Ein modularer Arbeitsablauf für quantitative, strukturelle und funktionale Analyse von Leptospira-Biofilmen

Wir untersuchen Biofilme als Schutzstrukturen, die Umwelt- und Wirtsbeständigkeit ermöglichen, und untersuchen die Formationsdynamik, molekulare Zusammensetzung, adaptative Merkmale und den Beitrag zur Infektion. Die Kombination von Kristallbioassay, Zeittextbildgebung, Konfokalmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie und Transkriptomik in unseren Laboren fördert die Biofilmforschung durch integrierte multidimensionale Analyse. Zu Beginn wachsen Sie Leptospira-Zellen in EMJH-Medium in flachen Schraubverschlussglasröhren.

Inkubieren Sie die Kulturen unter aeroben Bedingungen bei 30 Grad Celsius ohne Schütteln, bis sie die mittlere logarithmische Phase erreichen. Stellen Sie sicher, dass die Kulturen eine optische Dichte zwischen 0,2 und 0,4 bei 405 Nanometern erreichen, was zwei bis fünf mal zehn der Leistung von acht Zellen pro Milliliter entspricht. Mit einem Dunkelfeldmikroskop bei 20-facher Vergrößerung wird überprüft, dass die Zellen modal und nicht verklumpt sind.

Verdünnen Sie die verifizierte mittellogaritimische arrhythmische Phasenkultur im Verhältnis von eins zu 100 in frischem EMJH-Medium, um etwa ein mal zehn Mengen in der Potenz von sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten, und mischen Sie sanft durch Inversion ohne Vortex. Verwenden Sie nun eine sterile Pinzette, um eine 0,1 Mikrometer große, sterile hydrophile Polycarbonatmembran flach am Boden jedes Bohrlochs in einer sterilen 24-Bohrloch-Platte mit Deckel zu platzieren. Gib jedem Brunnen einen Milliliter steriles EMJH-Medium hinzu und weiche die Membran zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius vor.

Anschließend entferne die Einweichlösung aus jedem Brunnen, ohne die Membran zu verdrängen, und gib 1,5 Milliliter verdünnte bakterielle Suspension hinzu, damit die Membran unten fest an Ort und Stelle bleibt. Dann stellst du ein mit Wasser gefülltes Tablett in den Inkubator, um die Luftfeuchtigkeit zu halten. Inkubieren Sie die Platte bei 30 Grad Celsius unter statischen Bedingungen, um die Bildung von Biofilmen zu ermöglichen.

Lassen Sie die Platte bis zu drei Wochen für langsam wachsende Stämme stehen. Zum gewünschten Zeitpunkt sollte man so viel Kulturmedium wie möglich sorgfältig aspirieren, ohne den Biofilm zu stören. Spülen Sie jede sorgfältig mit einem Milliliter sterilem PBS aus, während die Membran flach am unteren Ende bleibt.

Geben Sie jedem Brunnen einen Milliliter 4%-Paraformaldehyd in PBS zu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Biofilmproben zu fixieren. Nach der Inkubation entfernen Sie das Fixativ und spülen Sie vorsichtig zweimal vorsichtig mit einem Milliliter PBS. Geben Sie jedem Brunnen einen Milliliter 0,1 % Gewichts-auf-Volumen-Kristallviolettlösung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur, wobei Sie darauf achten, dass die Abdeckung vollständig untergetaucht ist.

Dann entsorge ich den kristallvioletten Farbstoff aus jedem Brunnen und spüle zweimal mit einem Milliliter PBS. Kippen Sie die Platte und lassen Sie die gesamte verbleibende Flüssigkeit ablaufen. Lassen Sie den Teller bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen, bis das Substrat vollständig trocken ist, vorzugsweise über Nacht.

Als Nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Elucian-Puffer, bestehend aus 50 % Ethanol und 50 % Gletscheressigsäure nach Volumen, zu jedem Brunnen hinzu. Pipette auf und ab, um den Fleck vollständig aufzulösen, der am Biofilm gebunden ist. Nun werden 200 Mikroliter jeder Probe auf eine optisch klare 96-Bohrloch-Mikroplatte übertragen.

Messen Sie die Absorption bei 570 Nanometern und ziehen Sie Hintergrundwerte von uninokulierten Kontrollen ab, die in allen Schritten verarbeitet werden. Erfassen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung für mindestens drei technische Replikate. Beziehen Sie die Biofilme in Bohrlochplatten, wie zuvor gezeigt.

Fügen Sie eine Lösung aus 4 % Paraformaldehyd und 1 % Glutaraldehyd in einen 0,2 molaren Natriumpuffer bei pH 7,4 in die Brunnen ein. Inkubieren Sie die fixierten Proben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie das Fixativ und spülen Sie die Probe zweimal mit PBS ab, um den an der Oberfläche angesetzten Biofilm zu erhalten und gleichzeitig die Ablösung zu minimieren.

Tauchen Sie nun den Deckmantel in 1%igen Osmiumtetroxid, das in PBS verdünnt ist, und inkubieren Sie eine Stunde lang, um den Kontrast der Rasterelektronenmikroskopie zu verbessern. Dann spüle das Substrat zweimal mit PBS ab. Trocknen Sie die Proben, indem Sie sie jeweils 10 Minuten nacheinander in einer gradierten Ethanolserie eintauchen.

Als Nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Hexamethyldisilazan hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Dann ersetzen Sie es durch frisches Hexamethyldisilazan und inkubieren Sie weitere fünf Minuten. Anschließend entferne die überschüssige Lösung und lass die Probe vollständig an der Luft unter einer Abzugshaube trocknen.

Nun werden die getrockneten Proben mit doppelseitigem leitfähigem Kohleband auf Rasterelektronenmikroskopie-Stubben montiert. Sputterschichten Sie die Proben mit einer dünnen Schicht, etwa 10 Nanometern Gold oder Platin, um den Elektronenkontrast für die Bildgebung zu verbessern. Schließlich werden die vorbereiteten Stubs mit dem entsprechenden Probenhalter in das Rasterelektronenmikroskop geladen.

Evakuieren Sie die Kammer, wenn möglich, über Nacht, um die Bildqualität zu verbessern. Anschließend werden Sekundärelektronenbilder bei fünf bis 15 Kilovolt mit geeigneten Vergrößerungen aufgenommen, um die Ultrastruktur des Biofilms zu visualisieren. Nach 21 Tagen Inkubation zeigte die Kristallviolettfärbung sichtbare Biofilmmuster sowohl auf Polycarbonatfiltern als auch auf Glasabdeckungen für Leptospira Interrogans und Leptospira biflexa.

Jede Art zeigt unterschiedliche architektonische Fußspuren wie punktartige, verzweigte oder netzartige Formen. Absorptionsmessungen bei 570 Nanometern bestätigten über alle Zeitpunkte hinweg eine stärkere Kristallviolettretention in Leptospira byflexa-Biofilmen im Vergleich zu Leptospira-Interrogans, was auf eine höhere Biomassakkumulation im Stamm hinweist. Die Rasterelektronenmikroskopie von Leptospira-Interrogans-Biofilmen erfasste frühe extrazelluläre Matrixablagerungen in drei Tage alten Biofilmen, eine ausgewachsene und kanalisierte Basalfläche mit dreidimensionaler Struktur nach 14 Tagen und eine vollständig entwickelte Matrixkonsolidierung mit dichter Architektur nach 21 Tagen.

Unser optimiertes Protokoll synchronisiert komplementäre Auslesungen aus identischen Kulturen, erhöht die Robustheit, reduziert die Variabilität und liefert dynamische und strukturelle Informationen, die mit Einmethoden-Ansätzen verfügbar sind. Durch die Integration komplementärer Analysen standardisierten unsere Ergebnisse die Biofilmbewertung und klären die Dynamik und Architektur der Leptospira. Sie verknüpfen Struktur mit Virulenz und stärken reproduzierbare vergleichende Forschung.

Zukünftige Mutanten, um Regulierung mit Biofilmmorphologie und -dynamik zu verknüpfen, die Umweltpersistenz zu klären und Strategien zu bewerten, die Biofilminformationen stören oder die Verbreitung fördern.