Single Cell Dissociation av Caenorhabditis elegans: En metode for å isolere levende celler

Overview

Denne videoen beskriver en metode for å dissosiere hele ormer i en encellet suspensjon egnet for FACS eller immunoprecipitation av intakte celler.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Tyskland et al, Isolering av spesifikke nevronpopulasjoner fra Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Forberedelse og innsamling av eldre ormer for celleisolasjon

MERK: Forklart nedenfor er isolasjonen av kolinerge nevroner fra det transgene uk-17::GFP-stammen (OH13083) hentet fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) stammelager ved University of Minnesota. Det er viktig å opprettholde sterile forhold for å forhindre forurensning fra sopp eller bakterier.

1. Forbered og synkroniser ormer via blekemetoden som beskrevet av T. Stiernagle. For aldringsforsøk, plate ormer på nematode vekst medium (NGM) plater som inneholder 25 μM vannløsning av fluorodeoksyuridin (FuDR) for å redusere eggproduksjon og arrestere egg klekking. Inspiser agarplater regelmessig for å forhindre forurensning eller egg klekking, da dette vil føre til upålitelige resultater.
   MERK: For unc-17::GFP-celler brukes vanligvis tre 100 mm x 15 mm NGM-plater til å isolere tilstrekkelig mengde celler av interesse.
2. Samle ormer og klargjør buffere for celleisolasjon.
   1. Samle ormer i et 15 ml konisk rør. Vask ormer fra plate med 1,5 ml M9 buffer (1 mM MgSO₄, 85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7,0) og sentrifuge i 5 minutter ved 1600 x g. Kast supernatant og vask ormer med 1 ml M9 buffer. Gjenta sentrifugering og vask i totalt fem ganger for å fjerne så mye E. coli-forurensning som mulig.
      MERK: Tilsetning av antibiotika (50 μg/ml), som ampicillin, på dette trinnet kan bidra til å redusere bakteriell forurensning.
   2. For to prøver, lag 2 ml natrium dodecyl sulfat-dithiothreitol (SDS-DTT) lysisbuffer: 200 mM DTT, 0,25% (w / v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) og 3% (w / v) sukrose.
   3. Forbered 15 ml isolasjonsbuffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES [pH 7.3]) og oppbevar den på is.
      MERK: Både SDS-DTT lysisbufferen og isolasjonsbufferen må gjøres ferske før hvert eksperiment.
3. Cuticle forstyrrelser og enkeltcelle isolasjon
   1. Sentrifuge dyr samlet i trinn 1.2.1 i 5 min ved 1600 x g. Fjern alle supernatant og suspendere ormer i 1 ml M9-medier og overfør til 1,5 ml mikrosentrifugerør.
   2. Pellet ormer med sentrifugering på 1600 x g i 5 min.
   3. Tilsett 200 μL SDS-DTT lysis buffer til ormer og inkuber i 5 min ved romtemperatur (RT). Ormer skal se ut til å være "winkled" langs kroppen hvis de ses under et lett mikroskop.
      MERK: Langvarig eksponering for SDS-DTT lysis buffer kan føre til død av ormer, som kan overvåkes ved å observere ormer. Ormer som er døde vil forlenge og vil ikke krølle.
   4. Tilsett 800 μL iskald isolasjonsbuffer og bland ved å flikke forsiktig på røret.
   5. Pellet ormer i 1 min ved 13.000 x g ved 4 °C, fjern supernatant og vask med 1 ml isolasjonsbuffer.
   6. Gjenta trinn 1.3.5 for totalt fem ganger, og fjern isolasjonsbufferen forsiktig hver gang.
   7. Tilsett 100 μL proteaseblanding fra Streptomyces griseus (15 mg/ml) (Materialbord) oppløst i isolasjonsbuffer til pellets og inkuber i 10-15 min ved RT.
      MERK: Som med SDS-DTT lysisbufferen, kan den utvidede protease fordøyelsen resultere i overdreven spalting av proteiner langs plasmamembranen, og forhindrer isolering av overflate eksponert GFP via magnetiske perler.
   8. Under inkubasjon med proteaseblanding, påfør mekanisk forstyrrelse ved pipetteringsprøver opp og ned mot bunnen av det 1,5 ml mikrosenterrøret med en 200 μL mikropipettespiss i ~ 60-70 ganger. Hold pipettespissen mot veggen på mikrosenterrøret med konstant trykk for å fjerne tilknytningen av cellene på riktig måte.
   9. For å bestemme fordøyelsesstadiet, fjern et lite volum (~ 1-5 μL) av fordøyelsesblandingen, slipp den på et glasssklie og inspiser det ved hjelp av et vevskulturmikroskop. Etter 5-7 min inkubasjon skal ormefragmenter ha synlig redusert kutikkel og en slurry av celler vil være lett synlig.
   10. Stopp reaksjonen med 900 μL kommersielt tilgjengelig kald Leibovitz L-15 medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og penicillin-streptomycin (endelig konsentrasjon ved 50 U / ml penicillin og 50 μg / ml streptomycin).
   11. Pellet isolerte fragmenter og celler ved sentrifugering i 5 min ved 10.000 x g ved 4 °C. Vask de pelleterte cellene med 1 ml kaldt L-15-supplert medium to ganger til for å sikre at overflødig rusk og kutiklet fjernes.
   12. Resuspend pelleted celler i 1 ml L-15-supplert media og la på is i 30 min. Ta topplaget, ca. 700-800 μL, til et mikrosenterrør. Dette laget inneholder celler uten cellerester og vil bli brukt i etterfølgende isolasjon av celler av interesse.
   13. Følg produsentens instruksjoner, bruk en automatisert celleteller eller hemocytometer for å måle celletettheten på 10-25 μL isolerte celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010