Summary
היצרות העורקים רוחבי (TAC) על העכבר הוא מודל ניסיוני נפוץ ללמוד המנגנונים היפרטרופיה לב ואי ספיקת לב הפיתוח. כאן אנו מתארים נהלים להתכווץ אבי העורקים כדי ליצור תואר לשחזור של היפרטרופיה לב בעכברים.
Abstract
היצרות העורקים רוחבי (TAC) על העכבר הוא מודל ניסיוני נפוץ ללחץ עומס יתר הנגרמת היפרטרופיה לב ואי ספיקת לב.
Protocol
חלק 1: הכנת שדה הפעלה
- השדה ההפעלה ולחטא עם אלכוהול איזופרופילי 75%.
- ודא את כרית החימום פועל בטמפרטורה הנכונה. המערכת המומלצת היא משאבת מים Gaymar במחזור מחובר כרית טיפול זה נשמר ב 37 ° C ± 1 ° C. חשוב לשמור על חום גוף תקין במהלך הניתוח כדי למנוע ירידה מהירה בקצב הלב.
- כלים כירורגיים הם מעוקרים מעקר חרוז חם לפני הניתוח. עבור הליך זה, תזדקק מכשירי ניתוח הבאים: מספריים קהים, מעוקל כמובן מלקחיים X 2, קנס 45 ° מלקחיים זווית X 2, מספריים באביב זוויתי, מפשק החזה, בעל מחט.
- Applicators כותנה צריך להיות על היד במקרה של דימום.
חלק 2: הכנה אינטובציה של עכברים
- עכברים מורדמים בתא אינדוקציה עם 2% isoflurane מעורבב עם 0.5 -1.0 L / min 100% O 2.
- קוצץ שיער משמשים לגלח את הפרווה מן הצוואר עד גובה החזה באמצע.
- העכבר ממוקם בתנוחה אופקית על גבי כרית חימום על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף.
- גומייה מונחת על השיניים הקדמיות של החיה להאריך את הצוואר. בעזרת מלקחיים מעוקל ביד אחת, הלשון היא מניפולציה בעדינות הצידה. עם זאת, אינטובציה endotracheal מבוצע באמצעות צינורות PE 90. הצינורית מחוברת endotracheal מכן אופניים נפח באופניים מכרסם הרווארד ההנשמה ב 125-150 נשימות / דקה נפח אדיר של 0.1-0.3ml. במהלך ההליך הכירורגי, הרדמה נשמר 1.5-2% isoflurane עם 0.5-1.0 L / min 100% O 2. נכון ברמה של הרדמה מאומת על ידי הפעלת לחץ על המיטה עכבר מסמר (הבוהן קמצוץ רפלקס).
- בתחום כירורגית ולחטא עם פתרון בבטאדין ואחריו אלכוהול 70%. הליך זה חוזר על עצמו שלוש פעמים.
- כדי למנוע זיהום של שדה כירורגי במהלך המבצע, לעטוף סטרילית מושם על העכבר ומשאיר רק את שדה הניתוח נחשף.
- סט של כפפות סטריליות משמש עכבר בנפרד.
חלק 3: קשירת של האאורטה רוחבי
- פתיחת בית החזה חלקי הצלע השנייה מבוצעת תחת מיקרוסקופ ניתוחי עצם החזה חזר בו באמצעות מפשק החזה.
- טיפ פיין 45 ° זווית מלקחיים המשמשים בעדינות להפריד את רקמת בלוטת התימוס ושומן מן קשת אבי העורקים.
- בעקבות זיהוי של האאורטה רוחבי, חתיכה קטנה של תפר 6.0 משי ממוקם בין עורקי הראש innominate ושמאל (איור 1).
- שני קשרים רופפים קשורות סביב האאורטה רוחבי פיסה קטנה של 27 ½ מחט קהה מד ממוקם במקביל האאורטה רוחבי. הקשר הראשון קשור במהירות נגד מחט, ואחריו השני המחט להסיר מיד כדי להניב צמצום של 0.4mm קוטר. בעכברים דמה השליטה, ההליך כולו הוא זהה, למעט קשירת של האאורטה.
- מפשק חזה מוסר לבין יצוא של מהמנשים צבט למשך 2 שניות מחדש לנפח את הריאות.
- כלוב הצלעות נסגר באמצעות תפרים 6.0 prolene עם דפוס תפר קטע.
- העור הוא נסגר באמצעות תפרים 6.0 prolene עם דפוס תפר מתמשך.
חלק 4: לאחר ניתוח שחזור
- עבור כאבים שלאחר הניתוח, העכבר מוזרק עם עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally. אם יש סימנים של התייבשות לאחר הניתוח, תמיסת מלח סטרילית ניתנת intraperitoneally.
- הרדמה היא הורידה בהדרגה למצב כבוי ואת הצינור endotracheal מוסר כאשר סימנים של נשימה ספונטנית להתרחש.
- העכבר הוא עבר לתפקיד המועדים ואיפשר להתאושש על כרית חימום.
חלק 5: אישור של קשירת מוצלח של האאורטה רוחבי
- שבוע לאחר TAC, העכבר מחדש מרדים כדי לקבוע את מידת עומס יתר לחץ המושרה על ידי קשירת של האאורטה רוחבי. כפי שתואר לעיל, הרדמה נשמר 1.5-2% isoflurane עם 0.5-1.0 L / min 100% O 2 ו - טמפרטורת הגוף נשמר על 37 ° C ± 1 ° C.
- 20 MHz דופלר בדיקה מושם על הצדדים על ימין ועל שמאל של הצוואר ב 45 ° זווית לזהות מהירויות הזרימה. מחשב מבוסס מעבד אות דופלר (האינדוס מכשירים, ביוסטון, טקסס) שימש כדי להציג ולאחסן אותות דופלר. 5
- בהתאם למידת העומס הלחץ הנדרש עבור פרוטוקול הניסוי, עכברים רק עם הראש ימינה (RC) / שמאל התרדמה (LC) יחס תזרים בטווח מסוים נכללות לניתוח נוסף. לדוגמה, מידה מתונה של עומס יתר לחץ מוביל ביחס של 5-8, בעוד ההתכווצות הדוקה וכתוצאה מכך עומס יתר לחץ חמור מוביל toa יחס של 10/08 (איור 5.3A). חיה דמה (אך לא פעלה ligated), לעומת זאת, צפויה להיות יחס של ~ 1 (איור 5.3B).
6: תוצאות נציג
הישרדות כירורגית טיפוסי הבאים TAC ב wild-type עכברים הוא כ 80-90%. קשירת כירורגי מוצלח של האאורטה רוחבי תוביל יחס מהירות זרימת דופלר בין העורק הראשי על ימין ועל שמאל (RC / LC) של 50-10 (איור 1). בהשוואה דמה פעולה עכברים (איור 2 א), בעכברים עם עומס הלחץ צפויים לפתח היפרטרופיה לב בתוך 1-2 שבועות, התרחבות הלב אחרי שבוע 6-8, בהתאם אטימות של התכווצות (איור 2B). התמותה בחודש הראשון לאחר TAC היא נמוכה בדרך כלל (<20%) ב wild-type עכברים, אם כי שונה גנטית עכברים עשוי להפגין שיעורי ההישרדות שונים. 6,7
באיור 1. אישור של קשירת העורקים רוחבי באמצעות מדידת מהירות דופלר. הנציג אותות דופלר מהירות של הימין (RC) והשאיר התרדמה (LC) בעורקים 6 ימים שלאחר TAC. הקלטות אלה להפגין קשירת מוצלח עם יחס RC / LC זרימה של ~ 6.8. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
איור 2. נציג Heart תמונות שלמות בעקבות TAC. ב. שאם המופעלים לב פראי סוג העכבר.. לב פראי עכבר מסוג 16 שבועות לאחר TAC. כל שורה = 1mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TAC, אשר מחקה היצרות מסתם אאורטלי האדם, היא שיטה נפוצה כדי לגרום היפרטרופיה לב ואי ספיקת לב בעכברים. אתרים חלופיים התכווצות העורקים כוללים את אבי העורקים העולה ואת הבטן. עולה התכווצות העורקים מהווה עומס יתר קיצונית ומהירה יותר על החדר השמאלי (LV). לעומת זאת, התכווצות אבי העורקים הבטני משאיר חלק שלם גדול יותר של מחזור כאמצעי פיצוי אפשרי. 8 לפיכך, היא לעתים קרובות TAC המודל המועדף כפי שהיא מספקת עבור עומס LV נאותה באופן תלוי זמן נוח יותר לחקירה. אמנם הליך זה יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית, עם תרגול, השגנו שיעור הישרדות של 80-90% אצל עכברים מסוג בר.
אטימות של התכווצות העורקים רוחבי קובעת את מידת ההתפתחות היפרטרופיה ואת מסגרת הזמן שבה כשל התרחבות הלב ומפתח. יתר על כן, את גילו של העכברים משפיעה על קצב ההתאוששות קינטיקה של התפתחות אי ספיקת לב. עכברים מבוגרים (> 12 חודשים של גיל) לוקח יותר זמן לפתח תגובה אדפטיבית של עורקי הראש כדי TAC, ועשויים לפתח cardiomyopathy מורחבים יותר מהר מאשר עכברים צעירים (3-4 חודשים גיל) 5.
לא פולשני אינטובציה של עכברים לוקח חלק באימון. שיטה חלופית היא כדלקמן:
- חתך קטן בצוואר הרחם קו האמצע הוא עשה עם מספריים בוטה מופרדות רקמות סביב קנה הנשימה באמצעות מלקחיים מעוקל על מנת לחשוף את קנה הנשימה.
- חתיכה של תפר ממוקם סביב השיניים הקדמיות בעדינות התרחקה הגוף של החיה להאריך את הצוואר.
- בעזרת מלקחיים מעוקל ביד אחת, הלשון היא מניפולציה בעדינות הצידה.
- עם זאת, אינטובציה endotracheal מבוצע באמצעות PE 90 צינורות משופעים על קצה על מנת להקל על הכניסה.
הצינורית מחוברת endotracheal מכן אופניים נפח באופניים מכרסם הרווארד ההנשמה ב 125-150 נשימות / דקה נפח אדיר של 0.1-0.3ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
XHTW הוא WM Keck קרן מלומד נכבד צעירים למחקר רפואי, והוא נתמך גם על ידי NIH / NHLBI מענקים R01-R01 HL089598 ו-R01HL091947, ניוון שרירים ו האגודה להעניק # 69238. RJvO הוא מקבל המלגה האגודה האמריקאית 2008-2010 פיזיולוגיים דוקטורט Genomics פיזיולוגיים. עבודה זו נתמכת גם על ידי בנות הברית מגט Leducq עבור CaMKII איתות בלב בחלקו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gaymar T/pump | Harvard Apparatus | Model TP-500 | Circulating water pump |
| Temp. therapy pads | Harvard Apparatus | 60-3414 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Blunt scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5980 | |
| Angled spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5668 | |
| Chest retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| Course curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5138 | |
| Dumont fine 45° angled forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Electric shaver | GE Healthcare | For shaving mouse fur | |
| PE 90 tubing | BD Biosciences | 427420 | For intubation |
| MiniVent (ventilator) | Harvard Apparatus | Type 845 | |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | May be purchased at medical supply store |
| Sterile gloves | Mckesson | 20-1565 | |
| Stereo microscope | Unico | ZM186 | |
| 6-0 silk suture | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| 27 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 6-0 prolene suture | Mckesson | 3286 | |
| Buprenorphine | Institutional Animal Facility |
References
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J. Jr, Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signaling pathways. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7, 589-600 (2006).
- Hartley, C. J., Reddy, A. K., Madala, S., Michael, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med. Biol. 34, 892-901 (2008).
- Reddy, A. K., Taffett, G. E., Li, Y. -H., Lim, S. -W., Pham, T. T., Pocius, J. S., Entman, M. L., Michael, L. H., Hartley, C. J. Doppler signal processing for use in mice: applications. IEEE Trans. Biomed. Eng. 52, 1771-1783 (2005).
- Li, Y. -H., Reddy, A. K., Ochoa, L. N., Pham, T. T., Hartley, C. J., Micheal, L. H., Entman, M. L., Taffett, G. E. Effect of age on peripheral vascular response to transverse aortic banding in mice. J. Gerontol. 58A, 895-899 (2003).
- Bourajjaj, M., Armand, A. S., Martins, daC. osta, Weijts, P. A., Nagel, B. V. ander, Heeneman, R., Wehrens, S., Windt, X. H. D. e, J, L. NFATc2 is a necessary mediator of calcineurin-dependent cardiac hypertrophy and heart failure. J. Biol. Chem. 28, 22295-22303 (2008).
- Oort, R. J. van, Respress, J. L., Li, N., Reynolds, C., Almeida, A. C. D. e, Skapura, D. G., Windt, L. J. D. e, Wehrens, X. H. Accelerated development of pressure overload induced cardiac hypertrophy and dysfunction in an RyR2-R176Q knockin mouse model. Hypertension. 55, (2010).
- Tarnavski, O., McMullen, J. R., Schinke, M., Nie, Q., Kong, S., Izumo, S. Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies. Physiol Genomics. 16, 349-360 (2004).
