Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Einer unserer Forschungsschwerpunkte ist die Saatgutforschung. Unser Ziel ist es, die Frage zu beantworten, wie Endosperm zur Keimung von Samen beiträgt. Ein In-vitro-Assay namens Seed Growth Inhibition Assay hat die physiologische Bedeutung des Endosperms für die Samenkeimung gezeigt. Die Arabidopsis-Samen sind ziemlich klein, und die Position der Endosperm-Zellschicht befindet sich unter den Testa, den Zellen. Es ist eine Herausforderung, Endospermproben vorzubereiten, ohne sie chemisch zu fixieren. Bei früheren Analysen der Analyse des Endosperms wurden chemisch fixierte Proben verwendet, so dass sie die Bewegung der Proteine des Organismus nicht beobachten konnten. Unser Protokoll ermöglicht die Bildgebung der Dynamik von Endospermzellen in fünf Zellen. Unser Protokoll kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden und ermöglicht einen tieferen Einblick in die interzellulären Ereignis- und Molekülmechanismen sowie die reguläre Endosperm-Funktion.

[Erzähler] Zu Beginn züchten Sie Arabidopsis-Pflanzen auf Erde oder Steinwolle bis zur Blütephase. Markieren Sie vollständig geöffnete Blüten mit farbigen Fäden, um null Tage nach der Blüte anzuzeigen. Wählen Sie die Siliques 12 bis 16 Tage nach der Blüte für den nächsten Eingriff aus. Mit einer feinen Schere die markierten sich entwickelnden Siliquen am Stiel abschneiden und in 1,5 Milliliter Röhrchen sammeln. Bereiten Sie ein nasses Filterpapier für die Dissektion vor, um ein Austrocknen zu verhindern, und legen Sie die Probe unter ein Stereomikroskop. Mit zwei Pinzetten, eine mit dicken Spitzen zum Halten und die andere mit scharfen Spitzen zum Reißen. Trennen Sie ein Ventil von der Feder. Nehmen Sie dann mit der Pinzette bei geschlossenen Spitzen vorsichtig die sich entwickelnden Samen von den Siliques auf, um sie nicht zu beschädigen. Wenn Sie eine 27-Gauge-Injektionsnadel verwenden, erzeugen Sie eine etwa 0,1 bis 0,2 Millimeter große Narbe auf der Hoden und dem Endosperm, die den Embryo umgeben. Halten Sie den Samen mit einer Pinzette fest, ohne ihn zu zerdrücken, und machen Sie die Narbe an der Verbindungsstelle der Keimblätter und des Radikals. Schieben Sie nun den Embryo heraus, indem Sie den Samen mit einer Zange einklemmen, dabei darauf achten, dass die Samenhülle nicht zerquetscht wird und seine runde Form beibehalten wird. Führen Sie die Injektionsnadel in die leere Samenhülle an der Narbe ein und stechen Sie sie von innen nach außen ein. Halten Sie als Nächstes die Nadel an Ort und Stelle und kratzen Sie mit einer Pinzette mit geschlossener Spitze die Oberfläche des Testa ab. Schneide dann eine Seite der Samenhülle ab, damit sie sich öffnen kann. Öffnen Sie nun mit einer Zange mit scharfer Spitze die Samenhülle zu einem Blatt. Bei der isolierten Probe sollte es sich nun um eine Doppelschichtschicht handeln, die aus Endosperm und Testa besteht. Geben Sie trockene Arabidopsis-Samen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie einen Milliliter doppelt destilliertes Wasser hinzu. Bewahren Sie die Samen mindestens 40 Minuten bei Raumtemperatur auf. Bereiten Sie ein nasses Filterpapier auf dem Tisch des Stereomikroskops für die Dissektion vor und übertragen Sie die aufgenommenen Samen mit einer 1000-Mikroliter-Mikropipette auf das nasse Filterpapier. Legen Sie nun die Probe unter ein Stereomikroskop. Machen Sie mit einer Injektionsnadel eine etwa 0,2 Millimeter große Narbe auf der Hode und dem Endosperm, die den Embryo umgeben. Halten Sie den Samen mit einer Pinzette fest, ohne ihn zu zerquetschen, und zielen Sie auf die Verbindung zwischen dem Keimblatt und dem Radikal für die Narbe. Schieben Sie nun den Embryo heraus, nachdem Sie den Samen mit einer Zange eingeklemmt haben. Vermeiden Sie es, die leere Samenhülle zu zerquetschen und bewahren Sie ihre runde Form. Schneide mit einer Injektionsnadel sowohl die Ober- als auch die Unterseite der leeren Samenhülle ab, um sie in eine zylindrische Form zu bringen. Schneiden Sie dann die zylindrische Samenhülle entlang ihrer Mittelachse ab, um sie in zwei Stücke zu teilen. Das Ergebnis sollten zweischichtige Folien aus Endosperm und Testa sein. Legen Sie die isolierten Endospermproben als Platten auf einen Objektträger und montieren Sie sie in Wasser. Legen Sie abschließend vorsichtig ein Deckglas über die Probe und stellen Sie sicher, dass die Endospermschicht nach oben in Richtung des Deckglases zeigt. Verwenden Sie Nagellack oder Fett, um die Kanten des Deckglases zu versiegeln und ein Austrocknen zu verhindern, bevor Sie die Probe unter dem Mikroskop betrachten. Zahlreiche Endospermzellen und ihre intrazellulären Strukturen wurden erfolgreich aus Samen visualisiert, die 14 Tage nach der Blüte unter Verwendung des etablierten Präparationsprotokolls geerntet wurden. Im Zellkern von Endospermzellen wurden Photokörper nachgewiesen, die PHYB-GFP unter weißem Licht exprimierten, was ihr Vorhandensein und ihre Kernlokalisation bestätigte. Endospermzellen zeigten eine reversible Photokörperbildung bei abwechselnder Exposition mit fernem rotem und rotem Licht, was die Reversibilität und biologische Aktivität des PHYB-Photos bis zu 4,5 Stunden nach der Dissektion bestätigte. Es wurde eine fluoreszierende Zeitrafferbildgebung von Mitochondrien in intakten Endospermzellen nach dreistündiger Samenhemmung durchgeführt und eine mitochondriale Bewegung nachgewiesen. Eine dynamischere mitochondriale Motilität wurde in Endospermzellen nach einem Tag Samenhemmung beobachtet, was auf eine zunehmende Aktivität im Laufe der Zeit hinweist.