Name: Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mit porösen Membraninserts und RT-ddPCR für die Neurowissenschaft. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Detektion niedrig-abundanter Transkripte in neuronalen Kompartimenten.

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<table><tbody><tr><td>Zellkultur-Einsätze für 6-Well-Platten, 1,0 & nbsp; &mu; m Porengröße, steril</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>Verbrauchsgüter</td></tr><tr><td>Zellkultur-Einsätze für 6-Well-Platten, 3,0 & nbsp; &mu; m Porengröße, steril</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>Verbrauchsgüter</td></tr><tr><td>Zellheber mit schmaler Klinge</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>Verbrauchsgüter</td></tr><tr><td>CELLSTAR 6-Bohrloch Gewebekulturplatten</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>Verbrauchsgüter</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well-Platten&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td>Verbrauchsgüter</td></tr><tr><td>ddPCR Tropfenlese-Öl&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>DG8-Patronen für QX200/QX100 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td>Verbrauchsgüter</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco/Fisher Wissenschaftlich</td><td>23017-015</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>Mikroplatten für fluoreszenzbasierte, 96-Well, schwarze</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>Verbrauchsgüter</td></tr><tr><td>PCR-Platten mit Heißwasserdichtung, Folie, durchstichbar</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td>Verbrauchsgüter</td></tr><tr><td>Poly-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Thermischer Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>12015382</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>QuantaSoft-Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>PCR-Datenanalyse-Software</td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen-Reagenz und RNA-Assay-Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchengenerierungsöl für EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td>Reagenzien</td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>17005227</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>QX200 Tropfenleser</td><td>Bio-Rad</td><td>17005228</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>TRIzol-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>Reagenzien</td></tr></tbody></table>

isolierung und quantifizierung axonaler mrnas mittels poröser membraninserts und rtddpcr

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

Primäre embryonale Nagetier-kortikale Neuronen, hippocampale Neuronen und BFCNs, die auf PLL-beschichteten 1-μm-Einsätzen verlagert sind, haften robust und dehnen Neurite in vitro (DIV) um 5–7 Tage über die Membran aus. Bis 11 DIV zeigen Kulturen dichte Netzwerke. Bei erwachsenen Ratten-DRGs hilft das Hinzufügen einer Lamininschicht auf PLL-beschichtete 3-μm-Einsätze, um eine vergleichbare axonale Erweiterung durch 5 DIV zu erreichen. Diese Beobachtungen bestätigen die Fähigkeit von Einsätzen, das langfristige neuronale Wachstum zu unterstützen und ausreichend axonalt Material für die nachgelagerte RNA-Extraktion bereitzustellen. Falls es skalieren muss, kombinieren wir mehrere Einsätze, um genügend Material zu erhalten.
Die TRIzol-Extraktion aus einzelnen Einsätzen liefert ausreichend RNA für die Reverse-Transkription und die anschließende ddPCR. Die RiboGreen-Quantifikation bestätigt konsistente RNA-Erträge aus ganzen Neuronenfraktionen (212,85 ng/Einsatz) und niedrigere Ausbeute aus Neuritfraktionen (42,75 ng/Einsatz) (Abbildung 2). Wir erhalten in der Regel ~5–7-fache RNA aus der gesamten Neuronenfraktion im Vergleich zur neurit-angereicherten Fraktion.
Alle Primer werden vor RTddPCR-Experimenten validiert. Für jedes Zieltranskript werden mindestens zwei Primer-Sets angeordnet und mit konventioneller PCR auf cDNA getestet, die aus denselben neuronalen Proben erzeugt wurde. Das Primerpaar, das das stärkste und spezifischste Band erzeugt, wird für RTddPCR ausgewählt (Abbildung 3A). Zum Beispiel haben wir für Gap43 das Primer-Set 1 gewählt. Bei mehrdeutigen Ergebnissen, wie sie bei Actγ erhalten werden, führen wir eine Gradienten-PCR zur Optimierung der Annealing-Temperaturen durch (Abbildung 3B). Dies stellt sicher, dass nur gut validierte Primer für die absolute Quantifizierung verwendet werden, was die Wahrscheinlichkeit von Artefakten bei der Tröpfchentrennung verringert.
Das Abkratz- und Abstrichverfahren trennt somatische und neuritische Kompartimente zuverlässig. RNA, die aus den gesamten Neuronenfraktionen isoliert wurde, zeigt eine Anreicherung von Transkripten, wie Actγ 46,47,48,49 (Abbildung 4). Im Gegensatz dazu liefern Axon-/Neuritfraktionen deutlich geringere Gesamt-RNA, was mit ihrem begrenzten Volumen übereinstimmt, zeigen jedoch eine Anreicherung von Transkripten, die bekannt sind, dass sie auf distale Fortsätze lokalisieren, wie Gap43 (Abbildung 4). Minimale Kreuzerkennung von soma-eingeschränkten Transkripten zeigt eine hohe kompartimentale Reinheit, wenn Einsätze sorgfältig behandelt und mit optimaler Dichte plattiert werden.
Positive Ergebnisse zeichnen sich durch folgende Eigenschaften aus: (1) intakte neuronale Morphologie mit klarer axonaler Erweiterung, (2) saubere Trennung der Kompartipartimente ohne Membranruptur, (3) validierte Primer, die eine deutliche Trennung zwischen positiven und negativen Tröpfchen erzeugen, und (4) starke RTddPCR-Signale für axonale Transkripte. Suboptimale Experimente führen zu geringer RNA-Ausbeute, Kreuzkontaminationen, die durch Somamarker in Neuritfraktionen belegt werden, oder zu RTddPCR-Artefakten wie erhöhtem Tröpfchen-"Regen" durch Primer-Dimerisation. Diese Probleme stehen meist im Zusammenhang mit Schäden an der Insertmembran, übermäßigem Abkratzdruck oder unzureichender Temperaturoptimierung der Primer-Annealing.
<img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Abbildung 1: Überblick über kompartmentspezifische RNA-Isolierung mittels Membraneinsätze. Nagerneuronen wurden an halbdurchlässigen Einsätzen mit einer Porengröße von 1–3 μm kultiviert, was Neuritenverlängerung ermöglicht und gleichzeitig das Soma einschränkt. Für die Vorbereitung des gesamten Neurons wurden Zellen aus dem oberen Kompartiment mit einem sterilen Zellschaber abgekratzt, pelletiert und dann in TRIzol für RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und RTddPCR lysiert. Restzellreste wurden mit einem sterilen Wattestäbchen aus der Insert-Membran entfernt. Zur Neuritpräparation wurde die Einsatzmembran, die nun nur Neurite enthält, invertiert und mit einer Skalpellklinge durchtrennt und direkt in TRIzol eingetaucht, gefolgt von RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und RTddPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Abbildung 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Abbildung 2: Standard-RNA-Konzentrationskurve mit RiboGreen-Assay. (A) Die Fluoreszenzintensität wurde mit dem RiboGreen-RNA-Quantifizierungstest über eine Verdünnungsreihe von RNA-Standards gemessen. Eine lineare Regressionsanalyse zeigte eine starke Korrelation zwischen RNA-Konzentration und Fluoreszenzsignal (R² = 0,9956). Der R²-Wert nahe eins zeigt eine ausgezeichnete Linearität und Zuverlässigkeit des RiboGreen-Tests für eine genaue RNA-Quantifizierung. (B) Mit der Gleichung (y=19,738x + 14,905) für die in A erhaltene Steigung wurde für jeden Anteil die Gesamt-RNA berechnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Abbildung 3: Primervalidierung mittels PCR und Agarosegel-Elektrophorese. (A) PCR-Amplifikationsprodukte mit cDNA für Actγ und Gap43 wurden auf einem 2%igen Agarosegel aufgelöst, um die Primer-Spezifität zu bewerten. Für jedes Gen wurden zwei unabhängige Primer-Sets (Satz 1 und Satz 2) getestet. DNA-Größenmarker (Leitern) werden in benachbarten Spuren mit angegebenen Molekulargewichten (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb) angezeigt. Unterschiedliche Einzelbänder der erwarteten Größe bestätigen eine erfolgreiche Verstärkung und Spezifität der ausgewählten Primer-Sets. (B) Die PCR-Amplifikation wurde mit dem Actγ-Primer Set 2 über einen Temperaturgradienten (55–65 °C) durchgeführt, um die optimale Glühtemperatur zu bestimmen. Amplifizierte Produkte wurden auf einem 2%igen Agarosegel neben einer DNA-Leiter (Lane 2, angegebene Größen) aufgelöst. Über den getesteten Bereich wurden konsistente Einzelbänder der erwarteten Größe beobachtet, wobei die stärkste Verstärkung bei 55 °C detektiert wurde, was darauf hindeutet, dass dies die optimale Temperatur für dieses Primer-Set ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Abbildung 4: RTddPCR-Analyse ausgewählter Transkripte und Quantifizierung von mRNA-Kopien. (A,B) Repräsentative eindimensionale Amplitudendiagramme, die Tröpfchentrennung für (A) Actγ und (B) Gap43 zeigen. Jeder Punkt stellt einen einzelnen Tropfen dar, wobei blaue Tröpfchen positive Verstärkung und graue Tropfen negative Verstärkung anzeigen. Die Y-Achse stellt die Amplitude dar, und die X-Achse zeigt die Position des Brunnens in der ddPCR-Platte an. Eine klare Trennung zwischen positiven (blauen) und negativen (grauen) Tröpfchen bestätigt den robusten Nachweis der Zieltranskripte mit den angegebenen Primer-Sätzen. (C) Tabelle, die die Anzahl der Kopien/μL und Kopien pro ng der Gesamt-RNA für Actγ- und Gap43-Transkripte in Ganzneuron- und Neuritfraktionen zusammenfasst. Schätzungen der Kopienzahl wurden durch absolute Quantifizierung mit ddPCR-Tröpfchenzählungen gewonnen (dargestellt in den Panels A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>

Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

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Lernen Sie die Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mit porösen Membraninserts und RT-ddPCR für die Neurowissenschaft. Diese Methode ermöglicht die hochsensitive Detektion niedrig-abundanter Transkripte in neuronalen Kompartimenten.

Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

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