Одноклеточная диссоциация caenorhabditis elegans: Метод изоляции живых клеток

Overview

Это видео описывает метод для разобщенности целых червей в одноклеточную подвеску, подходящую для FACS или иммунопреципиентации нетронутых клеток.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Германии и др., Изоляция конкретных популяций нейронов от Круглого червя Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Подготовка и сбор выдержанных червей для изоляции клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже объясняется изоляция холинергических нейронов от трансгенного unc-17::GFP штамма (OH13083), полученные из Центра генетики каенорхабдита (CGC) штамм репозиторий в Университете Миннесоты. Крайне важно поддерживать стерильные условия для предотвращения загрязнения от грибков или бактерий.

1. Подготовка и синхронизация червей с помощью метода отбеливания, как описано Т. Stiernagle. Для экспериментов по старению, пластины червей на нематод роста средней (NGM) пластин, содержащих 25 МК Водного раствора фтордоксиуридина (FuDR) для сокращения производства яиц и ареста инкубации яиц. Регулярно проверяй агарные пластины, чтобы предотвратить загрязнение или вылупление яиц, так как это приведет к ненадежным результатам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для unc-17::GFP клетки, как правило, три 100 мм х 15 мм NGM пластины используются для изоляции достаточного количества клеток, представляющих интерес.
2. Собирайте червей и подготовявая буферы для изоляции клеток.
   1. Соберите червей в конической трубке 15 мл. Вымойте червей из пластины с буфером 1,5 мл буфера M9 (1 мМ МгСО_4,85 мМ НаКл, 42_мМНа 2 HPO4'7H₂O, 22_{мМХ 2}PO, рН 7,0) и центрифуги на 5 мин при 1600 х г. Откажитесь от супернатанта и помойте червей 1 мл буфера M9. Повторите центрифугации и мыть в общей сложности пять раз, чтобы удалить как можно больше кишечной палочки загрязнения, как это возможно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков (50 мкг/мл), таких как ампициллин, на этом этапе может помочь уменьшить бактериальное загрязнение.
   2. Для двух образцов приготовьте 2 мл лиза-буфера натрия додекил сульфат-дитиотрейтол (SDS-DTT) лиза буфера: 200 мММ ДТТ, 0,25% (ж/в) SDS, 20 мМ HEPES (pH 8.0) и 3% (w/v) сахарозы.
   3. Подготовь 15 мл буфера изоляции (118 мМ. NaCl, 48 мм ККл, 2 мМ CaCl₂, 2 мм MgCl₂, 25 мМ HEPES (pH 7,3") и храните его на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом необходимо сделать еще более свежим буфер SDS-DTT и буфер изоляции.
3. Нарушение кутикулы и одноклеточная изоляция
   1. Центрифуга животных, собранных в шаге 1.2.1 за 5 мин при 1600 х г. Удалите все супернатанты и приостановите червей в 1 мл M9-средства массовой информации и перенесите на микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
   2. Пеллетные черви с центрифугой при 1600 х г в течение 5 мин.
   3. Добавьте 200 МКЛ буфера лиза SDS-DTT к червям и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Черви должны казаться "подмигнуть" вдоль тела, если рассматривать под легким микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие буфера лиза SDS-DTT может привести к гибели червей, за которыми можно следить, наблюдая за червями. Черви, которые мертвы будет удлинить и не будет локон.
   4. Добавьте 800 мкл ледяного буфера изоляции и смешайте, аккуратно щелкивая трубку.
   5. Пеллет червей в течение 1 мин при 13000 х г при 4 градусов по Цельсию, удалить супернатант и мыть с 1 мл буфера изоляции.
   6. Повторите шаг 1.3.5 в общей сложности пять раз, тщательно удаляя буфер изоляции каждый раз.
   7. Добавьте 100 л смеси протеазы из Streptomyces griseus (15 мг/мл)(Таблица материалов),растворенных в буфере изоляции, в гранулы и инкубировать в течение 10-15 мин в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с буфером лиза SDS-DTT, расширенное переваривание протеазы может привести к чрезмерному расщеплению белков вдоль плазменной мембраны, предотвращая изоляцию поверхности, подвергаемой воздействию GFP с помощью магнитных бусин.
   8. Во время инкубации с помощью протеазной смеси нанесите механические нарушения, прочинив образцы вверх и вниз по дну микроцентрифугной трубки 1,5 мл с наконечником микропипетта 200 мкл в 60–70 раз. Держите наконечник пипетки к стене микроцентрифуг трубки с постоянным давлением, чтобы правильно отмежеваться клеток.
   9. Чтобы определить стадию пищеварения, удалите небольшой объем (1–5 мл) смеси пищеварения, опустите его на стеклянную горку и осмотрите с помощью микроскопа культуры тканей. После 5-7 мин инкубации, фрагменты червя должны иметь заметно уменьшенную кутикулу и суспензии клеток будут легко видны.
   10. Остановите реакцию с 900 л коммерчески доступной холодной среды Лейбовица L-15, дополненной 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и пенициллин-стрептомицин (окончательная концентрация при пенициллине 50 U/mL и 50 мкг/мл стрептомицина).
   11. Пеллет изолированных фрагментов и клеток центрифугации в течение 5 мин при 10000 х г при 4 градусов по Цельсию. Вымойте гранулы клетки с 1 мл холодного L-15-дополненных средств массовой информации в два раза больше, чтобы убедиться, что избыток мусора и кутикулы удаляется.
   12. Повторное высасывка гранулы клеток в 1 мл L-15-дополненных средств массовой информации и оставить на льду в течение 30 мин. Возьмите верхний слой, примерно 700–800 мкл, в микроцентрифугную трубку. Этот слой содержит клетки без клеточного мусора и будет использоваться в последующей изоляции клеток, представляющих интерес.
   13. Следуя инструкциям производителя, используйте автоматизированный счетчик клеток или гемоцитометр для измерения плотности клеток в 10–25 мкл изолированных клеток.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010