Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen

Unsere Forschung untersucht, wie Mikroglia die Gehirnreparatur nach pränatalen Hirnverletzungen beeinflussen. Und wir wollen herausfinden, ob die Modulation der Aktivität von Mikrogliazellen die langfristigen neurologischen Ergebnisse verbessern kann. Ich glaube, es ist die Komplexität der Reaktionen von Mikrogliazellen und die Herausforderung, diese Reaktionen so genau wie möglich zu beschreiben, um physiologische, aber auch pathologische Reaktionen und Krankheiten darzustellen.

Wir verwenden verschiedene Modalitäten, wie z.B. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Durchflusszytometrie-Experimente, um die Zustände und Funktionen der Mikroglia im sich entwickelnden Gehirn nach pränatalen Verletzungen zu charakterisieren. Eine große Herausforderung besteht darin, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Identität der Mikroglia während der Isolation zu erhalten, insbesondere zu neonatalen Zeitpunkten, wenn die Anzahl der Kleinhirnzellen begrenzt ist. Es stellt sich die Frage, wie Kleinhirninsulte im frühen Leben zu transkriptionellen Veränderungen in der Mikroglia-Subpopulation führen und wie gezielte Therapien diese Veränderungen modulieren könnten.

Zu Beginn sezieren Sie die spezifische Gehirnregion von Mäusen nach Bedarf. Übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine kleine Petrischale mit Mikroglia-Zellkulturmedium, die auf Eis gestellt wird, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Entfernen Sie mit einer Pipette das Mikroglia-Zellkulturmedium aus der Petrischale.

Schneiden Sie dann mit einem Skalpell das Gehirngewebe in derselben Petrischale fein ab. Übertragen Sie das homogenisierte Hirngewebe in Fünf-Milliliter-Röhrchen für die enzymatische Verdauung. Geben Sie zwei Milliliter Hanks'Balanced Salt Solution, ergänzt mit Kollagenase D und DNase 1, in jedes Röhrchen und verschließen Sie die Kappen fest mit Parafilm.

Inkubieren Sie die Röhrchen dann 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad und schütteln Sie sie alle fünf Minuten. Um die Verdauung zu stoppen, legen Sie die Röhrchen auf Eis. Lassen Sie das Homogenat dann durch einen 140-Mikrometer-Metallgewebefilter, um große Ablagerungen zu entfernen.

Trennen Sie mit einem Glasstößel vorsichtig die verbleibenden Zellen auf dem Filter. Waschen Sie den Metallgitterfilter bei jeder Wäsche mehrmals mit drei Millilitern Mikroglia-Zellkulturmedium. Sammeln Sie nun mit einer 10-Milliliter-Pipette das Filtrat und geben Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 500 g sieben Minuten lang bei vier Grad Celsius. Drehen Sie danach das Rohr vorsichtig um, um den Überstand zu entsorgen. Kratzen Sie das Rohr vorsichtig mit einem Gestell ab, um das Pellet wieder aufzuhängen.

Geben Sie dann 10 Milliliter einer kolloidalen Medienlösung auf 37%iger Siliziumdioxidbasis zu den resuspendierten Zellen. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 500 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit minimaler Bruchkraft. Aspirieren Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette die Myelinschicht von der Oberseite der Lösung.

Um die Zellen zu waschen, fügen Sie 10 Milliliter Hanks'Balanced Salt Solution hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g sieben Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen und das Pellet resuspendiert haben, geben Sie 10 Milliliter fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer in das Röhrchen. Nach der Zentrifugation wird das endgültige Pellet im verbleibenden Puffer für nachgelagerte Anwendungen wieder suspendiert.

Übertragen Sie alle isolierten Zellen in eine 96-Well-Platte mit konischem Boden. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie die Platte in einer einzigen Bewegung schnell um, um den Überstand zu entsorgen.

Suspendieren Sie dann das Zellpellet in 25 Mikrolitern Blockierlösung und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zur Herstellung der extrazellulären Antikörper-Färbemischung zentrifugieren Sie die Antikörper-Stammröhrchen bei 10.000 g, um Aggregate zu entfernen. Ohne das Pellet zu stören, das erforderliche Volumen aus dem Überstand ansaugen.

Stellen Sie mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer das Gesamtvolumen auf 25 Mikroliter ein. Geben Sie nun 25 Mikroliter der extrazellulären Antikörper-Färbemischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie ohne Mischen 150 Mikroliter fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer in jede Vertiefung.

Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie dann die Platte schnell um, um den Überstand in einer einzigen Bewegung zu entfernen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer und zentrifugieren Sie es wie zuvor gezeigt.

Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Saponin-Paraformaldehyd-Puffer, um die Zellen zu fixieren und zu permeablieren. Inkubieren Sie die Platte dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Geben Sie ohne Mischen 100 Mikroliter Saponinpuffer in jede Vertiefung.

Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie dann die Platte um, um den Überstand in einer einzigen Bewegung zu entfernen, und suspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern Saponinpuffer. Bereiten Sie als Nächstes Kompensationskontrollen vor, indem Sie 20 Mikroliter Kügelchen in 11 leere Vertiefungen geben.

Zur Herstellung der intrazellulären Antikörper-Färbemischung zentrifugieren Sie Antikörper-Stammröhrchen mit 10.000 g, um mögliche Aggregate zu entfernen. Ohne das Pellet zu stören, das erforderliche Volumen aus dem Überstand ansaugen. Stellen Sie das Volumen mit Saponinpuffer auf 50 Mikroliter ein.

Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 Mikrolitern intrazellulärer Antikörpermischung. Geben Sie einen Mikroliter jedes Antikörpers in die jeweiligen Bead-Wells und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie ohne Mischen 150 Mikroliter Saponinpuffer in jede Vertiefung mit Zellproben.

Geben Sie 100 Mikroliter fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer in jede Kompensationsvertiefung, um die Kügelchen zu waschen. Sobald die Platte zentrifugiert ist, resuspendieren Sie das Zellpellet und kontrollieren Sie 200 Mikroliter Saponinpuffer bzw. fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer. Die Platte bei 500 g sechs Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen.

Resuspendieren Sie sowohl die Zellproben als auch die Kompensationskontrollen in 200 Mikrolitern fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer. Übertragen Sie die Suspensionen in markierte, fluoreszenzaktivierte Zellsortierröhrchen. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung identifizierte einen ausgeprägten Mikroglia-Cluster, der sich von anderen Gehirnzelltypen auf der Grundlage von Transkriptionsprofilen unterscheidet.

Die differentielle Expressionsanalyse ergab signifikant hochregulierte Gene in Mikroglia, einschließlich Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 und P2ry12. Mikrogliazellen wurden erfolgreich aus lebenden Hirnproben isoliert, basierend auf ihrer ausgeprägten Expression von CD45- und CD11b-Markern. Unterschiedliche Mikroglia-Subpopulationen wurden auf der Grundlage von Kombinationen von Aktivierungsmarkern identifiziert, darunter CD80, CD86, iNOS, CD206 und Arg1, CD86 und CD64 sowie CD163 mit CD206.

Die Markergenexpression von Ptprc und Itgam war spezifisch für den Mikroglia-Cluster in der umap-Projektion lokalisiert, was die Identität dieser Zellen bestätigt. Die Violin-Plot-Analyse zeigte eine geringere Expression von entzündungshemmenden Markern wie Fcgr1 und Cd86 in behandelten Mikroglia im Vergleich zur Vehikelkontrolle.