Summary
Dwars aorta vernauwing (TAC) in de muis is een veel gebruikte experimenteel model om de mechanismen die ten grondslag liggen cardiale hypertrofie en hartfalen ontwikkeling te bestuderen. Hier beschrijven we de procedures aan vernauwen de aorta naar een reproduceerbare mate van cardiale hypertrofie in muizen te creëren.
Abstract
Dwars aorta vernauwing (TAC) in de muis is een veelgebruikte experimenteel model voor druk overbelasting-geïnduceerde cardiale hypertrofie en hartfalen.
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van Operating Field
- De operationele veld wordt gedesinfecteerd met 75% isopropyl alcohol.
- Zorg ervoor dat het verwarmingselement is ingeschakeld en op de juiste temperatuur. Een aanbevolen systeem is een Gaymar circulerende waterpomp aangesloten op een therapie pad dat wordt gehandhaafd op 37 ° C ± 1 ° C. Het is belangrijk om een normale lichaamstemperatuur te handhaven tijdens de operatie om te voorkomen dat een snelle daling van de hartfrequentie.
- Chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd in een hete kraal sterilisator voor de operatie. Voor deze procedure hebt u de volgende chirurgische instrumenten: botte schaar, natuurlijk gebogen tang X 2, fijne 45 ° gebogen tang X 2, schuin lente schaar, borst oprolmechanisme en naaldhouder.
- Katoen applicators dient te liggen op de hand in geval van bloeden.
Deel 2: Voorbereiding en intubatie van Muizen
- Muizen worden verdoofd in een inductie kamer met 2% isofluraan gemengd met 0,5 -1,0 l / min 100% O 2.
- Tondeuses worden gebruikt om de vacht te scheren van de hals tot midden borsthoogte.
- De muis is geplaatst in een liggende positie boven een verwarmingselement om de lichaamstemperatuur te handhaven.
- Een rubberen band is geplaatst over de voorzijde van de dier de tanden om de nek uit te breiden. Met behulp van gebogen tang in de ene hand, is de tong voorzichtig gemanipuleerd om de zijkant. Met de andere hand, is endotracheale intubatie uitgevoerd met behulp van PE 90 buizen. De endotracheale tube wordt vervolgens aangesloten op een Harvard-volume gefietst knaagdieren ventilator fietsen op 125-150 ademhalingen / minuut en een ademvolume van 0.1-0,3 ml. Tijdens de chirurgische ingreep, wordt verdoving gehandhaafd op 1,5-2% isofluraan met 0,5 tot 1,0 L / min 100% O 2. Juiste niveau van de anesthesie wordt geverifieerd door druk uit te oefenen op de muis nagelbed (teen-snuifje reflex).
- Het chirurgische veld wordt gedesinfecteerd met betadine-oplossing, gevolgd door 70% alcohol. Deze procedure wordt drie keer herhaald.
- Om te voorkomen dat besmetting van het chirurgische veld tijdens de operatie, wordt een steriel laken geplaatst over de muis waardoor alleen de werking veld blootgesteld.
- Een set van steriele handschoenen wordt gebruikt voor elke individuele muis.
Deel 3: Ligatie van de Transverse Aorta
- Gedeeltelijke thoracotomie naar de tweede rib wordt uitgevoerd onder een chirurgische microscoop en het borstbeen ingetrokken met behulp van een kist oprolmechanisme.
- Fijne punt 45 ° gebogen pincet worden gebruikt om de thymus en vetweefsel voorzichtig los van de aortaboog.
- Na identificatie van de dwarse aorta, is een klein stukje van een 6,0 zijden hechtdraad geplaatst tussen de onbenoemde en linker halsslagaders (figuur 1).
- Twee losse knopen zijn gebonden rond de dwars-aorta en een klein stukje van een 27 ½ meter stompe naald wordt parallel geplaatst om de dwarse aorta. De eerste knoop is snel gebonden tegen de naald, gevolgd door de tweede en de naald direct verwijderd worden om een vernauwing van 0,4 mm in diameter opbrengst. In sham controle muizen, de gehele procedure is identiek behalve voor de ligatie van de aorta.
- De borst oprolmechanisme verwijderd en de uitstroom van de ventilator afgeknepen gedurende 2 seconden opnieuw opblazen van de longen.
- De ribbenkast is gesloten met een 6,0 prolene hechtdraad met een onderbroken hechtdraad patroon.
- De huid wordt gesloten met behulp van een 6,0 prolene hechtdraad met een doorlopende hechting patroon.
Deel 4: Post-operatieve herstel
- Voor post-operatieve analgesie, is de muis geïnjecteerd met buprenorfine (0,1 mg / kg) intraperitoneaal. Als er tekenen van uitdroging na de operatie, is een steriele zoutoplossing gegeven intraperitoneaal.
- Anesthesie wordt geleidelijk verlaagd tot de stand uit en de endotracheale tube verwijderd wanneer tekenen van spontane ademhaling optreden.
- De muis wordt verplaatst naar de buikligging en liet om te herstellen van een verwarmingselement.
Deel 5: Bevestiging van de succesvolle Ligatie van de Transverse Aorta
- Een week na TAC, de muis is opnieuw verdoofd om de mate van druk overbelasting veroorzaakt door ligatie van de dwarse aorta te bepalen. Zoals hierboven beschreven, wordt verdoving gehandhaafd op 1,5-2% isofluraan met 0,5 tot 1,0 L / min 100% O 2 en de lichaamstemperatuur gehandhaafd op 37 ° C ± 1 ° C.
- Een 20 MHz Doppler sonde wordt geplaatst op de linker-en rechterkant van de nek op een hoek van 45 ° te stromen snelheden op te sporen. Een computer-based Doppler signaal processor (Indus Instruments, Houston, TX) werd gebruikt om te laten zien en op te slaan Doppler-signalen. 5
- Afhankelijk van de mate van druk overbelasting die nodig is voor de experimentele protocol, worden alleen muizen met een rechter carotis (RC) / linker halsslagader (LC) stroom verhouding binnen een bepaald bereik opgenomen voor verdere analyse. Bijvoorbeeld, een matige mate van druk overbelasting leidt tot een verhouding van 5-8, terwijl een strakkere vernauwing resulteert in een zware druk overbelasting leidt to een ratio van 8-10 (figuur 5.3a). Een sham dier (uitgevoerd maar niet afgebonden), echter, zal naar verwachting een verhouding van ~ 1 (figuur 5.3B) hebben.
6: representatieve resultaten
De typische chirurgische overleving na TAC in wild-type muizen is ongeveer 80-90%. Succesvolle chirurgische ligatie van de aorta dwars zal leiden tot een Doppler stroomsnelheid verhouding tussen de rechter en linker halsslagader (RC / LC) van 5-10 (Figuur 1). In vergelijking met sham bediende muizen (Figuur 2A), zijn muizen met de druk overbelasting zal naar verwachting hypertrofie van het hart te ontwikkelen binnen 1-2 weken, en cardiale dilatatie na 6-8 week, afhankelijk van de dichtheid van de vernauwing (figuur 2B). Sterfte tijdens de eerste maanden na de TAC is meestal laag (<20%) in wild-type muizen, hoewel genetisch gemodificeerde muizen kunnen vertonen verschillende overleving. 6,7
Figuur 1. Bevestiging van Transversale Aorta Ligatie met behulp van Doppler snelheidsmeting. Vertegenwoordiger Dopplersnelheid signalen van het recht (RC) en linker carotis (LC) slagaders zes dagen na de TAC. Deze opnamen tonen een succesvolle ligatie met een RC / LC stroom verhouding van ~ 6.8. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.
Figuur 2. Vertegenwoordiger hele hart Images Na TAC. Een. Sham bediende wild-type muis hart. B. Wild-type muizen hart 16 weken post-TAC. Elke lijn = 1mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TAC, die de menselijke aortastenose nabootst, is een veel gebruikte methode om cardiale hypertrofie en hartfalen veroorzaken bij muizen. Alternatieve locaties voor aorta vernauwing onder meer de stijgende en abdominale aorta. Opgaande aorta vernauwing zorgt voor een extreme en snellere overbelasting van de linker ventrikel (LV). In tegenstelling, abdominale aorta vernauwing laat onverlet een groter deel van de circulatie als een middel om mogelijke schadevergoeding. 8 Daarom, TAC vaak de voorkeur omdat het model voorziet in een adequate LV overbelasting in een tijd-afhankelijke manier meer vatbaar zijn voor onderzoek. Hoewel deze procedure kan technisch uitdagend, met de praktijk, hebben we een overlevingskans van 80-90% in wild-type muizen.
De waterdichtheid van dwars aorta vernauwing bepaalt de mate van hypertrofie ontwikkeling en het tijdsbestek waarin hartfalen en dilatatie ontwikkelt. Bovendien, de leeftijd van de muizen van invloed op de recovery rate en de kinetiek van hartfalen ontwikkeling. Oudere muizen (> 12 maanden oud) langer duren om een adaptieve reactie van de halsslagaders aan TAC te ontwikkelen, en die waarschijnlijk gedilateerde cardiomyopathie sneller ontwikkelen dan jongere muizen (3-4 maanden oud) 5.
Niet-invasieve intubatie van muizen vergt enige oefening. Een alternatieve methode is als volgt:
- Een kleine middellijn baarmoederhalskanker incisie wordt gemaakt met botte schaar en weefsel gescheiden rond de luchtpijp met behulp van gebogen tang om de luchtpijp bloot te leggen.
- Een stuk van hechtdraad is geplaatst rond de voortanden en voorzichtig weggetrokken uit het dier het lichaam om de nek uit te breiden.
- Met behulp van gebogen tang in de ene hand, is de tong voorzichtig gemanipuleerd om de zijkant.
- Met de andere hand, is endotracheale intubatie uitgevoerd met behulp van PE 90 buizen afgeschuinde op de rand voor het gemak van binnenkomst.
De endotracheale tube wordt vervolgens aangesloten op een Harvard-volume gefietst knaagdieren ventilator fietsen op 125-150 ademhalingen / minuut en een ademvolume van 0.1-0,3 ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
XHTW is een WM Keck Foundation Distinguished Scholar Young in Medisch Onderzoek, en wordt ook ondersteund door NIH / NHLBI beurzen R01-R01-HL089598 en R01HL091947, en spierdystrofie Vereniging verlenen # 69238. RJvO is de ontvanger van de 2008-2010 American Physiological Society Postdoctoraal Fellowship in Fysiologische Genomics. Dit werk is ook gedeeltelijk ondersteund door de Stichting Leducq Alliantie voor CaMKII Signalering in het Hart.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
- Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
- Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
- Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
- Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
- Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
