzellen, arterieller glatter Muskulatur und CD68-positiver Makrophagen.