Enkelt celle dissociation af Caenorhabditis elegans:En metode til at isolere levende celler

Overview

Denne video beskriver en metode til at adskille hele orme i en enkelt celle suspension egnet til FACS eller immunoprecipitation af intakte celler.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Tyskland et al, Isolation af specifikke neuronpopulationer fra Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Forberedelse og indsamling af lagrede orme til celleisolation

BEMÆRK: Forklaret nedenfor er isoleringen af cholinrgiske neuroner fra den transgene unc-17::GFP stamme (OH13083) opnået fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) stamme repository ved University of Minnesota. Det er bydende nødvendigt at opretholde sterile forhold for at forhindre forurening fra svampe eller bakterier.

1. Forbered og synkroniser orme ved hjælp af blegningsmetoden som beskrevet af T. Stiernagle. Til aldrende forsøg, plade orme på nematode vækst medium (NGM) plader, der indeholder 25 μM vandopløsning af fluordeoxyuridin (FuDR) for at reducere ægproduktionen og arrestere æg ruge. Undersøg agarplader regelmæssigt for at forhindre forurening eller ægudklækning, da dette vil medføre upålidelige resultater.
   BEMÆRK: For unc-17::GFP-celler bruges typisk tre 100 mm x 15 mm NGM-plader til at isolere en tilstrækkelig mængde celler af interesse.
2. Saml orme, og forbered buffere til celleisolation.
   1. Saml orme i et 15 mL konisk rør. Orme vaskes fra plade med 1,5 mL M9 buffer (1 mM MgSO_4,85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7,0) og centrifuge i 5 min ved 1.600 x g. Kassér supernatant og vask orme med 1 mL M9 buffer. Gentag centrifugering og vask i alt fem gange for at fjerne så meget E. coli forurening som muligt.
      BEMÆRK: Tilsætning af antibiotika (50 μg/mL), såsom ampicillin, på dette trin kan bidrage til at reducere bakteriel forurening.
   2. For to prøver fremstilles 2 mL natrium dodecyl sulfat-dithiothreitol (SDS-DTT) lysis buffer: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) og 3% (w/v) saccharose.
   3. Forbered 15 mL isolationsbuffer (118 mM NaCl, 48 mMM KCl, 2 mM CaCl_2,2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) og opbevar det på is.
      BEMÆRK: Både SDS-DTT lysis buffer og isolationsbuffer skal gøres friske før hvert eksperiment.
3. Afbrydelse af neglebånd og isolation af en enkelt celle
   1. Centrifugedyr opsamlet i trin 1.2.1 i 5 min ved 1.600 x g. Fjern alle supernatant og suspendere orme i 1 mL M9 medier og overføre til 1,5 mL mikrocentrifuge rør.
   2. Pellet orme med centrifugering ved 1.600 x g i 5 min.
   3. Der tilsættes 200 μL SDS-DTT lysis buffer til orme og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Orme skal synes at være "winkled" langs kroppen, hvis de ses under et let mikroskop.
      BEMÆRK: Langvarig udsættelse for SDS-DTT lysis buffer kan resultere i død af orme, som kan overvåges ved at observere orme. Orme, der er døde, vil forlænge og vil ikke krølle.
   4. Der tilsættes 800 μL iskold isolationsbuffer, og der blandes ved forsigtigt at svirpe røret.
   5. Pellet orme i 1 min ved 13.000 x g ved 4 °C, fjern supernatant og vask med 1 mL isolationsbuffer.
   6. Gentag trin 1.3.5 i alt fem gange, og fjern forsigtigt isolationsbufferen hver gang.
   7. Der tilsættes 100 μL proteaseblanding fra Streptomyces griseus (15 mg/mL)(Tabel over materialer)opløst i isolationsbuffer til pellet og inkuberes i 10−15 min ved RT.
      BEMÆRK: Som med SDS-DTT lysis bufferen kan den udvidede protease fordøjelse resultere i overdreven kavalergang af proteiner langs plasmamembranen, hvilket forhindrer isolering af overfladeeksponeret GFP via magnetiske perler.
   8. Under inkubation med proteaseblanding påføres mekanisk forstyrrelse ved at pipette prøver op og ned mod bunden af 1,5 mL mikrocentrifugerøret med en 200 μL mikropipettespids til ~60−70 gange. Hold pipettespidsen mod væggen i mikrocentrifugerøret med konstant tryk for at adskille celler korrekt.
   9. For at bestemme fordøjelsesstadiet skal du fjerne et lille volumen (~1−5 μL) af fordøjelsesblandingen, slippe det på et glasrutsjebane og inspicere det ved hjælp af et vævskulturmikroskop. Efter 5−7 minutters inkubation skal ormfragmenter have synligt reduceret kutikula, og en gylle af celler vil være let synlige.
   10. Standse reaktion med 900 μL kommercielt tilgængeligt koldt Leibovitz's L-15 medium suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) og penicillin-streptomycin (endelig koncentration ved 50 U/mL penicillin og 50 μg/mL streptomycin).
   11. Pellet isolerede fragmenter og celler ved centrifugering i 5 min ved 10.000 x g ved 4 °C. Vask de pelleterede celler med 1 mL koldt L-15-suppleret medie to gange mere for at sikre, at overskydende snavs og kutikula fjernes.
   12. Genbrugte pelleterede celler i 1 mL L-15-supplerede medier og lad det stå på is i 30 min. Tag det øverste lag, ca. 700−800 μL, til et mikrocentrifugerør. Dette lag indeholder celler uden cellerester og vil blive brugt i den efterfølgende isolering af celler af interesse.
   13. Efter fabrikantens anvisninger skal du bruge en automatiseret celletæller eller et hæmocytometer til at måle celletætheden på 10−25 μL isolerede celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010