Name: Ein modularer Arbeitsablauf für quantitative, strukturelle und funktionale Analyse von Leptospira-Biofilmen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Erfahren Sie einen modularen Arbeitsablauf zur quantitativen und strukturellen Analyse von Leptospira-Biofilmen. Diese Methode integriert Kristallviolett-Assays, Mikroskopie und In-vivo-Modelle für standardisierte Biofilm-Forschung.

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<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm%3A+A+review+on+formation%2C+infection%2C+antibiotic+resistance%2C+control+measures%2C+and+innovative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment.</a> Microorganisms. 11 (6), (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilms+on+chronic+infections+and+medical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges.</a> Cureus. 15 (11), e48204(2023).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Beenken, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).</li>
<li>Wilson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+assessment+methods+for+biofilm+growth%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Rev+J+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review.</a> Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).</li>
<li>Yildiz, F. H., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+biofilms%3A+So+much+the+same+yet+so+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio biofilms: So much the same yet so different.</a> Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+saprophytic+and+pathogenic+Leptospires%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires.</a> Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).</li>
<li>Chiani, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Leptospira+spp.+in+a+mosaic+of+wetlands+used+for+livestock+raising+under+differing+hydroclimatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+interactions+of+Leptospira+interrogans+with+proximal+renal+tubule+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells.</a> BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).</li>
<li>Santos, A. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+formation+in+Rattus+norvegicus+%28Norway+rats%29+natural+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biofilm+formation+of+pathogenic+Leptospira+spp.+in+the+vitreous+humor+of+horses+with+recurrent+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis.</a> Microorganisms. 9 (9), (2021).</li>
<li>Dos Santos Ribeiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+biofilms+from+an+urban+community+in+Salvador%2C+Brazil%2C+shelter+previously+uncharacterized+saprophytic%C2%A0Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira.</a> Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogenic+leptospiral+protein+encoding+gene+%28lipL32%29+in+environmental+aquatic+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms.</a> Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+Toward+a+better+understanding+of+the+environmental+lifestyle+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Water%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira.</a> Front Water. 5, 1195094(2023).</li>
<li>Dias, C. S., Pinna, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+biofilms%3A+Implications+for+survival%2C+transmission%2C+and+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management.</a> Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).</li>
<li>Gomes, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+production+of+Leptospira+spp.+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Sci+Vet%22%5BJournal%5D)">Biofilm production of Leptospira spp. strains.</a> Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).</li>
<li>Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+quantification+using+the+96-microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate.</a> Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+and+survival+of+pathogenic+Leptospires+by+formation+of+biofilm+with+Azospirillum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum.</a> FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Commun. 5, 4462(2014).</li>
<li>Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-detached+cells%2C+a+transition+from+a+sessile+to+a+planktonic+phenotype%3A+A+comparative+study+of+adhesion+and+physiological+characteristics+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).</li>
<li>Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+golden+Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+leptospirosis-associated+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses.</a> Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).</li>
<li>Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+leptospirosis%3A+Of+mice+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters.</a> Front Immunol. 8, 58(2017).</li>
<li>Guedes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+enrichment+used+in+the+EMJH+medium+%28Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris%29+for+the+cultivation+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Argent+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp.</a> Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).</li>
<li>Iraola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+reveals+wide+expression+reprogramming+of+basal+and+unknown+genes+in+Leptospira+biflexa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms.</a> mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+transcriptome+highlights+adaption+to+starvation+and+general+stress+while+maintaining+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).</li>
<li>Thibeaux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zoonotic+pathogen+Leptospira+interrogans+mitigates+environmental+stress+through+cyclic-di-GMP-controlled+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).</li>
<li>Lawrence, J. R., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms.</a> Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+techniques+for+in+situ+analysis+of+the+biofilm+matrix+%28structure%2C+composition%2C+dynamics%29+by+means+of+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Relucenti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+biofilm+imaging%3A+Focus+on+SEM+and+VP-SEM+pros+and+cons%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons.</a> Biology (Basel). 10 (1), (2021).</li>
<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+A+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells.</a> J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.1 &mikro; Sterile hydrophile Polycarbonatmembran</td><td>it4ip</td><td>1000M25/861N101/13</td><td></td></tr><tr><td>12 mm sterile Glasdeckfolie</td><td>SPL</td><td>330164</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd (PFA)&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>21G-Nadel</td><td>BD Medical</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>24-Bohrloch-Mikroplatten</td><td>NUNC</td><td>143982</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glasboden-Schüssel</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Glasboden-Hi-Q4-Schüssel</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>96-Bohrloch-Mikroplatten</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Antifade-Montagemedium&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>29410</td><td></td></tr><tr><td>Carbonbeschichter</td><td>Leica Microsystem</td><td>Em ACE600</td><td></td></tr><tr><td>CFDA/SE-Tracer</td><td>Biolegende</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>Leitfähiger Kohlenstoffklebstoff</td><td>Elektronenmikroskopie-Wissenschaft</td><td>77816</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett (CV)</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>Dunkelfeldmikroskop</td><td>Leica Microsystem</td><td>11888846</td><td>Leica DM4000 B ausgestattet mit einem Dark Fiel Kondensator (Cat N&Deg; 11505142)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>83813.36</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>Gletscheressigsäure</td><td>Supelco</td><td>1.00063</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan</td><td>Acros Organics</td><td>120581000</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td>IN30</td><td></td></tr><tr><td>Invertiertes konfokales Mikroskop</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica DMI6000 TCS SP8 X</td><td>Konfokalmikroskop SP8</td></tr><tr><td>Invertiertes Mikroskop mit Phasenkontrastoptik</td><td>Nikon</td><td>CELL-S2</td><td>BioStation IM-Q</td></tr><tr><td>Leptospira Medium Base EMJH&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD&nbsp; 279410</td><td>EMJH-Medium für Leptospira</td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid (OsO4)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BCCG9181</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid&nbsp;</td><td>Biotium</td><td>40017</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT300</td><td></td></tr><tr><td>Natriumkacodylatpuffer&nbsp;</td><td>Thermowissenschaftliche Chemikalien</td><td>15453149</td><td></td></tr><tr><td>Spektrophotometer Varioskan Lux</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td>VLBL00GD0</td><td></td></tr><tr><td>Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Biosolve</td><td>0016232301BS</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (1 ml)</td><td>Chirana</td><td>CH03002L</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9 grüne fluoreszierende Nukleinsäurefärbung&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr></tbody></table>

ein modularer arbeitsablauf für quantitative, strukturelle und funktionale analyse von leptospira-biofilmen

A Modular Workflow for Quantitative, Structural and Functional Analysis of Leptospira Biofilms

Wenn das Inokulum korrekt vorbereitet ist, treten die Kulturen innerhalb von 3–5 Tagen in die mittlere Logaritmart-Phase ein und zeigenOD-405-Werte von ~ 0,2–0,4 mit hellen, stark beweglichen Feldern unter Dunkelfeldmikroskopie (≥ 90 % der beweglichen Zellen) und ohne sichtbare Klumpen. Suboptimale Präparate zeigen sich als träge Bakterien und heterogene Beweglichkeit im gesamten Feld; solche Kulturen liefern häufig schwache Biofilme und sollten verworfen werden. In der Praxis minimiert das gleichzeitige Überprüfen von Motilität und OD direkt vor der Aussaatung misslungene Durchläufe. Die Einrichtung dieser Qualitätskontrolltore in der Inokulumphase ist der beste Prädiktor für den Erfolg in nachgelagerten Anwendungen. Obwohl die Methodik für L. interrogans serovar Manilae L495 optimiert war, wurden dieselben Verfahren auch auf den Stamm Leptospira biflexa Patoc angewandt, um die artübergreifende Anwendbarkeit zu demonstrieren. L. biflexa bildet im Allgemeinen weniger kohäsive und dünnere Biofilme als L. interrogans, dennoch bleiben die charakteristische Entwicklungssequenz und strukturellen Merkmale mit geeigneten Parameteranpassungen nachweisbar. Die Einbeziehung beider Arten unterstreicht somit die Anpassungsfähigkeit des Arbeitsablaufs an pathogene und saprophytische Leptospira gleichermaßen .
Nach 21 Tagen statischer Brutzeit bei 30 °C in einer befeuchteten Kammer (bzw. der entsprechenden Dauer für die verwendete Leptospira-Art ) werden Biofilme sowohl auf Glasdeckfolien als auch auf hydrophilen Polycarbonatmembranen mit bloßem Auge sichtbar. Ein erfolgreiches Wachstum erzeugt nach 2–3 Wochen charakteristische CV-Muster, wie punktartige, verzweigte oder netzförmige Fußabdrücke, die an der Oberfläche befestigt sind (Abbildung 2A).
In einem typischen Durchlauf erreicht Wildtyp-L.-Interrogans Manilae L495 bis Woche 3 ~ 50 % Oberflächenabdeckung, während das Plateau der Mutanten mit niedrigem Biofilm bei etwa ~ 20 % und die Phenotypen mit hohem Biofilm auf ~70–80 % heranreichen und so einen praktischen Dynamikbereich für das Screening schaffen. Das Ausmaß der Biofilmbildung kann ebenfalls je nach Leptospira-Art und -stamm variieren; zum Beispiel entwickelt der L. biflexa Patoc-Stamm sichtbare Biofilme schneller, wobei frühere Studien bereits 120 Stunden nach der Impfung Strukturen als reife Biofilme35 betrachteten.
Die Kristallviolettfärbung bietet eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Biofilmbiomasse. In gut entwickelten Biofilmen führt die Färbung zu einer tiefvioletten Färbung, die auf den Bereich der Deckschicht oder Membran lokalisiert ist und auf hohe Mengen an angehefteter Biomasse hinweist (Abbildung 2A). Visuelle Hinweise während der Färbungs- und Lösungsschritte liefern ebenfalls nützliche Indikatoren für den Erfolg des Protokolls. Beispielsweise kann eine ungleichmäßige Verteilung des CV oder blasse Verfärbungen durch Untersäung, Verdunstung oder aggressives Waschen verursacht werden, das frühe Biofilme löst.
Absorptionswerte bei 570 nm spiegeln die Menge der zurückgehaltenen Färbung wider und damit die relative Biofilmdichte (Abbildung 2B). In repräsentativen Experimenten zeigen L. interrogans-Kulturen , die unter optimalen Bedingungen gezüchtet wurden, konsistente und reproduzierbare OD₅₇₀-Werte über Replikate hinweg, was eine stabile Biofilmbildung widerspiegelt. Im Gegensatz dazu werden häufig große Unterschiede zwischen Replikaten beobachtet, wenn Proben während der Mediumwechsel übermäßig pipettiert werden, was auf eine schlechte Haftung oder eine partielle Biofilmablösung hinweist. Eine solche Variabilität sollte als Zeichen technischer Probleme betrachtet werden, und die betroffenen Proben sollten ausgeschlossen oder das Protokoll sorgfältig überprüft werden. Bemerkenswert ist, dass L. biflexa Patoc unter ähnlichen Bedingungen umfangreichere Biofilme sowohl auf Glasdeckfolien als auch auf Polycarbonatmembranen bildet, was sich in höheren CV-Absorptionswerten widerspiegelt und zeigt, dass das Protokoll anpassungsfähig und wirksam bei Leptospira-Arten ist.
Eine erfolgreiche SEM-Vorbereitung kann bereits ab Tag 3 extrazelluläre Matrixablagerungen aufdecken, gefolgt von einer auffällig polarisierten Architektur in reifen Biofilmen: eine raue, kanalisierte Basalfläche (oft mit &gt; 5 μm Kanälen), die eine poröse innere Struktur verankert, und eine glattere apikale Fläche, in der Spirocheten in dichter Matrix eingegliedert sind (Abbildung 2C, D, E, F). Hochvergrößerungsfelder erfassen häufig verzweigte extrazelluläre Filamente und gelegentlich pilzähnliche Vorsprünge; Merkmale, die den Koaleszenzdynamiken im Zeitraffer entsprechen (Ergänzungsvideo 1). In suboptimalen Präparaten können kollabierte Matrizen, Ladung und undeutliche Zellumrisse beobachtet werden, die meist auf unzureichende Nachfixierung, unzureichende leitfähige Beschichtung oder schlechte Trocknung hinweisen. Wenn basal-apikale Polarität und durchdringende Kanäle sichtbar sind, stimmen SEM-Anzeigen eng mit konfokalen Schätzungen von Dicke und Porosität überein, was die erfolgreiche Durchführung sowohl der Präparation als auch der Bildgebung bestätigt.
In effektiven Zeitrafferreihen erscheinen isolierte Puncta innerhalb von 24–72 Stunden und verschmelzen schrittweise zu größeren Aggregaten, die über die Oberfläche schwingen, bevor Platzbeschränkungen ihre Bewegung verlangsamen (Abbildung 3A, B, C). Quantitative Segmentierung führt zu einer monotonen Zunahme der insgesamt abgedeckten Fläche, während die Gesamtzahlen steigen, ihren Höhepunkt nehmen und dann abnehmen, wenn Kollisionen und Fusionen zwischen ~12 und 216 Stunden dominieren. Diese Kinetik (Fläche nach oben, Anzahl der Aggregate nach unten) deuten auf aktive Akkretion und nicht auf einfache Sedimentation hin. Fehlgeschlagene oder grenzwertige Runs fehlen frühe Puncta, zeigen flache Flächen-über-Zeit-Kurven oder leiden unter Fokus-Drift, die durch instabile Temperatur/Luftfeuchtigkeit zusammenhängt. Die Aufrechterhaltung einer stabilisierten 30 °C-Umgebung mit 95 % Luftfeuchtigkeit und der Einsatz von Autofokus zu jedem Zeitpunkt stellen in der Regel klare Flugbahnen wieder, die sich für den Vergleich von Mutanten oder Behandlungen eignen.
Repräsentative Z-Stacks aus reifen Biofilmen zeigen schaumartige, mehrschichtige Architektur, typischerweise über 50 μm Dicke, wobei die meisten Zellen lebend färben (SYTO 9-positiv) und gelegentlich zentrale Hohlräume auf kollektive Umlagerungen während des Wachstums hinweisen (Abbildung 3D). Matrixproben können zur Untersuchung der Matrixzusammensetzung verwendet werden: WGA hebt Polysaccharid-Epitope hervor, BOBO-3-Markierungen reichlich extrazelluläre DNA und proteinselektive Färbungen liefern wenig externe zellassoziierte Signale (Abbildung 3E). Suboptimale Ergebnisse umfassen dünne oder diskontinuierliche Stacks, die von Propidiumiodid, starker Photobleaching oder inkonsistenten Verstärkungseinstellungen dominiert werden, was die quantitative Vergleichbarkeit untergräbt. Die gemeinsame Interpretation von Dicke, Biovolumen und Live/Tot-Verhältnissen (unter Berücksichtigung von Laserleistung, Detektorverstärkung und Pinhole-Konstanten unter den Bedingungen) bestätigt den Reifestatus und unterstützt direkte Vergleiche mit SEM-Ultrastruktur und CV-Biomasse.
Der Biofilm-Entstehungsprozess von Leptospira folgt typischerweise unterschiedlichen Phasen, wobei die genauen Zeitpunkte und Werte je nach Art oder Stamm variieren können. Unter Verwendung des L. interrogans-Stamms Manilae L495 als Referenz beinhaltet der erwartete Verlauf über 21 Tage eine Anfangsphase (Tage 0–3), in der die Bakterien überwiegend planktonisch bleiben und nur minimale Biofilme haben (Abbildung 4A). Darauf folgt eine exponentielle Wachstumsphase (Tage 3–7), in der sowohl planktonische als auch biofilmassoziierte Bakterien zunehmen und etwa 9 x 10⁸ Zellen/mL erreichen, begleitet von der Bildung und Expansion von Biofilmaggregaten. Zwischen Tag 7 und 12 nehmen planktonische Bakterien deutlich ab, während biofilmassoziierte Zellen ihren Höhepunkt erreichen und etwa 80 % der Population ausmachen. Schließlich nimmt während der Reifungsphase (Tage 12–21) die Anzahl der Biofilmbakterien ab, ohne dass die Planktonzellen zunimmt, doch die Größe und Komplexität des Biofilms wachsen weiter. Die Beobachtung dieser Abfolge von Veränderungen zeigt, dass das Protokoll die dynamische Entwicklung und Reifung von Leptospira-Biofilmen effektiv erfasst.
Bei richtiger Ausführung verwendet das Infektionsprotokoll Inokula mit ~2 x 10⁸ Leptostürmen in 200 μL EMJH, die aus gut definierten planktonischen (5-Tage-) oder Biofilmkulturen (21-Tage) hergestellt werden. Obwohl diese beiden Kulturtypen unterschiedliche physiologische Zustände darstellen, ist dieser Unterschied beabsichtigt, da das Experiment bestimmen soll, ob Leptospira-Biofilme – gekennzeichnet durch verminderte metabolische Aktivität und strukturelle Differenzierung – die Fähigkeit behalten, eine Infektion zu initiieren. Dieser Kontrast wird durch transkriptomische Studien gestützt, die bedeutende Veränderungen in der Genexpression zwischen planktonischer und Biofilm Leptospira35,36 zeigen. Biofilmaggregate werden sorgfältig entnommen, um ihre Struktur zu erhalten und nach dem Durchgang durch eine 21-G-Nadel intakt zu bleiben, wie vor der Injektion bestätigt (Abbildung 4C, D). Nach der intraperitonealen Injektion zeigen Goldene Syrische Hamster typischerweise klinische Anzeichen von Leptospirose innerhalb von 3 bis 5 Tagen (z. B. Lethargie, zerzaustes Fell, Prostration). Negative Kontrollen, die allein mit EMJH-Medium injiziert wurden, zeigen keine Anzeichen einer Erkrankung. Der Verlauf und die Schwere der klinischen Symptome sowie die Zeit bis zur Euthanasie variieren je nach Inokulum: Planktonische Bakterien verursachen oft frühere und akutere Symptome, während biofilmbasierte Aggregate eine verzögerte, aber anhaltende Infektion verursachen können (Abbildung 4B). Die zweimalige tägliche Überwachung von bis zu 21 Tagen ermöglicht es, den vollständigen Krankheitsverlauf festzustellen.
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2. Kristallviolette Färbung, Quantifizierung und ultrastrukturelle Bildgebung von Leptospira-Biofilmen . (A) Kristallviolett (CV) Färbung von Biofilmen, die auf verschiedenen Substraten wachsen. CV-Färbung ermöglicht die Visualisierung der Biofilmarchitektur und der anfänglichen Ansatzmuster für verschiedene Arten und Substrate. i. L. Interrogans am Polycarbonatfilter; ii. L. biflexa am Polycarbonatfilter; iii. L. Verhöre auf Glasdeckel; iv. L. biflexa auf dem Glasdeckzettel. (B) Beispiel für quantitative Biofilmbildung, bewertet durch CV-Absorption (OD570 nm) über die Zeit für L. interrogans und L. biflexa. Diese kinetische Anzeige erfasst sowohl die frühe Adhäsion als auch die Dynamik der Biomassakkumulation und hebt Unterschiede im Biofilmwachstum zwischen pathogenen und saprophytischen Arten hervor. Diese Zahl wurde von27 geändert. (C-E) Rasterelektronenmikroskopie (SEM) von L. interrogans-Biofilmen : (c) 3 Tage alter Biofilm, der frühe Mikrokolonienbildung und anfängliche extrazelluläre Matrixablagerung zeigt; (d) 14 Tage alter Biofilm, der eine ausgereifte Architektur mit umfangreicher Matrix und dreidimensionaler Organisation zeigt; (e-f) 3 Wochen alter Biofilm, der strukturelle Konsolidierung und Matrixreifung über längere Kultur zeigt. Diese Kombination aus CV-Färbung, quantitativen OD-Messungen und SEM-Bildgebung bietet einen umfassenden Überblick über die Entwicklung von Biofilmen – von der frühen Anhaftung bis zur reifen ultrastrukturellen Organisation – und ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen Arten und Kulturdauern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3. Visualisierung der Leptospira-Biofilmbildung . Phasenkontrastbilder, die mit einer BioStation aufgenommen wurden, zeigen die Entwicklung von Biofilmen bei (A) 48 Stunden, (B) 96 Stunden und (C) 144 Stunden. (D) CLSM-Rekonstruktion eines Leptospira-Biofilms , der das Gesamtvolumen mit orthogonalen Schnitten für 3D-Visualisierung darstellt. (E) Konfokale Färbung eines reifen Biofilms mit DAPI (grün) und WGA (rot), wobei bakterielle Gewebe und extrazelluläre Matrixkomponenten hervorgehoben werden. Diese Zahl wurde von37 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4. Zeitaufgelöste Quantifizierung planktonischer und Biofilmfraktionen sowie funktionelle Bewertung von Leptospira-Biofilmen . (A) Kinetik der Biofilmbildung, gemessen durch Absorption bei 405 nm. Für jeden Zeitpunkt wurden Messungen aus dem Gesamtbrunnen, dem Biofilmanteil und dem Überstandsstoff mit planktonischen Leptostürmen entnommen, was eine Unterscheidung zwischen angehefteten und frei schwimmenden Bakterien ermöglichte. (B) Beispiel-Überlebenskurven von Hamstern, die mit Biofilmaggregaten, planktonischen Leptostürmen oder EMJH-Kontrolle injiziert wurden. Biofilm-injizierte Tiere zeigen eine verminderte Virulenz, einige überleben 21 Tage, während planktonische Leptostürme eine schnelle Sterblichkeit verursachen. (C-D) Vorläufige Validierung der Biofilm-Integrität: Aggregate sind vor der Injektion (C) in der Spritze sichtbar und bleiben nach Durchgang durch eine 21-G-Nadel (D, weiße Pfeile) intakt, was bestätigt, dass die Biofilmstruktur während der Handhabung erhalten bleibt. Diese Zahl wurde von36 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

Ein modularer Arbeitsablauf für quantitative, strukturelle und funktionale Analyse von Leptospira-Biofilmen

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