Summary
Поперечное сужение аорты (TAC) в мышь обычно используется экспериментальная модель для изучения механизмов, лежащих гипертрофии сердца и развитием сердечной недостаточности. Здесь мы описываем процедуры сужают аорты для создания воспроизводимых степень гипертрофии сердца у мышей.
Abstract
Поперечное сужение аорты (TAC) в мышь обычно используется экспериментальная модель для давления перегрузки вызванной гипертрофии сердца и сердечной недостаточности.
Protocol
Часть 1: Подготовка рабочего поля
- Операционной поле дезинфицируют 75% изопропилового спирта.
- Убедитесь, что грелку включен и при правильной температуре. Рекомендуется система Гаймар оборотной воды насос, подключенный к терапии площадку, которая поддерживается на уровне 37 ° C ± 1 ° C. Важно, чтобы поддерживать нормальную температуру тела во время операции, чтобы избежать быстрого уменьшения частоты сердечных сокращений.
- Хирургические инструменты стерилизуются в горячий шарик стерилизатор до операции. Для этой процедуры вам понадобятся следующие хирургические инструменты: тупой стороной ножниц, конечно изогнутых щипцов X 2, штраф 45 ° угловой пинцет X 2, угловые ножницы весной, груди втягивающим и иглодержателя.
- Хлопок аппликаторы должны быть под рукой в случае кровотечения.
Часть 2: Подготовка и интубации мышей
- Мыши под наркозом в индукции камера с 2% изофлуран смешать с 0,5 -1,0 л / мин 100% O 2.
- Приборы для стрижки и используются для бритья меха от шеи до середины уровня груди.
- Мышь находится в лежачем положении на вершине грелку для поддержания температуры тела.
- Резинка находится над передней животного с зубами, чтобы продлить шеи. Использование изогнутых щипцов в одной руке, язык мягко манипулировать в сторону. С другой стороны, интубация трахеи выполняется с помощью PE 90 трубок. Эндотрахеальной трубки затем подключается к Гарвардского объемно-циклическое грызунов вентилятор езда на велосипеде на 125-150 вдохов / мин и дыхательный объем 0,1-0.3ml. Во время хирургической процедуры, анестезия поддерживается на уровне 1,5-2% изофлуран с 0,5 - 1,0 л / мин 100% O 2. Правильный уровень анестезии проверяется путем давления на кровати мышью ногтя (носок-пинча рефлекс).
- Хирургическое поле дезинфицируют бетадин решение затем 70% спирта. Эта процедура повторяется три раза.
- Для предотвращения загрязнения операционного поля во время операции, стерильные драпировка находится над мышью, оставляя только операционного поля подвергаются.
- Набор стерильных перчаток используется для каждой отдельной мыши.
Часть 3: Лигирование Поперечная аорты
- Частичное торакотомии на второй ребра проводится под хирургический микроскоп и грудины отказался от использования груди втягивающего устройства.
- Изобразительное наконечник 45 ° угловой щипцов используются, чтобы мягко отдельных вилочковой железы и жировой ткани от дуги аорты.
- После выявления поперечных аорты, небольшой кусочек шелка 6,0 шва помещается между безымянным и левой сонной артерии (рис. 1).
- Две свободные узлы связаны вокруг поперечной аорты и небольшой кусочек 27 ½ калибр тупой иглой, расположенный параллельно поперечной аорты. Первый узел быстро связали с иглой, а затем второй и иглы оперативно удалены, чтобы выход сужение 0,4 мм в диаметре. У мышей мнимого контроля, вся процедура идентичны, за исключением перевязки аорты.
- Втягивающим груди удаляют, а отток вентилятор щипал от 2 секунды для повторного раздувать легкие.
- Грудная клетка закрыт с помощью 6,0 проленовой шва с прервано швом узор.
- Кожа закрыт с помощью 6,0 проленовой шва с непрерывным швом узор.
Часть 4: послеоперационной реабилитации
- Для послеоперационного обезболивания, мыши вводили бупренорфин (0,1 мг / кг) внутрибрюшинно. Если Есть признаки обезвоживания после операции, стерильного физиологического раствора дается внутрибрюшинно.
- Анестезия постепенно снижен до выключенном положении и эндотрахеальной трубки удаляются, когда признаки спонтанного дыхания происходит.
- Мышь перемещается в положении лежа и позволил восстановить на грелку.
Часть 5: Подтверждение успешного Лигирование Поперечная аорты
- Через неделю после TAC, мышь снова под наркозом, чтобы определить степень давления перегрузки индуцированных перевязки поперечных аорты. Как описано выше, анестезия поддерживается на уровне 1,5-2% изофлуран с 0,5 - 1,0 л / мин 100% O 2 и температура тела поддерживается на уровне 37 ° C ± 1 ° C.
- 20 МГц доплеровский зонд находится на левой и правой стороны шеи на угол 45 ° для обнаружения скорости потока. Компьютерные доплеровского сигнальный процессор (Инд инструменты, Хьюстон, Техас) был использован для отображения и хранения доплеровский сигналов. 5
- В зависимости от степени давления перегрузки, необходимые для экспериментального протокола, только мыши с правой сонной (RC) / левой сонной (LC) поток соотношение в пределах определенного диапазона включены для дальнейшего анализа. Например, умеренная степень давления приводит к перегрузке Отношение 5-8, в то время как жесткие сужение в результате чего тяжелые перегрузки давления приводит тО. А. Отношение 8-10 (рис. 5.3а). Животных Шама (работает, но не лигируют), однако, ожидается, что отношение ~ 1 (рис. 5.3B).
6: Представитель Результаты
Типичных хирургических выживаемость после TAC в мышей дикого типа составляет около 80-90%. Успешное хирургическое лигирование поперечной аорты приведет к доплеровской скорости потока соотношение между правой и левой сонной артерии (RC / LC) в 5-10 (рис. 1). По сравнению с ложнооперированных мышей (рис. 2А), мышей с давлением перегрузки, как ожидается, разработка гипертрофии сердца в течение 1-2 недель, и сердечной дилатации через 6-8 недели, в зависимости от герметичности сужение (рис. 2В). Смертность в течение первого месяца после TAC, как правило, низкое (<20%) в мышей дикого типа, хотя генетически модифицированных мышей могут проявлять различные показатели выживаемости. 6,7
Рисунок 1. Подтверждение Поперечная Лигирование аорты использованием доплеровского измерения скорости. Представителю доплеровской скорости сигналов право (RC) и левой сонной (LC) артерий 6 дней после TAC. Эти записи демонстрируют успешное перевязки с RC / LC потоком отношение ~ 6.8. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Рисунок 2. Представитель Всего изображений сердца После TAC. . Шам управлением диких сердцем тип мыши. B. Дикие сердцем мыши тип 16 недель после TAC. Каждая строка = 1 мм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TAC, которая имитирует человеческий стеноз аорты, является распространенным способом, чтобы побудить гипертрофии сердца и сердечной недостаточности у мышей. Альтернативные места для сужения аорты включают восходящей и брюшной аорты. Восходящей аорты сужение обеспечивает экстремальный и более быстрое перегрузки левого желудочка (ЛЖ). В отличие от брюшной аорты сужение оставляет нетронутыми большая часть обращения как средства возможной компенсации. 8 Таким образом, TAC часто предпочтительной моделью, поскольку она обеспечивает адекватное перегрузки ЛЖ в зависимости от времени образом более склонны к расследованию. Хотя эта процедура может быть технически сложной, с практикой, мы добились выживаемость 80-90% в мышей дикого типа.
Герметичность поперечных сужение аорты определяет степень гипертрофии развития и сроки, в которые сердечная недостаточность и расширение развивается. Кроме того, возраст мышей влияет на скорость восстановления и кинетики развития сердца неудачи. Старые мышей (> 12-месячного возраста) требуется больше времени для разработки адаптивного ответа сонных артерий к TAC, и, скорее всего, развиваться дилатационной кардиомиопатией быстрее, чем молодых мышей (3-4 месяцев) 5.
Неинвазивная интубации мышей требует некоторой практики. Альтернативный метод заключается в следующем:
- Небольшой средней линии шейки надрез делается с тупыми ножницами и тканей отделен вокруг трахеи использованием изогнутых щипцов, чтобы разоблачить трахеи.
- Кусок шов, расположенных вокруг передних зубов и мягко оторвалась от тела животного расширить шею.
- Использование изогнутых щипцов в одной руке, язык мягко манипулировать в сторону.
- С другой стороны, интубация трахеи выполняется с помощью ПЭ трубы 90 скошенной по краю для облегчения въезда в страну.
Эндотрахеальной трубки затем подключается к Гарвардского объемно-циклическое грызунов вентилятор езда на велосипеде на 125-150 вдохов / мин и дыхательный объем 0,1-0.3ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
XHTW является WM Keck Фонд Уважаемые молодого ученого в области медицинских исследований, а также поддерживается NIH / NHLBI грантов R01-R01 и HL089598-R01HL091947 и мышечной дистрофии ассоциации грант № 69238. RJvO является получателем американской 2008-2010 физиологического общества Докторантура стипендий в Физиологические Genomics. Эта работа также при частичной финансовой поддержке Альянса Фонд Leducq для CaMKII сигнализации в сердце.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
- Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
- Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
- Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
- Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
- Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
