Name: Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Lernen Sie Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Mäusegehirns. Diese Methode offenbart zelluläre Heterogenität und liefert Einblicke in zerebelläre Entwicklungsprozesse.

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<ol><li>Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+and+functional+development%3A+Genetics+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain structural and functional development: Genetics and experience.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>140 &Mikro; M Metallgitter-Filter&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. S3895</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit konischem Boden&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>Arginase 1 - Konjugat Pecy7 - Klon : A1exF5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>Tischstabile fluoreszierende Reagenzien</td><td>Invitrogen</td><td>Nr. A49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Konjugat Fitc - Klon : M1/70</td><td>BD Pharmingen</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - Konjugat SB600 - Klon : TNKUPJ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - Konjugierter APC - Klon : C068C2</td><td>BioLegende</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - Konjugat A700 - Klon : 30-F11</td><td>BD Pharmingen</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - Konjugat&nbsp; PerCP-eF710 - Klon : X54-5/7.1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - Konjugat SB436 - Klon : 16-10A1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - Konjugiertes Pe - Klon : GL-1</td><td>BioLegende</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>Nr. F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank'sche ausgewogene Salzlösung) 10x</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>Artikel-Nr.: 311506CL</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>VWR International</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent Bioproducts&nbsp;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - Konjugat PE- eF610 - Klon : CXNFT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Lebende/tote Amcyan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. L34957</td><td></td></tr><tr><td>Mikroglia-Zellkulturmedien</td><td>Lebenstechnologien</td><td>Nr. A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>Nr. P6148</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus für Ratte CD16/CD32</td><td>BD Biowissenschaften&nbsp;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>Nr. S7900</td><td></td></tr><tr><td>scRNAseq-Bibliotheken</td><td>10-fache Genomik</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidales Medium auf Siliziumdioxidbasis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nr. BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypan-Blau</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

durchflusszytometrie und einzelzellanalyse zur charakterisierung der mikroglia-aktivierung in der frühen postnatalen entwicklung des gehirns von mäusen

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

Dieses Protokoll nutzt die Durchflusszytometrie effektiv zur Charakterisierung von Mikroglia-Zellpopulationen in Gehirnproben von Mäusen, basierend auf der Expression ausgewählter Oberflächen- und intrazellulärer Marker. In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse aus den wichtigsten Schritten des Arbeitsablaufs detailliert beschrieben, wobei die Verteilung und Heterogenität der Mikroglia-Untergruppen als Reaktion auf experimentelle Bedingungen hervorgehoben wird.
Validierung von Vergütungs- und Gating-Strategien Kompensationsbeads wurden verwendet, um Fluoreszenzsignale zu kalibrieren und spektrale Überlappungen zwischen Fluorochromen zu korrigieren. Positive und negative Populationen für jedes Fluorochrom wurden klar getrennt, was eine genaue Generierung der Kompensationsmatrix ermöglicht. Die Gating-Schwellenwerte wurden zunächst mit der Fluoreszenz-Minus-Eins-Steuerung (FMO) während der Panel-Optimierung validiert, um das wahre Signal vom Hintergrund zu unterscheiden, insbesondere bei schlechten oder überlappenden Markern. Diese Schwellenwerte wurden anschließend in allen Experimenten mit denselben Färbepanel- und Zytometereinstellungen wiederverwendet, um die Konsistenz zu gewährleisten. Isotypkontrollen wurden einbezogen, um eine mögliche unspezifische Bindung zu überwachen, insbesondere für intrazelluläre Marker, wurden aber nicht für Gating-Entscheidungen verwendet.
Identifizierung von Mikrogliazellen Die Leben/Tot-Zell-Gating-Strategie (Amcyan) schloss tote Zellen erfolgreich aus. Die Gating-Strategie isolierte effektiv Mikroglia-Zellpopulationen basierend auf der Expression von CD45 (AF700) und CD11b (FITC). Die Parameter Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) wurden optimiert (FSC = 300, SSC = 200), um die Mikroglia-Population innerhalb des Punktdiagramms zu zentrieren (Abbildung 5).
Phänotypisierung von Mikrogliazellen Die Dot-Plot-Analyse ermöglichte die Identifizierung von Mikroglia-Subpopulationen auf der Grundlage der unterschiedlichen Expression von Oberflächen- und intrazellulären Markern. Unter Verwendung spezifischer Gating-Strategien in der FlowJo-Software wurde eine Untergruppe von Mikrogliazellen identifiziert, die CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) und iNOS (PE-eFluor 610) exprimieren (Abbildung 6A). Double Gating wurde auch verwendet, um Untergruppen zu definieren, die CD206 (APC) und Arg1 (PE-Cy7) exprimieren (siehe Abbildung 6B). Weitere Populationen wurden durch die Koexpression von CD86 (PE) und CD64 (PerCP-eFluor 710) sowie CD163 (Super Bright 600) und CD206 (APC) charakterisiert (Abbildung 6C,D). Diese phänotypischen Profile spiegeln die markerdefinierte Heterogenität innerhalb der Mikroglia-Population wider und demonstrieren die Fähigkeit dieses Protokolls, mehrere transkriptionell und immunologisch unterschiedliche Untergruppen zu unterscheiden, ohne auf feste funktionelle Zustände zu schließen.
Mikroglia-Einzelzellanalyse Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wurde verwendet, um die zelluläre Heterogenität zu visualisieren und die Mikrogliazellcluster unter anderen Gehirnzelltypen zu identifizieren. Jeder Punkt steht für eine einzelne Zelle, und der Cluster ist basierend auf der transkriptionellen Ähnlichkeit farbcodiert (Abbildung 2).
Innerhalb des Mikroglia-Clusters wurde eine differentielle Expressionsanalyse durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die unter experimentellen Bedingungen moduliert wurden. Gene mit einem adjustierten P-Wert ≤ 0,05 galten als differentiell exprimiert.
Es wurde ein Vulkandiagramm erstellt, um diese unterschiedlich exprimierten Gene von Mikrogliazellen zu visualisieren, wobei diejenigen mit hoher Faltungsänderung und statistischer Signifikanz hervorgehoben wurden (Abbildung 4).
Um diese Einzelzellergebnisse mit den Daten der Durchflusszytometrie zu vergleichen, wurde die Expression der Mikroglia-Marker CD45 und CD11b (Ptprc und Itgam) untersucht. Ein UMAP zeigt ihre Expression innerhalb verschiedener Zellpopulationen (Abbildung 7).
Schließlich wurde die Expression ausgewählter immunbezogener Marker untersucht, um die transkriptionelle Heterogenität zwischen Mikrogliazellen zu charakterisieren. Ein Violin-Diagramm zeigt die Expression von Genen wie CD80 und NOS- sowie von Mrc1, Arg1, Fcgr1 und CD163 auf Einzelzellebene (Abbildung 8). Diese Markerexpressionsmuster ermöglichen einen Vergleich mit durchflusszytometrischer Profilerstellung und verdeutlichen die molekulare Vielfalt von Mikroglia-Untergruppen unter experimentellen Bedingungen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Qualitätskontrolle von Einzelzell-Transkriptomdaten. (A) Verteilung des mitochondrialen RNA-Gehalts über die Zellen. Zellen mit &gt;30% mitochondrialer RNA wurden ausgeschlossen, um potenziell gestresste oder sterbende Zellen zu entfernen. (B) Zellen mit einem log10GenesPerUMI-&gt; 0,75 wurden herausgefiltert, um ein konsistentes Gen-zu-UMI-Verhältnis zu gewährleisten und das Rauschen von Bibliotheken mit geringer Komplexität zu reduzieren. (C) Zellen mit weniger als 500 nachgewiesenen Transkripten (nUMI) oder mehr als 300 nachgewiesenen Genen (nGENE) wurden ebenfalls ausgeschlossen, um Zellen von schlechter Qualität oder mehrere Zellen zu eliminieren. (D) Korrelationsdiagramm von NUMI und nGen, das den Einfluss von Filterschwellen veranschaulicht. Nachgewiesene Dubletten wurden entfernt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
Abbildung 2: UMAP-Visualisierung von Einzelzell-Transkriptomen. UMAP-Diagramm, das die Verteilung einzelner Zellen auf der Grundlage von transkriptomischen Profilen von zwei einzelnen Tieren zeigt. Jeder Punkt stellt eine Zelle dar, die nach Clusteridentität farbcodiert ist. Der Mikroglia-Zellcluster wird unter anderen Zellpopulationen identifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
Abbildung 3: ROC-Kurve des Random Forest-Klassifikators, der durch Kreuzvalidierung ausgewertet wurde. Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurve, die die Leistung des Random-Forest-Modells veranschaulicht, das zur Unterscheidung von Mikroglia von anderen Gehirnzelltypen auf der Grundlage von Genexpressionsprofilen verwendet wird. Das Modell wurde mit einem Satz von ~1000 Zellen mit bekannten Labels trainiert und mittels 10-facher Kreuzvalidierung evaluiert. Unter den fünf getesteten statistischen Modellen (Random Forest, logistische Regression, naive Bayes, Support Vector Machine und Entscheidungsbaum) erreichte das Random Forest-Modell die höchste Klassifizierungsleistung. Die Fläche unter der Kurve (AUC) spiegelt die Genauigkeit des Modells wider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Differentielle Genexpressionsanalyse in Mikrogliazellen. Das Vulkandiagramm stellt die log2-fache Veränderung gegenüber dem adjustierten P-Wert für Gene dar, die in Mikroglia zwischen den beiden Versuchsgruppen unterschiedlich exprimiert werden (Kontrolle vs. Kleinhirn-Hirn-Verletzung). Hochregulierte Gene werden in der interessierenden Gruppe stärker exprimiert (Ident.1), und herunterregulierte Gene zeigen eine verminderte Expression im Vergleich zur Referenzgruppe (Ident.2). Schlüssel, signifikant unterschiedlich exprimierte Gene werden markiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Gating-Strategie zur Identifizierung von Mikroglia mittels Durchflusszytometrie. (A) Gating-Strategie, angewendet auf Kleinhirnzellen einer Kontrollmaus am postnatalen Tag 3 (P3). (B) Singuletts wurden ausgewählt, um Dubletten auszuschließen. (C) Lebensfähige Zellen wurden unter Verwendung eines Lebensfähigkeitsfarbstoffs identifiziert; Ereignisse mit niedrigem FSC-A-Wert wurden ausgeschlossen, um Trümmer zu entfernen und die Analyse intakter Zellen sicherzustellen. (D) Mikroglia wurden als CD45+ und CD11b+ mit zwei unterschiedlichen Populationen identifiziert: CD45niedrig-CD11b int für ruhende Mikroglia und CD45int -CD11bhoch für aktivierte Mikroglia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
Abbildung 6. Charakterisierung von Mikroglia-Marker-Expressionsprofilen mittels Durchflusszytometrie. (A) Sequentielles Gating von CD45+ CD11b+ Zellen basierend auf CD80-, CD86- und iNOS-Expression. (B) Identifizierung einer Teilmenge, die CD206 exprimiert, gefolgt von einem Gating basierend auf der Arg1-Expression. (C) Identifizierung einer Untergruppe, die CD86 exprimiert, gefolgt von einem Gating basierend auf der CD64-Expression. (D) Identifizierung einer Untergruppe, die CD163 exprimiert, gefolgt von einem Gating basierend auf der CD206-Expression. Diese Gating-Strategien veranschaulichen die phänotypische Heterogenität von Mikroglia-Populationen basierend auf der Expression von Oberflächen- und intrazellulären Markern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
Abbildung 7: Bestätigung der Mikroglia-Identität anhand der Itgam - und Ptprc-Expression in Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten. UMAP zeigt die Transkriptionslandschaft von Kleinhirnzellen bei P15, wobei die Genexpression von Itgam und Ptprc über Cluster hinweg überlagert ist. Die Co-Expression dieser kanonischen myeloischen Marker unterstützt die Identifizierung von Mikroglia-Populationen und stimmt mit Markern überein, die in der Durchflusszytometrie verwendet werden, was eine Kreuzvalidierung zwischen transkriptomischen und Proteinanalysen ermöglicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
Abbildung 8: Expressionsprofile ausgewählter immunverwandter Gene in Mikrogliazellen, die durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung identifiziert wurden. Violin-Plots zeigen die Verteilung der Genexpression für CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 und CD163 über einzelne Mikrogliazellen. Diese Marker werden häufig mit immunbezogenen Prozessen in Verbindung gebracht und verdeutlichen die transkriptionelle Heterogenität, die innerhalb der Mikrogliapopulation beobachtet wird. Es werden Daten sowohl für Kontroll- als auch für Kleinhirnhirnverletzungen (CBI) gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Zusammensetzung der Lösungen, die für die Isolierung und Färbung von Nervenzellen verwendet werden. Diese Tabelle enthält eine detaillierte Zusammensetzung der Lösungen, die für die Zellisolierung und -färbung erforderlich sind, einschließlich ihrer jeweiligen Konzentrationen und Komponenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Antikörper-Mix-Konzentrationen für die extrazelluläre Färbung. In dieser Tabelle sind die Konzentrationen von Antikörpern und lebender/toter Lösung, die für die extrazelluläre Färbung verwendet werden, aufgeführt, wobei die erforderlichen Volumina und Verdünnungen für jeden Antikörper in der Färbemischung für eine Probe angegeben sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: Antikörper-Mix-Konzentrationen für die intrazelluläre Färbung. In dieser Tabelle sind die Konzentrationen der Antikörper aufgeführt, die für die intrazelluläre Färbung verwendet werden, wobei die erforderlichen Volumina und Verdünnungen für jeden Antikörper in der Färbemischung für eine Probe angegeben sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

Unsere Forschung untersucht, wie Mikroglia die Gehirnreparatur nach pränatalen Hirnverletzungen beeinflussen. Und wir wollen herausfinden, ob die Modulation der Aktivität von Mikrogliazellen die langfristigen neurologischen Ergebnisse verbessern kann. Ich glaube, es ist die Komplexität der Reaktionen von Mikrogliazellen und die Herausforderung, diese Reaktionen so genau wie möglich zu beschreiben, um physiologische, aber auch pathologische Reaktionen und Krankheiten darzustellen.Wir verwenden verschiedene Modalitäten, wie z.B. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Durchflusszytometrie-Experimente, um die Zustände und Funktionen der Mikroglia im sich entwickelnden Gehirn nach pränatalen Verletzungen zu charakterisieren. Eine große Herausforderung besteht darin, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Identität der Mikroglia während der Isolation zu erhalten, insbesondere zu neonatalen Zeitpunkten, wenn die Anzahl der Kleinhirnzellen begrenzt ist. Es stellt sich die Frage, wie Kleinhirninsulte im frühen Leben zu transkriptionellen Veränderungen in der Mikroglia-Subpopulation führen und wie gezielte Therapien diese Veränderungen modulieren könnten.Zu Beginn sezieren Sie die spezifische Gehirnregion von Mäusen nach Bedarf. Übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine kleine Petrischale mit Mikroglia-Zellkulturmedium, die auf Eis gestellt wird, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Entfernen Sie mit einer Pipette das Mikroglia-Zellkulturmedium aus der Petrischale.Schneiden Sie dann mit einem Skalpell das Gehirngewebe in derselben Petrischale fein ab. Übertragen Sie das homogenisierte Hirngewebe in Fünf-Milliliter-Röhrchen für die enzymatische Verdauung. Geben Sie zwei Milliliter Hanks'Balanced Salt Solution, ergänzt mit Kollagenase D und DNase 1, in jedes Röhrchen und verschließen Sie die Kappen fest mit Parafilm.Inkubieren Sie die Röhrchen dann 15 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad und schütteln Sie sie alle fünf Minuten. Um die Verdauung zu stoppen, legen Sie die Röhrchen auf Eis. Lassen Sie das Homogenat dann durch einen 140-Mikrometer-Metallgewebefilter, um große Ablagerungen zu entfernen.Trennen Sie mit einem Glasstößel vorsichtig die verbleibenden Zellen auf dem Filter. Waschen Sie den Metallgitterfilter bei jeder Wäsche mehrmals mit drei Millilitern Mikroglia-Zellkulturmedium. Sammeln Sie nun mit einer 10-Milliliter-Pipette das Filtrat und geben Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 500 g sieben Minuten lang bei vier Grad Celsius. Drehen Sie danach das Rohr vorsichtig um, um den Überstand zu entsorgen. Kratzen Sie das Rohr vorsichtig mit einem Gestell ab, um das Pellet wieder aufzuhängen.Geben Sie dann 10 Milliliter einer kolloidalen Medienlösung auf 37%iger Siliziumdioxidbasis zu den resuspendierten Zellen. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 500 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit minimaler Bruchkraft. Aspirieren Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette die Myelinschicht von der Oberseite der Lösung.Um die Zellen zu waschen, fügen Sie 10 Milliliter Hanks'Balanced Salt Solution hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g sieben Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen und das Pellet resuspendiert haben, geben Sie 10 Milliliter fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer in das Röhrchen. Nach der Zentrifugation wird das endgültige Pellet im verbleibenden Puffer für nachgelagerte Anwendungen wieder suspendiert.Übertragen Sie alle isolierten Zellen in eine 96-Well-Platte mit konischem Boden. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie die Platte in einer einzigen Bewegung schnell um, um den Überstand zu entsorgen.Suspendieren Sie dann das Zellpellet in 25 Mikrolitern Blockierlösung und inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zur Herstellung der extrazellulären Antikörper-Färbemischung zentrifugieren Sie die Antikörper-Stammröhrchen bei 10.000 g, um Aggregate zu entfernen. Ohne das Pellet zu stören, das erforderliche Volumen aus dem Überstand ansaugen.Stellen Sie mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer das Gesamtvolumen auf 25 Mikroliter ein. Geben Sie nun 25 Mikroliter der extrazellulären Antikörper-Färbemischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie ohne Mischen 150 Mikroliter fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer in jede Vertiefung.Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie dann die Platte schnell um, um den Überstand in einer einzigen Bewegung zu entfernen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer und zentrifugieren Sie es wie zuvor gezeigt.Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Saponin-Paraformaldehyd-Puffer, um die Zellen zu fixieren und zu permeablieren. Inkubieren Sie die Platte dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt. Geben Sie ohne Mischen 100 Mikroliter Saponinpuffer in jede Vertiefung.Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius. Drehen Sie dann die Platte um, um den Überstand in einer einzigen Bewegung zu entfernen, und suspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern Saponinpuffer. Bereiten Sie als Nächstes Kompensationskontrollen vor, indem Sie 20 Mikroliter Kügelchen in 11 leere Vertiefungen geben.Zur Herstellung der intrazellulären Antikörper-Färbemischung zentrifugieren Sie Antikörper-Stammröhrchen mit 10.000 g, um mögliche Aggregate zu entfernen. Ohne das Pellet zu stören, das erforderliche Volumen aus dem Überstand ansaugen. Stellen Sie das Volumen mit Saponinpuffer auf 50 Mikroliter ein.Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 Mikrolitern intrazellulärer Antikörpermischung. Geben Sie einen Mikroliter jedes Antikörpers in die jeweiligen Bead-Wells und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie ohne Mischen 150 Mikroliter Saponinpuffer in jede Vertiefung mit Zellproben.Geben Sie 100 Mikroliter fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer in jede Kompensationsvertiefung, um die Kügelchen zu waschen. Sobald die Platte zentrifugiert ist, resuspendieren Sie das Zellpellet und kontrollieren Sie 200 Mikroliter Saponinpuffer bzw. fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer. Die Platte bei 500 g sechs Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen.Resuspendieren Sie sowohl die Zellproben als auch die Kompensationskontrollen in 200 Mikrolitern fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer. Übertragen Sie die Suspensionen in markierte, fluoreszenzaktivierte Zellsortierröhrchen. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung identifizierte einen ausgeprägten Mikroglia-Cluster, der sich von anderen Gehirnzelltypen auf der Grundlage von Transkriptionsprofilen unterscheidet.Die differentielle Expressionsanalyse ergab signifikant hochregulierte Gene in Mikroglia, einschließlich Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 und P2ry12. Mikrogliazellen wurden erfolgreich aus lebenden Hirnproben isoliert, basierend auf ihrer ausgeprägten Expression von CD45- und CD11b-Markern. Unterschiedliche Mikroglia-Subpopulationen wurden auf der Grundlage von Kombinationen von Aktivierungsmarkern identifiziert, darunter CD80, CD86, iNOS, CD206 und Arg1, CD86 und CD64 sowie CD163 mit CD206.Die Markergenexpression von Ptprc und Itgam war spezifisch für den Mikroglia-Cluster in der umap-Projektion lokalisiert, was die Identität dieser Zellen bestätigt. Die Violin-Plot-Analyse zeigte eine geringere Expression von entzündungshemmenden Markern wie Fcgr1 und Cd86 in behandelten Mikroglia im Vergleich zur Vehikelkontrolle.

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Isolierung und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von hippokampalen Mikroglia aus adulten Mäusen

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Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen (Video) | JoVE Journal

Durchflusszytometrie und Einzelzellanalyse zur Charakterisierung der Mikroglia-Aktivierung in der frühen postnatalen Entwicklung des Gehirns von Mäusen

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