Eine vereinfachte Methode zur agrobakterie-vermittelten Transformation von Phytophthora palmivora

Dieses Protokoll bietet ein einfaches, effektives und reproduzierbares System zur Transformation von Phytophthora palmivora und phytophthora capsici. Zu Beginn nehmen Sie eine neue LB-Schneckenplatte mit Antibiotika ergänzt. Fügen Sie 20 Mikroliter LB-Flüssigmedium in die Mitte der Platte hinzu und nehmen Sie Agrobakterienzellen mit einem sterilen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen von einer zuvor gewachsenen Platte ab.

Verwenden Sie den unteren und flachen Boden des Röhrchens und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig über die Platte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 28 Grad Celsius für etwa 16 bis 18 Stunden. Als Nächstes werden die über Nacht gewachsenen Agrobacterium-Zellen mit einer Milliliter-Pipettenspitze entleert.

Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Agrobacterium-Induktionsmedium durch Pipettieren auf und ab. Nun werden die resuspendierten Zellen in ein steriles 50-Milliliter-Rohr mit Folie übertragen und Agrobacterium-Induktionsmedium hinzugefügt. Messen Sie die optische Dichte der Probe bei 600 Nanometern und verdünnen Sie sie mit einem Agrobacterium-Induktionsmedium, um eine optische Dichte von 0,4 zu erreichen.

Dann lockere den Deckel des mit Folie bedeckten Rohrs mit der bakteriellen Suspension. Legen Sie es mit sanfter Bewegung bei etwa 70 Umdrehungen pro Minute auf einen Plattformschüttel. Fluten Sie eine sieben bis acht Tage alte Phytophthora palmivora-Platte mit 10 Millilitern Wasser, das auf vier Grad Celsius vorgekühlt ist.

Benutze eine Pipettenspitze, um sanft auf die Oberfläche zu klopfen und alle Luftblasen vom Medium zu entfernen. Inkubieren Sie den Teller bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Dann für weitere 15 Minuten auf Zimmertemperatur unter Licht umleiten.

Mit einer Pipette werden etwa sieben bis acht Milliliter freigesetzter Zoosporen vorsichtig in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen, ohne Myzel und Sporangien zu stören. Dann werden 20 Mikroliter der Zoosporensuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen und 180 Mikroliter Wasser hinzugefügt, um die Suspension um das Zehnfache zu verdünnen. Wirbeln Sie das Rohr für eine Minute vortex, um auf die Zoosporen zu bestehen, und verwenden Sie ein Hämozytometer unter dem Mikroskop, um die Zoosporen zu zählen.

Fügen Sie fünf Milliliter der vorbereiteten Agrobacterium-Suspension zu fünf Millilitern der Zoosporensuspension in einem sterilen 50-Milliliter-Folienrohr hinzu. Den Inhalt vorsichtig vermischen, den Deckel des Tubens lockern und ihn zwei Stunden bei Zimmertemperatur stehen lassen. Während der Inkubation bereiten Sie die AZCA-Platten vor.

Sobald das Medium erstarrt ist, lege ein Stück sterilisierte Hybond-N+-Membran auf die Platte und halte die Platte im Dunkeln. Nach zwei Stunden Co-Inkubation verwenden Sie eine Pipettenspitze, um 300 Mikroliter der Mischung auf die Hybond-N+-Membran zu verteilen, wobei die Ränder frei von der Flüssigkeit sind. Lassen Sie die Petrischalen etwa 10 Minuten unbedeckt in der Haube, damit die Mischung an der Luft trocknen kann.

Sobald die Flüssigkeit aufhört, sich auf der Membran zu bewegen, decken Sie die Platten ab. Inkubieren Sie die abgedeckten Platten zwei Tage lang bei 25 Grad Celsius im Dunkeln. Nach 48 Stunden Inkubation verwenden Sie sterilisierte Pinzette, um die Hybond-N+-Membran kopfüber auf die Plich-Schneckenplatte zu übertragen, ohne sie über die Schneckenoberfläche zu ziehen.

Verwenden Sie die flache Basis eines 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohrs, um sanft über die Membranoberfläche zu drücken und zu schieben, um einen vollständigen Kontakt mit dem Medium sicherzustellen. Überprüfen Sie die Unterseite der Platte auf Luftblasen und drücken Sie sie vorsichtig mit derselben flachen Basis aus. Inkubieren Sie die Platte bei 25 Grad Celsius unter einem 12-Stunden-Licht- und 12-Stunden-Dunkelzyklus für zwei bis drei Tage.

Nach zwei bis drei Tagen Inkubation wird die Membran schließlich mit einer sterilen Pinzette entfernt und die Platte unter denselben Licht- und Temperaturbedingungen weiter inkubiert. Die Ko-Inkubation von Phytophthora palmivora-Zoosporen mit Agrobacterium tumefaciens EHA 105, die pCB301TOR-GFP exprimieren, ergab G418-resistente Kolonien auf Plich-Schnecken, ergänzt mit 30 Mikrogramm pro Milliliter G418, während keine Kolonien auf Kontrollplatten ohne Agrobakterieninfektion auftraten. Die Anzahl der G418-resistenten Transformanten pro 10 Zoosporen in der Potenz sieben betrug 55 im ersten Versuch und 50 im zweiten Versuch.

Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte ein klares grünes fluoreszierendes Proteinsignal in Phytophthora palmivora-Transformanten. Zusätzlich wurde dieses Protokoll auf Phytophthora capsici angewandt, um erfolgreich Transformanten zu erzeugen, die GFP exprimieren. Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, Genfunktionen zu untersuchen, die Zelllokalisierung von Proteinen zu bestimmen und die Dynamik von Pathogeninfektionen zu verfolgen.

Diese Protokolle können einen geringen Prozentsatz an Fehlalarmen erzeugen und erfordern daher zusätzliche Ansätze, um die wahren Transformanten zu bestätigen. Die Anwendung dieses Transformationssystems kann auf andere Oomyceten und Pilze ausgeweitet werden. Wir werden auch versuchen, dieses Protokoll in Zukunft weiter zu vereinfachen.