Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

Unsere Forschung untersucht, wie die lokale Proteinsynthese reguliert wird und welche Rolle sie bei neuronaler Reparatur, Entwicklung und Degeneration spielt. Jüngste Fortschritte umfassen hochsensitive mRNA-Detektionstechniken wie gdPCR zur Identifizierung von axonalen MRNAs mit geringer Häufigkeit und zur Kompartimentierung neuronaler Kulturen. Um zu beginnen, aliquot 250 Mikroliter Triazol in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr zu geben, das jedem Einsatz in einen Brunnen oder dem Einsatz einer Sechs-Bohrloch-Platte entspricht.

Bewahre die Schläuche beiseite, bis sie gebraucht werden. Fügen Sie zwei Milliliter steriles PBS in jede Mulde einer zweiten sechsfachen Platte hinzu, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Bohrlöcher oder Platten mit der Anzahl der Einsätze übereinstimmt. Pipettieren Sie das Kulturmedium sowohl vom oberen Ende des unteren Teils als Pipette und übertragen Sie den Einsatz in die sechsfache Platte mit PBS.

Setzen Sie nun mit einer Pinzette den Einsatz vorsichtig ein und geben dann zwei Milliliter PBS darüber. Sauge das PBS von beiden Seiten ab und wiederhole das Wiederholen, um zweimal zu waschen. Dann lässt du den Einsatz in frischem PBS.

Als Nächstes verwenden Sie einen sterilen Zellschaber zum Abkratzen des gesamten Neuronanteils von der Oberseite des Einsatzes. Sammle das Soma-Lysat aus dem Einsatz. Übertragen Sie es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.

Zentrifugiere das Rohr bei 10.000 bis 15.000 G für zwei Minuten. Verwerfen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 250 Mikrolitern Trizol. Kennzeichnen Sie dieses Rohr als gesamte Neuronenfraktion.

Um die Neuritfraktion zu erfassen, bewegen Sie ein Ende eines sterilen Wattestäbchens langsam in einem Zickzackmuster von oben nach unten auf der gesamten Neuronenseite des Einsatzes. Drehen Sie den Einsatz um 90 Grad und wiederholen Sie das mit dem anderen Ende des Abstrichs. Dann entsorge den Abstricher.

Verwenden Sie einen neuen Abstrich und bewegen Sie sich in konzentrischen Kreisen, beginnend mit der Mitte des Einsatzes nach außen, wobei Sie auch den Umfang reinigen. Drehen Sie das Insert so um, dass die Neuritseite nach oben zeigt. Schneiden Sie die Membran mit einer neuen sterilen Skalpellklinge durch.

Setzen Sie die durchschnittene Membran in die Sechs-Wellen-Platte mit Trizol ein, wobei die Neuritseite nach unten zeigt. Stellen Sie sicher, dass die Membran untergetaucht ist. Sammeln Sie nun das Trizol mit dem Neuritlysat aus dem Brunnen.

Übertragen Sie es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung fort oder lagern Sie die Soma- und Neuritlysate bei minus 80 Grad Celsius für spätere Verarbeitung. Bereite Reverse-Transkriptionstropfen-Digital-PCR-Reaktionen mit Droplet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mix vor und ziele spezifische Primer mit geeigneter ergänzender DNA an.

Pipettieren Sie das Reaktionsgemisch in die Tröpfchenerzeugungspatrone. Dann wird das Erzeugungsöl in die vorgesehenen Brunnen der Patrone gegeben. Jetzt dichte die Kartusche mit der Dichtung ab.

Erzeugen Sie die Tröpfchen mit dem Tröpfchengenerator. Sobald die Tröpfchen erzeugt wurden, werden sie in eine 96-Well-PCR-Platte übertragen und mit Folie versiegelt, bevor Sie die Platte in den Thermocycler legen. Öffnen Sie die QX Manager Software, um die Analyse zu beginnen.

Klicken Sie auf die Option Durchsuchen und öffnen Sie die Datei zur Analyse. Wenn die Datei geladen wurde, erscheint die Dashboard-Ansicht im linken Panel. Wählen Sie die interessanten Quellen aus, indem Sie die Control-Taste gedrückt halten, während Sie klicken.

Klicken Sie auf 1D Amplitude, um ein Punktdiagramm zu visualisieren. Wähle Schwellenwerte Mehrere Brunnen, um denselben Schwellenwert auf mehr als einen Brunnen anzuwenden. Geben Sie den Schwellenwert ein, basierend darauf, wo eine klare Trennung zwischen positiven und negativen Tröpfchen zu erkennen ist.

Sehen Sie sich nun den Datenabschnitt gut an, der die Probenbeschreibung, Konzentrationswerte, Anzahl der akzeptierten Tröpfchen sowie positive und negative Tröpfchenzählungen zeigt. Klicken Sie auf Speichern, um die Schwellenwerte festzuhalten. Die RNA-Quantifizierung mit dem Ribo-Green-Test zeigte, dass ganze Neuronenfraktionen 212,85 Nanogramm RNA pro Einsatz lieferten, während Neuritfraktionen 42,75 Nanogramm lieferten.

Die PCR-Validierung identifizierte den Primer-Satz eins als den spezifischsten für das Gap43-Transkript und zeigte ein deutliches Einzelband. Mehrdeutige PCR-Ergebnisse für Gamma-Actin führten zu einem Temperaturgradiententest mit Primersatz zwei, der die stärkste Amplifikation bei 55 Grad Celsius zeigte. RT-ddPCR-Amplitudendiagramme zeigten eine klare Tröpfchentrennung für Gamma-Actin sowohl in Vollneuron- als auch in Neuritproben und bestätigten eine zuverlässige Transkripterkennung.

Bei Gap43 befinden sich fast 23 % des mRNA-Pools in den Neuriten, verglichen mit Gamma-Aktin, wo nur 5 % des mRNA-Pools in den Neuriten im Vergleich zum gesamten Neuronenanteil vorhanden sind. Wir haben das Vorhandensein von Stressgranulatstrukturen in den Axonen unter physiologischen Bedingungen nachgewiesen, die die lokale Proteinsynthese hemmen. Unser Protokoll bietet eine zuverlässige und konsistente Methode zur Isolierung neuronaler Kompartimente und zur Erkennung von mRNAs aus niedriger Umwelt.

Zukünftige Analysen werden sich auf die Isolierung und Charakterisierung unterschiedlicher axonaler Unterbereiche wie Wachstumskegel und axonale Schäften hinaus konzentrieren.